ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.) đƣợc phân bố ở nhiều vùng trên nƣớc ta và đƣợc sử dụng nhiều trong YHCT Việt Nam, chủ yếu với tác dụng an thần. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, bên cạnh tác dụng an thần, một hƣớng ứng dụng khác có thể khai thác là tác dụng theo hƣớng điều trị hen phế quản của Xấu hổ. Các nghiên cứu ban đầu cho thấy dịch chiết nƣớc và dịch chiết cồn Xấu hổ với liều 5,6 gkg thể trọng chuột có tác dụng chống co thắt phế quản trên mô hình gây co thắt cơ trơn phế quản chuột lang bằng histamin. Xấu hổ còn có tác dụng chống viêm, làm giảm thâm nhiễm rõ rệt các tế bào viêm vào trong tổ chức phổi. Tuy nhiên việc sử dụng dƣợc liệu vẫn theo phƣơng pháp sắc hãm truyền thống gây khó khăn và tâm lý ngại sử dụng. Việc có thể tạo ra một dạng bào chế phù hợp có thể giúp phát triển hơn việc sử dụng Xấu hổ trong điều trị bệnh. Dạng cao đặc có thể là một bƣớc trung gian cho một chế phẩm bào chế khác. Vì vậy, để đảm bảo chất lƣợng, an toàn và hiệu quả sử dụng, dạng cao đặc này cần đƣợc đánh giá độc tính và đƣợc tiêu chuẩn hóa. Do vậy, đề tài “Xây dựng một số tiêu chuẩn định tính và đánh giá độc tính cấp của cao đặc Xấu hổ” đƣợc thực hiện với 2 mục tiêu sau: 1. Chiết xuất và xây dựng một số tiêu chuẩn định tính cao đặc Xấu hổ. 2. Đánh giá độc tính cấp của cao đặc Xấu hổ.
Trang 21 TS Nguyễn Quỳnh Chi
2 TS Phương Thiện Thương Nơi thực hiện:
1 Bộ môn Dược liệu
2 Bộ môn Dược lực
HÀ NỘI - 2014
Trang 3Tôi cũng xin được cảm ơn TS Nguyễn Hoàng Anh, TS Nguyễn Thùy Dương,
thầy cô đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm tại bộ môn Dược lực
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu và Bộ môn Dược lực đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể thầy cô giáo và cán bộ trong trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ và mang lại cho tôi những kiến thức cùng kinh nghiệm quý báu trong suốt 5 năm học vừa qua
Tôi xin trân trọng cảm ơn ban giám hiệu, phòng đào tạo và các phòng ban khác trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt chương trình học tại trường
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn và sự yêu thương tới gia đình, bạn bè, những người đã luôn ở bên và là chỗ dựa tinh thần cho tôi những lúc khó khăn trong học tập cũng như trong cuộc sống
Hà Nội, ngày 07 tháng 05 năm 2014
Sinh viên
Nguyễn Quang Chẩn
Trang 4DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN 2
1.1 Cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.) 2
1.1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái 2
1.1.2 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến 3
1.1.3 Thành phần hóa học của cây Xấu hổ Mimosa pudica L 3
1.1.4 Tác dụng dược lý của Xấu hổ Mimosa pudica L 6
1.1.5 Sử dụng loài Mimosa pudica L trong YHCT 12
CHƯƠNG 2-ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 13
2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 13
2.1.2 Các trang thiết bị nghiên cứu 14
2.2 Nội dung nghiên cứu 15
- Chiết xuất dạng cao đặc Xấu hổ 15
- Xây dựng tiêu chuẩn định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng cao đặc Xấu hổ 15
- Đánh giá độc tính cấp của cao đặc Xấu hổ 15
2.3 Phương pháp nghiên cứu 15
2.3.1 Chiết xuất dạng cao đặc Xấu hổ 15
