BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THUÝ NGỌC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG ETHANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THUÝ NGỌC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG ETHANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. ThS. Nguyễn Văn Lâm 2. ThS. Nguyễn Tuấn Quang Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2014 Lời cảm ơn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới: ThS. Nguyễn Văn Lâm ThS. Nguyễn Tuấn Quang Là những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Phạm Thị Minh Huệ về những chỉ bảo và định hướng của cô cho đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này. Nhân đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong ban giám hiệu, các phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Phạm Thuý Ngọc Mục lục ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Về liposome 2 1.1.1. Khái niệm 2 1.1.2. Thành phần của liposome 2 1.1.2.1. Phospholipid 2 1.1.2.2. Cholesterol và dẫn chất 3 1.1.2.3. Dược chất và một số chất khác 5 1.1.3. Các phương pháp bào chế liposome 5 1.1.3.1. Phương pháp Batzri và Korn (phương pháp pha loãng ethanol) 5 1.1.3.2. Phương pháp hydrat hoá film 7 1.1.3.3. Phương pháp bốc hơi pha đảo 8 1.1.3.4. Một số phương pháp bào chế liposome khác: 8 1.2. Về amphotericin B 8 1.2.1. Công thức hoá học và tính chất lý hoá 8 1.2.2. Tác dụng dược lý, chỉ định, liều dùng 9 1.2.3. Một số chế phẩm chứa amphotericin B trên thị trường 10 1.3. Về liposome amphotericin B 12 1.3.1. Lịch sử phát triển liposome amphotericin B 12 1.3.2. Cơ chế và tác dụng của liposome amphotericin B 12 1.3.3. Một số nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B. 13 1.3.3.1. Một số nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B trên thế giới 13 1.3.3.2. Một số nghiên cứu bào chế liposome amphoteicin B tại Việt Nam 14 Chương 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 16 2.2. Nội dung nghiên cứu 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Phương pháp bào chế liposome amphoteiricin B 18 2.3.2. Phương pháp đánh giá liposome amphotericin B 18 Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QỦA VÀ BÀN LUẬN 21 3.1. Nghiên cứu lựa chọn một số thông số của quy trình bào chế 21 3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện hoà tan của amphotericin B 21 3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp cô đặc thể tích 23 3.1.2.1. Đánh giá đặc tính lipsome phụ thuộc vào quá trình lọc tiếp tuyến 23 3.1.2.2. Đánh giá hàm lượng amphotericin B tự do 25 3.2. Khảo sát ảnh hưởng một số thông số của quy trình bào chế tới đặc tính liposome 26 3.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nước 26 3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ phối hợp hai pha 29 3.2.3. Ảnh hưởng của lực khuấy trộn hai pha 30 3.3. Đề xuất quy trình bào chế liposome amphotericn B 32 3.3.1. Quy trình bào chế 32 3.3.2. Đánh giá đặc tính liposome amphotericin B sau bào chế 34 3.4. Bàn luận 35 3.4.1. Về phương pháp đánh giá 35 3.4.2. Về lựa chọn một số thông số của quy trình bào chế 35 3.4.3. Về khảo sát 1 số yếu tố ảnh hưởng tới quy trình bào chế 37 3.4.4. Về đặc tính liposome bào chế bằng phương pháp pha loãng ethanol 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt TT Viết tắt Từ/ cụm từ đầy đủ 1 ACN Acetonitril 2 AmB Amphotericin B 3 AUC Diện tích dưới đường cong 4 BHA Butylat hydroxyanisol 5 BHT Butylat hydroxytoluen 6 Chol Cholesterol 7 DMA N,N-dimethylacetamid 8 DMPC α-Dimyristoylphosphatidylcholin 9 DMPG l-α-Dimyristoylphosphatidylglycerol 10 DMSO Dimethyl sunfoxid 11 DOPC Dioleyl phosphatidylcholin 12 DOPE Dioleyl phosphatidylethanolamin 13 DPPC Dipalmitoyl phosphatidylcholin 14 DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differential scanning calorimetry) 15 DSPC Distearoylphophatidylcholin 16 DSPG Distearoylphosphatidylglycerol 17 EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid 18 HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography) 19 HSPC Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated soy phosphatidylcholin) 20 IC50 Nồng độ thuốc ức chế 50% đối tượng thử (50 % inhibitory concentrations) 21 KTTP Kích thước tiểu phân 22 L-AmB Liposome amphotericin B 23 LD50 Liều gây chêt trung bình 24 LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp 25 L o Trạng thái tinh thể lỏng sắp xếp một cách có trật tự 26 LTT Lọc tiếp tuyến 27 N/D Nước/dầu 28 NMR Chụp cộng hưởng từ hạt nhân 29 NSX Nhà sản xuất 30 PC Phosphotidylcholin 31 PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index) 32 PE Phosphatidylethanolamin 33 PG Phosphatidylglycerol 34 PS Phosphotidylserin 35 SEM Kính hiển vi điển tử quét ( Scanning electron microscope) 36 SPC Phosphatidylcholin đậu nành (Soy phosphatidylcholin) 37 T c Nhiệt độ chuyển dạng 38 TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscope) 39 TKHH Tinh khiết hóa học 40 TLC Sắc kí bản mỏng 41 USP United state Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ) 42 UV Tử ngoại 43 VLDL Lipoprotein tỷ trọng rất thấp 44 Z average Kích thước tiểu phân trung bình Danh mục các bảng Số hiệu Tên bảng biểu Trang Bảng 1.1 Một số biệt dược của amphotericin B 11 Bảng 2.1 Nguyên liệu 16 Bảng 3.1 Các điều kiện chuẩn bị pha ethanol 22 Bảng 3.2 Bảng công thức bào chế các mẫu liposome 24 Bảng 3.3 Đặc tính các mẫu liposome phụ thuộc vào quá trình lọc tiếp tuyến 24 Bảng 3.4 Bảng công thức bào chế các mẫu liposome có tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nước khác nhau 26 Bảng 3.5 Đặc tính các mẫu liposome phụ thuộc vào tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nước 27 Bảng 3.6 Đặc tính các mẫu liposome phụ thuộc vào nhiệt độ pha nước 29 Bảng 3.7 Đặc tính các mẫu liposome phụ thuộc vào lực phân tán hai pha 31 Bảng 3.8 Đặc tính các mẫu liposome sau bào chế 34 Danh mục các hình vẽ, đồ thị Số hiệu Tên hình vẽ Trang Hình 1 Sự phân bố của cholesterol và phospholipid trong lớp màng liposome 4 Hình 2 Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol 6 Hình 3 Công thức hoá học của amphotericin B 9 Hình 4 Chuẩn bị pha ethanol có và không sử dụng điều kiện hoà tan 22 Hình 5a Phân bố KTTP theo thể tích các công thức M8.33, M10.33, M15.33, M20.33 27 Hình 5b Phân bố KTTP theo thể tích các công thức M4.33, M6.33, M8.33 28 Hình 6 Sơ đồ tóm tắt các bước tiến hành quy trình 33 Hình 7 Ảnh chụp TEM của chế phẩm liposome AmB 34 [...]... Ti B mụn Bo ch i hc Dc H Ni ó cú cỏc nghiờn cu v liposome < /b> amphotericin < /b> B bng phng phỏp hydrat hoỏ phim v bc hi pha o phỏt huy u im, ng thi gii quyt mt s nhc im trong nghiờn cu trc, ti Nghiờn cu bo ch liposome < /b> amphotericin < /b> B bng phng phỏp pha loóng ethanol tin hnh nhm mc tiờu: + Bo ch c liposome < /b> amphotericin < /b> B bng phng phỏp pha loóng ethanol + Kho sỏt v ỏnh giỏ nh hng ca mt s yu t thuc v quy trỡnh bo... Chun b pha ethanol: Ho tan AmB, HSPC, cholesterol vo ethanol vi th tớch thớch hp - Phi hp hai pha: Tiờm pha ethanol vo pha nc, cú kim soỏt v ỏnh giỏ nh hng cỏc yu t: t l th tớch pha ethanol /pha nc, nhit pha nc, lc khuy trn hai pha - Cụ c: Loi bt dung mụi, loi AmB t do thu c 10ml hn dch liposome < /b> AmB - Bo qun: úng l, nỳt kớn, bo qun 2- 80C trỏnh ỏnh sỏng 2.3.2 Phng phỏp ỏnh giỏ liposome < /b> amphotericin < /b> B. .. B Cụng thc liposome < /b> amphotericin < /b> B Da theo ti liu tham kho, la chn cụng thc bo ch cho 10ml hn dch nh sau [26], [30]: Amphotericin < /b> B Hydrogenated soybean phosphatidylcholin (HSPC) Cholesterol Sucrose 