Trang 5CHƯƠNG 3-THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19
3.1 Chiết xuất dạng cao đặc Xấu hổ 19
3.1.1 Chiết xuất 19
3.1.2 Xác định hàm ẩm và hàm lượng cao đặc thu được 19
3.2 Xây dựng tiêu chuẩn định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng cao đặc Xấu hổ 20
3.2.1 Định tính các nhóm hợp chất trong cao đặc thu được bằng các phản ứng hóa học 20
3.2.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 28
3.3 Kết quả đánh giá độc tính cấp của cao đặc Xấu hổ 34
3.4 Bàn luận 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Trang 6HMC-1 Human mast cell line-1
HPTLC High performance thin layer chromatography
IC50 Half maximal inhibitory concentration
IgE Immunoglobulin E
IL Interleukin
LD50 Lethal dose 50%
MCP Monocyte chemotactic protein
NP/PEG Natural product / Polyethylenglycol
Trang 8Hình Tên hình Trang
1.1 Công thức cấu tạo một số C - glycosyl flavonoid trong Xấu hổ 5 1.2 Công thức cấu tạo một số O - glycosyl flavonoid trong Xấu hổ 6 1.3 Công thức cấu tạo một số sterol trong Xấu hổ 6 2.1 Cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.) 13
3.1
Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng 3 mẫu cao đặc Xấu hổ quan sát ở
UV 254 nm (A), 366 nm (B) và sau khi hiện màu bằng thuốc
thử vanillin - acid sulfuric (C)
29
3.2 Mô tả sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng cao đặc Xấu hổ sau khi hiện
màu bằng thuốc thử vanillin - acid sulfuric (Hệ dung môi 1) 30
3.3
Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng 3 mẫu cao đặc Xấu hổ quan sát ở
UV 254 nm (A), 366 nm (B); sau khi hiện màu bằng thuốc thử
NP/PEG quan sát ở ánh sáng thường (C) và quan sát ở UV 366
nm (D)
32
3.4
Mô tả sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng cao đặc Xấu hổ sau khi hiện
màu bằng thuốc thử NP/PEG (Hệ dung môi 2) 33
Trang 9ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.) được phân bố ở nhiều vùng trên nước ta và
được sử dụng nhiều trong YHCT Việt Nam, chủ yếu với tác dụng an thần Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, bên cạnh tác dụng an thần, một hướng ứng dụng khác
có thể khai thác là tác dụng theo hướng điều trị hen phế quản của Xấu hổ
Các nghiên cứu ban đầu cho thấy dịch chiết nước và dịch chiết cồn Xấu hổ với liều 5,6 g/kg thể trọng chuột có tác dụng chống co thắt phế quản trên mô hình gây
co thắt cơ trơn phế quản chuột lang bằng histamin Xấu hổ còn có tác dụng chống viêm, làm giảm thâm nhiễm rõ rệt các tế bào viêm vào trong tổ chức phổi
Tuy nhiên việc sử dụng dược liệu vẫn theo phương pháp sắc hãm truyền thống gây khó khăn và tâm lý ngại sử dụng Việc có thể tạo ra một dạng bào chế phù hợp
có thể giúp phát triển hơn việc sử dụng Xấu hổ trong điều trị bệnh Dạng cao đặc có thể là một bước trung gian cho một chế phẩm bào chế khác Vì vậy, để đảm bảo chất lượng, an toàn và hiệu quả sử dụng, dạng cao đặc này cần được đánh giá độc tính và được tiêu chuẩn hóa
Do vậy, đề tài “Xây dựng một số tiêu chuẩn định tính và đánh giá độc tính
cấp của cao đặc Xấu hổ” được thực hiện với 2 mục tiêu sau:
1 Chiết xuất và xây dựng một số tiêu chuẩn định tính cao đặc Xấu hổ
2 Đánh giá độc tính cấp của cao đặc Xấu hổ
Trang 10CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.)
Xấu hổ còn có tên gọi khác ở Việt Nam là: cây trinh nữ, cây thẹn, hàm tu thảo, cây mắc cỡ [10]
Vị trí phân loại của cây Xấu hổ [5], [43]
Loài: Mimosa pudica L
1.1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái
Cây nhỏ, mọc hoang lòa xòa ở ven đường cái, thân có gai hình móc Lá 2 lần kép lông chim, nhưng cuống phụ xếp như hình chân vịt; khẽ động vào lá cụp xuống Cuống chung gầy, mang nhiều lông, dài 4cm, cuống phụ 2 đôi, có lông trắng cứng
Lá chét 15-20 đôi nhỏ, gần như không có cuống
Hoa màu tím đỏ, tụ thành hình đầu trái xoan Quả giáp dài 2cm, rộng 3mm, tụ thành hình ngôi sao, ở phần giữa các hạt quả hẹp lại, có lông cứng ở mép Hạt gần như hình trái xoan, dài 2mm, rộng 1,5mm [10] Cụm hoa mọc ở kẽ lá gồm rất nhiều hoa nhỏ xếp thành đầu tròn, màu tím hồng; đài nhỏ hình đấu; tràng 4 cánh dính nhau ở nửa dưới; nhị 4, rất mảnh, bầu 4 noãn
Mùa hoa quả: tháng 6-8
Trang 11Ở Việt Nam, Xấu hổ phân bố rải rác khắp nơi, từ đồng bằng đến miền núi có độ cao dưới 1000m [13]
1.1.2 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến
- Phần trên mặt đất, thu hái vào mùa hè khi cây đang phát triển xanh tốt, cắt lấy phần trên mặt đất, rửa sạch, phơi khô
- Rễ đào quanh năm rửa sạch, thái mỏng, phơi hay sấy khô [10], [13]
1.1.3 Thành phần hóa học của cây Xấu hổ Mimosa pudica L
1.1.3.1 Các hợp chất vô cơ
- Xấu hổ là loài có hàm lượng selen cao Hàm lượng selen có sự dao động lớn theo mùa và theo vùng thu hái Xấu hổ mọc ở các tỉnh khác nhau ở Việt Nam có hàm lượng selen khác nhau Hàm lượng selen trong một số mẫu thu hái ở Đà Nẵng là lớn nhất [3] Đặc biệt, nghiên cứu mẫu Xấu hổ thu hái ở Đồng Nai không cho thấy sự
- Alkaloid: Phần lớn các nghiên cứu đã phân lập được một alkaloid có tên là mimosin [13], [25]
- Chất béo, chất nhày: có mặt trong lá và hạt [13]
- Crocetin, crocetin dimethylester [13], α-tocoferol, lutein, betulaprenol - 9 [6], 1- triacontanol, phytol, diisooctyl phtalat [12]
- Liên quan đến chuyển động gập mở của lá Xấu hổ là 2 dẫn chất tubulin [29] (α và
β - tubulin, có tác dụng điều hòa chuyển động của lá) và hormon turgorin, dẫn chất
Trang 12của 4 - O - (β - D - glucopyranosyl - 6’ - sulfat) gallic là tác nhân làm cho lá hoạt động (gập mở) theo chu kỳ [13]
- Flavonoid: Một số flavonoid đã phân lập đƣợc:
OH OH
O OH OH
O HO
HO
O O
CH3OH
OH OH
O OH OH
OH
Trang 13O O
O OH
OH OH
H3C
O
OH OH
O OH
HO
O HO
OH OH HO
H3C
O HO
OH
O HO
Trang 14apigenin - 7 - O - β - D - glucosid
Hình 1.2 Công thức cấu tạo một số O - glycosyl flavonoid trong Xấu hổ
- Sterol: Một số phytosterol đã đƣợc phân lập từ Xấu hổ bao gồm: β-sitosterol, stigmastanol, D-galactosyl-β-sitosterol [12], stigmasterol [6] và α-spinasterol [31]