50 mg 213 mg 52 mg 900 mg Dinatrisuccinat hexahydrat 27 mg Ethanol, DMA, nc va Quy trỡnh bo ch liposome < /b> amphotericin < /b> B Tin hnh quy trỡnh bo ch liposome < /b> AmB vi cỏc bc tin hnh nh sau: - Chun b pha nc: Ho... hiu qu ho tan AmB trong dung mụi, bo ch pha ethanol theo iu kin thụng thng v theo iu kin ó la chn, trỡnh by c th trong Bng 3.1 v Hỡnh 4 22 Bng 3.1: Cỏc iu kin chun b pha ethanol Chun b pha ethanol Chun b pha ethanol theo iu kin ó la theo iu kin thụng chn thng 50mg 50mg Dung dch phospholipid 2ml (pH 1-3) 2ml(pH 6-8) DMA: EtOH (1:1)(v/v) 2ml 0 0 2ml AmB EtOH A A Cú s dng iu kin ho tan B B Khụng s dng... nhit pha nc (60oC) v lc khuy trn hai pha 3900 vũng/phỳt bng mỏy ng nht hoỏ tc cao, thi gian phi hp lc phõn tỏn l 10 phỳt Theo dừi nh hng ca t l th tớch pha ethanol /pha nc ti c tớnh liposome < /b> Cỏc mu c bo ch l M4.33, M6.33, M8.33, M10.33, M15.33, M20.33 vi t l th tớch pha ethanol /pha nc l 4, 6, 8, 10, 15, 20/100 tng ng nh trong Bng 3.4 Bng 3.4 Bng cụng thc bo ch cỏc mu liposome < /b> cú t l th tớch pha ethanol /pha. .. 109 bnh nhõn phi tm thi ngng s dng ch phm liposome < /b> nhng sau ú ó tip tc iu tr thnh cụng trong khi 34-60% bnh nhõn s dng ch phm amphotericin < /b> B dng thuc quy c (AmBdeoxycholat) phi chu cỏc c tớnh i vi thn [5] Vi nhng u vit ca ch phm nờu trờn, ti ó la chn dng bo ch liposome < /b> nghiờn cu h vn chuyn thuc amphotericin < /b> B 1.3.3 Mt s nghiờn cu bo ch liposome < /b> amphotericin < /b> B 1.3.3.1 Mt s nghiờn cu bo ch liposome < /b> amphotericin.< /b> .. trỡnh bo ch n c tớnh liposome < /b> amphotericin < /b> B ỏnh giỏ nh hng n c tớnh KTTP, ng nht liposome,< /b> hiu sut quy trỡnh ca mt s yu t: t l th tớch pha ethanol /pha nc, nhit pha nc, tc khuy trn T ú xut ra quy trỡnh bo ch liposome < /b> AmB, ỏnh giỏ liposome < /b> sau bo ch vi cỏc thụng s: KTTP, ng nht hoỏ, hiu sut quy trỡnh, hỡnh thỏi cu trỳc 18 2.3 Phng phỏp nghiờn cu 2.3.1 Phng phỏp bo ch liposome < /b> amphoteiricin B Cụng... 4: Chun b pha ethanol cú v khụng s dng iu kin ho tan Kt qu hỡnh nh cho thy khi la chn iu kin ho tan thớch hp, 50mg AmB tan tt trong th tớch dung mụi nh (Hỡnh 4A) Khi chun b pha ethanol theo iu kin thụng thng, AmB khụng tan v lng cn rừ rt (Hỡnh 4B) 23 3.1.2 Nghiờn cu nh hng ca phng phỏp cụ c th tớch Sau khi bo ch mu qua cỏc giai on: chun b pha nc, chun b pha ethanol, phi hp hai pha s thu c liposome.< /b> .. 1.2.3 Mt s ch phm cha amphotericin < /b> B trờn th trng Mt s ch phm AmB ó c lu hnh trờn th trng v ng dng rng rói, giỳp kim soỏt tt tỡnh trng nhim nm ton thõn, c bit iu tr bi nhim bnh nhõn HIV-AIDs Cỏc tớnh cht ca ch phm c tng hp Bng 1.1 [19]: 11 Bng 1.1 Mt s bit dc ca amphotericin < /b> B Bit dc Fungizone Amphotec Abelcet AmBisome Dng a phc Dng chui Dng bo hp AmB vi phc hp cholesteryl AmB vi sulfat Lipid 1.1.3.1 Phng phỏp Batzri v Korn (phng phỏp pha loóng ethanol) Phng phỏp c Batzri v Korn mụ t nm 1973, cũn gi l phng phỏp pha loóng ethanol, hoc phng phỏp tiờm ethanol Trong cỏc phng phỏp bo ch liposome,< /b> phng phỏp pha loóng ethanol cú u im ni bt l to ra liposome < /b> kớch thc nh, tng i ng nht m khụng cn tri qua quỏ trỡnh siờu õm Quy trỡnh bo ch ca phng phỏp ny khỏ . trong nghiên cứu trước, đề tài Nghiên cứu b o chế liposome amphotericin B bằng phương pháp pha loãng ethanol tiến hành nhằm mục tiêu: + B o chế được liposome amphotericin B bằng phương pháp pha. Trang B ng 1.1 Một số biệt dược của amphotericin B 11 B ng 2.1 Nguyên liệu 16 B ng 3.1 Các điều kiện chuẩn b pha ethanol 22 B ng 3.2 B ng công thức b o chế các mẫu liposome 24 B ng. 1.3. Về liposome amphotericin B 12 1.3.1. Lịch sử phát triển liposome amphotericin B 12 1.3.2. Cơ chế và tác dụng của liposome amphotericin B 12 1.3.3. Một số nghiên cứu b o chế liposome amphotericin