β-sitosterol α-spinasterol
stigmasterol stigmastanol
Hình 1.3 Công thức cấu tạo một số sterol trong Xấu hổ
1.1.4 Tác dụng dƣợc lý của Xấu hổ Mimosa pudica L
Trên thế giới, Xấu hổ đã đƣợc nghiên cứu với nhiều tác dụng sinh học khác nhau
O O
OH O
OH O
OH OH HO
HO
Trang 15 Tác dụng làm lành vết thương
Điều trị vết thương bằng thuốc mỡ chứa 2% (w/w) dịch chiết methanol và 2% (w/w) dịch chiết nước toàn phần cho thấy tác dụng làm lành vết thương đáng kể (P<0,001) Tác dụng làm lành vết thương có thể là do thành phần các chất phenol Hàm lượng phenol toàn phần trong dịch chiết methanol và dịch chiết nước toàn phần cây Xấu hổ được xác định lần lượt là 11% (w/w) và 17% (w/w) [23]
Tác dụng chống co giật
Nước sắc lá Xấu hổ tiêm màng bụng với liều 1-4g/kg có tác dụng bảo vệ chuột khỏi các cơn co giật gây ra bởi pentylentetrazol và strychnin nhưng không có tác dụng chống lại sự co giật gây ra bởi picrotoxin Nó cũng làm giảm những thay đổi đáp ứng gây ra bởi N-methyl-D-aspartat [32]
Tác dụng hạ đường huyết
Dịch chiết ethanol lá Xấu hổ uống liều 250 mg/kg làm giảm đáng kể đường huyết
ở cả chuột bình thường và chuột được gây đái tháo đường bằng alloxan [36]
Tác dụng kháng khuẩn
Dịch chiết ethanol Xấu hổ có tác dụng kháng khuẩn trên một số chủng vi khuẩn:
Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa Tuy nhiên,
tác dụng kháng khuẩn này kém hơn khi so sánh với ampicillin [18], [33]
Tác dụng giảm đau và chống viêm
Dịch chiết ethanol lá Xấu hổ liều 200 và 400 mg/kg có tác dụng chống viêm khi
ức chế đáng kể phù nề ở chân gây ra bởi carragenin và có tác dụng giảm đau trên
mô hình gây quặn đau bằng acid acetic Tác dụng này phụ thuộc vào liều [34], [39]
Tác dụng bảo vệ gan và lợi mật
Dịch chiết ethanol lá Xấu hổ được đánh giá tác dụng bảo vệ chống lại các tổn thương gan gây ra do CCl4 trên chuột Wistar Dịch chiết với liều 200 mg/kg dùng trong 14 ngày Tác dụng bảo vệ gan được đánh giá bằng các thông số như GOT,
Trang 16GPT, ALP, bilirubin và protein toàn phần, nồng độ malondialdehyd, hoạt tính của superoxide dismutase, nồng độ glutathion và catalase Kết quả cho thấy, mức cao đáng kể của GOT, GPT, ALP huyết tương và bilirubin toàn phần, tình trạng giảm nồng độ các enzym và các chất chống oxy hóa, tăng nồng độ lipid peroxid khi dùng CCl4 được khôi phục về gần mức bình thường khi sử dụng dịch chiết Xấu hổ [30]
Tác dụng chống nọc độc rắn
Dịch chiết nước rễ Xấu hổ có tác dụng ức chế đáng kể khả năng gây chết người,
sự tạo phù, tiêu sợi huyết và xuất huyết gây ra bởi nọc độc rắn Naja naja và Bangarus caerulus [27]
Tác dụng trên chu kỳ rụng trứng
Dịch chiết methanol rễ Xấu hổ cho chuột uống với liều 300 mg/kg/ngày trong 20 ngày liên tiếp, có tác dụng kéo dài chu kỳ sinh sản với sự tăng lên đáng kể khoảng thời gian không giao phối và giảm số lần đẻ ở chuột bạch Số lượng các lần đẻ tăng lên trong giai đoạn sau điều trị Phân tích các hormon liên quan đến sự điều tiết chu
kỳ sinh sản cho thấy dịch chiết rễ có tác dụng ức chế giải phóng gonadotropin và bài tiết estradiol [21]
Tác dụng chống oxy hóa
Dịch chiết methanol phần trên mặt đất cây Xấu hổ cho thấy tác dụng chống oxy
hóa trên in vitro khi sử dụng thử nghiệm dọn gốc tự do
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl-hydrate Dịch chiết này có tác dụng chống oxy hóa vừa phải (IC50 = 296.92μg/ml) khi so với acid ascorbic (IC50 = 131.29μg/ml) [18], [30]
Tác dụng chống sốt rét
Dịch chiết ethanol lá Xấu hổ được nghiên cứu tác dụng chống sốt rét trên chuột
nhiễm Plasmodium berghei và kết quả cho thấy dịch chiết này có tác dụng chống
sốt rét đáng kể ở cả 3 mô hình đánh giá Tác dụng này có thể liên quan đến các thành phần trong dịch chiết có tác dụng chống ký sinh trùng sốt rét như: terpenoid, flavonoid và alkaloid [14]
Trang 17 Tác dụng chữa giun sán
Các dịch chiết ether dầu hỏa, ethanol và nước của hạt Xấu hổ tại các nồng độ
khác nhau (100, 200, 500 mg/kg) được thử trên loài giun Pheretima posthuma, dùng
phương pháp kiểm nghiệm sinh học đánh giá tình trạng tê liệt và thời gian chết của giun Kết quả cho thấy dịch chiết cồn và dịch chiết nước có tác dụng đáng kể gây tê liệt và chết giun khi so sánh với albendazol [17]
Tác dụng chữa loét dạ dày
Khả năng chữa loét của dịch chiết methanol Xấu hổ đã được đánh giá trên các
mô hình chuột bị loét do aspirin, ethanol và thắt môn vị Dịch chiết này được cho uống ở 2 mức liều 100 và 200 mg/kg Kết quả cho thấy chúng có hiệu quả đáng kể trong việc bảo vệ niêm mạc dạ dày bị loét do dùng aspirin và ethanol, ở tất cả các mức liều nghiên cứu Tác dụng chống loét của dịch chiết Xấu hổ ở mô hình co thắt môn vị khá rõ khi có sự giảm đáng kể lượng dịch vị, acid tự do, acid toàn phần, giảm loét và tăng pH của dịch dạ dày [19]
Tác dụng hạ lipid máu
Dịch chiết chloroform lá Xấu hổ có tác dụng hạ lipid máu trên mô hình gây xơ vữa động mạch bằng chống lại chế độ ăn ở chuột bạch Wistar, làm giảm đáng kể nồng độ cholesterol, triglyceride, LDL, VLDL huyết tương và tăng nồng độ HDL tương đương với atorvastatin [35]
Tác dụng chữa tiêu chảy
Dịch chiết ethanol lá Xấu hổ có tác dụng chống tiêu chảy gây ra bởi dầu thầu dầu, ức chế tăng chất lỏng và chất điện giải trong lòng ruột gây ra do PGE2 và làm
giảm nhu động ruột sau khi dùng “charcoal meal” (0.2 ml hỗn dịch 4% than hoạt
trong dung dịch CMC 2%) Tác dụng này có thể liên quan đến các thành phần có trong dịch chiết như tanin và flavonoid [37]
Tác dụng giải lo âu
Trang 18Ở Cameroon, Xấu hổ được dùng trong dân gian để chữa đau đầu, mất ngủ và một
số bệnh lo âu khác [15] Nghiên cứu trước đây của nhóm chúng tôi cho thấy, dịch
chiết nước toàn phần của M pudica L ở cả hai mức liều nghiên cứu (2,4 g/kg và
4,8 g/kg) đều thể hiện tác dụng giải lo âu và tác dụng này tương đương với tác dụng của diazepam (liều 2 mg/kg) (p > 0,05) [2]
Tác dụng ức chế thần kinh trung ương
Một số kết quả nghiên cứu chứng minh kinh nghiệm trong nhân dân dùng cây Xấu hổ chữa mất ngủ Cao toàn cây Xấu hổ có tác dụng kéo dài thời gian ngủ do thuốc ngủ barbituric như hexanbarbital và cả meprobamat [13]
Nghiên cứu trên thế giới [20]
Dịch chiết ethanol 800 cây Xấu hổ có các tác dụng sau:
- Ức chế sự di chuyển của tế bào HMC-1
Sự thâm nhập của tế bào là giai đoạn quan trọng gây phản ứng viêm Kết quả cho thấy sau khi dùng dịch chiết Xấu hổ 10μg/mL trong 1h, sự xâm nhập của tế bào
HMC-1 đã giảm đáng kể
- Làm giảm sự giải phóng MCP-1 và IL-6 do HDM trong tế bào EoL-1
Trang 19HDM là một tác nhân gây dị ứng ở bệnh nhân hen phế quản và làm tăng nồng độ cytokin từ các tế bào khác nhau Để xác định nồng độ cytokin liên quan tới hen phế quản, tế bào EoL-1 được xử lý sơ bộ bằng dịch chiết Xấu hổ trong 1h và sau đó được dùng HDM 1μg/mL trong 24h Kết quả cho thấy dịch chiết Xấu hổ ức chế đáng kể sự tăng nồng độ MCP-1 và IL-6 bởi HDM
- Ức chế sự thâm nhiễm của bạch cầu vào đường hô hấp
- Làm biến đổi thành phần tế bào trong viêm đường hô hấp
Dịch chiết Xấu hổ làm giảm đáng kể số lượng tế bào bạch cầu ưa acid và tăng tỷ
lệ đại thực bào phế nang so với nhóm hen phế quản
Để kiểm tra liệu sự giảm tế bào bạch cầu ưa acid bởi Xấu hổ có liên quan tới
IL-5 (tác nhân kích thích tế bào bạch cầu ưa acid), nồng độ IL-IL-5 được đánh giá trong dịch rửa khí quản phổi Kết quả là Xấu hổ làm giảm đáng kể IL-5 ở chuột hen phế quản, cho thấy tác dụng ức chế tế bào bạch cầu ưa acid liên quan đến sự điều hòa giải phóng IL-5
- Làm giảm sự biến đổi mô bệnh học của mô phổi trong hen phế quản
Xấu hổ làm giảm sự thâm nhiễm của bạch cầu và giảm tiết chất nhày ở mô phổi hen phế quản, tác dụng này phụ thuộc liều dùng
- Làm giảm giải phóng kháng thể IgE đặc hiệu kháng OVA trong huyết tương và dịch rửa khí quản phổi, tác dụng này phụ thuộc vào liều
Nghiên cứu ở Việt Nam
- Tác dụng chữa hen phế quản:
Các kết quả nghiên cứu trước đây của nhóm chúng tôi cho thấy: dịch chiết nước
và dịch chiết cồn cây Xấu hổ (với liều tương đương 5,6 g/kg tính theo dược liệu khô) đều có tác dụng ức chế mạnh đáp ứng co thắt phế quản gây ra bởi histamin Tác dụng này tương đương diphenhydramine (liều 2 mg/kg) và aminophylline (liều
6 mg/kg) [7]
Trang 20Trong các phân đoạn, phân đoạn n-hexan từ dịch chiết nước cây Xấu hổ có tác dụng ức chế mạnh đáp ứng co thắt phế quản gây ra bởi histamin Tác dụng của phân đoạn này tương đương với tác dụng của dịch chiết nước [11]
- Tác dụng chống viêm:
Dich chiết nước Xấu hổ có tác dụng làm giảm rõ rệt trọng lượng phổi, làm giảm
số lượng bạch cầu ưa acid trong dịch rửa phế quản khi so với lô chứng bệnh trên mô hình gây viêm tại phổi do Sephacryl S-200, đưa các giá trị này về gần tương tự lô chứng thường
Dịch chiết nước Xấu hổ làm giảm thâm nhiễm rõ rệt các tế bào viêm vào trong tổ chức phổi, đặc biệt là số lượng bạch cầu ưa acid khi so sánh với lô chứng bệnh [1]
1.1.5 Sử dụng loài Mimosa pudica L trong YHCT
Theo YHCT, Xấu hổ có vị ngọt, se, tính hơi hàn, có ít độc, có tác dụng an thần, dịu cơn đau, long đờm, chống ho, hạ nhiệt, tiêu viêm, lợi tiểu [8]
Trên thế giới, Y học truyền thống của nhiều nước đã sử dụng Xấu hổ với nhiều tác dụng khác nhau: chống độc, giải độc gan, chữa lành vết thương, chống oxy hóa Toàn cây được dùng làm thuốc để điều trị các bệnh: vàng da, phong, tả, các bệnh về
âm đạo và tử cung, chống viêm, suy nhược, mệt mỏi, các bệnh về máu [38] Ở Cameroon, dịch chiết nước của loài này được sử dụng để điều trị trong trường hợp cấp và mạn tính các vấn đề liên quan đến bệnh đau đầu (chứng đau nửa đầu), mất ngủ và phổ biến hơn là chứng rối loạn lo âu [15] Ở Đôminica, nước hãm sắc của
Mắc cỡ (Xấu hổ) với Cỏ voi (Panicum maximum Jacquin) dùng để điều trị bệnh
phổi [8]
Ở nước ta, Xấu hổ thường dùng để điều trị: suy nhược thần kinh, mất ngủ, viêm phế quản, viêm kết mạc cấp, viêm gan, viêm ruột non, sỏi tiết niệu, phong thấp tê bại, huyết áp cao (không dùng cho phụ nữ có thai), dùng ngoài trị chấn thương, viêm mủ da, dùng tươi giã đắp Rễ cây cũng được dùng uống trị sốt rét, kinh nguyệt khó khăn, hen suyễn, dùng gây nôn Hạt dùng trị hen suyễn và gây nôn [8]
Trang 21CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu
* Mẫu nghiên cứu:
Bộ phận trên mặt đất của cây Xấu hổ được thu hái ở 3 vùng: Hà Nội (tại huyện
Từ Liêm, tháng 8/2013), Phú Thọ (tại huyện Lâm Thao, tháng 9/2013) và Thanh Hóa (tại TP Thanh Hóa, tháng 9/2013) Cả 3 mẫu nghiên cứu đều được giám định
tên khoa học là Mimosa pudica L., họ Đậu Fabaceae Tiêu bản được lưu trữ tại Bộ
môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội
Nguyên liệu sau khi làm sạch đem cắt nhỏ, phơi sấy khô, nghiền thành bột và được bảo quản trong túi nilon kín
Hình 2.1 Cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.)
* Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino giống cái khỏe mạnh được cung cấp bởi
Viện vệ sinh dịch tễ TW, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, khối lượng cơ thể 18 - 22 gam/cá thể Chuột được nuôi tại Bộ môn Dược lực - Trường Đại học Dược Hà Nội
Trang 22trong điều kiện thí nghiệm, cho ăn bằng thức ăn tổng hợp và uống nước sạch tự do; chiếu sáng 12/24h
2.1.2 Các trang thiết bị nghiên cứu
2.1.2.1 Hóa chất và dụng cụ
Hóa chất và thuốc thử trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích
- Hóa chất: amoniac, H2SO4, NaOH, HCl, natri sulfat khan…
- Dung môi hữu cơ: chloroform, ethanol, methanol, ethyl acetat, acid formic, toluene…
- Thuốc thử: Các thuốc thử dùng trong phản ứng định tính và thuốc thử hiện màu cho sắc ký lớp mỏng (vanillin - acid sulfuric, thuốc thử NP/PEG)
Cách pha thuốc thử NP/PEG: Pha 2 dung dịch:
Dung dịch 1% diphenylboryloxyethylamin trong methanol
Dung dịch 5% PEG 400 trong ethanol
Trộn 2 dung dịch theo tỷ lệ tương ứng 10 và 8 thu được thuốc thử NP/PEG
Cách pha thuốc thử vanillin - acid sulfuric: Pha 2 dung dịch:
Dung dịch vanillin 1% trong ethnol
Dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol
Trộn đồng thể tích 2 dung dịch thu được thuốc thử vanillin - acid sulfuric
- Chất đối chiếu: rutin (Viện kiểm nghiệm cung cấp), β - sitosterol
- Bản mỏng tráng sẵn HPTLC Silicagen 60 F254
- Dụng cụ: các dụng cụ thí nghiệm thường quy (bông, giấy lọc, ống nghiệm, bình nón, bình gạn, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, pipet…), dụng cụ chiết hồi lưu (bếp, bình cầu, ống sinh hàn…) và các dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm (mao quản, cốc chạy sắc ký…)
Trang 23- Các dụng cụ cho chuột uống thuốc: bơm, kim tiêm
2.1.2.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu
- Tủ sấy SHELLAB, tủ sấy MODEL UNB 500
- Cân phân tích Precisa
- Cân kỹ thuật Sartorius
- Máy cất quay Buchi ROTAVAPOR R-200
- Máy xác định hàm ẩm SARTORIUS
- Bếp đun cách thủy, bếp điện
- Hệ thống máy chấm sắc ký tự động Linomat V
- Buồng chụp sắc ký gắn máy ảnh Camag reprostar 3
- Máy ảnh Canon ISUS 115
- Máy vi tính với phần mềm VideoScan 1.01
2.2 Nội dung nghiên cứu
- Chiết xuất dạng cao đặc Xấu hổ
- Xây dựng tiêu chuẩn định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng cao đặc Xấu hổ
- Đánh giá độc tính cấp của cao đặc Xấu hổ
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Chiết xuất cao đặc Xấu hổ
Dược liệu được chiết hồi lưu với cồn 90% (2 lần, lần 1 trong 1h, lần 2 trong 45 phút) Gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được dịch chiết đậm đặc Tiếp tục bay hơi cách thủy đến dạng cao đặc có thể chất dẻo, dính Xác định hàm ẩm và khối lượng cao đặc thu được Mỗi mẫu được làm lặp lại 3 lần
Trang 24- Xác định hàm ẩm cao đặc: cân chính xác khoảng 1g cao đặc, đem sấy ở 1100C đến khối lượng không đổi, tính hàm ẩm (H %) theo công thức:
( ) Trong đó: a - khối lượng cao đặc trước khi sấy (gam)
b - khối lượng cao đặc sau khi sấy đến khối lượng không đổi (gam)
- Xác định hàm lượng cao đặc thu được tính theo dược liệu khô tuyệt đối:
Hàm lượng cao đặc thu được tính theo dược liệu khô tuyệt đối là:
( )
( ) ( ) Trong đó: m1 -khối lượng dược liệu (gam)
m- khối lượng cao đặc thu được (gam)
2.3.2.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp cho 2 nhóm chất kém phân cực và phân cực, khảo sát trên 3 mẫu dược liệu
- Đối với nhóm chất kém phân cực lựa chọn chất đối chiếu là β-sitosterol
- Đối với nhóm chất phân cực lựa chọn chất đối chiếu là rutin
Mẫu thử và mẫu đối chiếu được đưa lên bản mỏng nhờ hệ thống máy chấm sắc ký
tự động Linomat V Hình ảnh sắc ký đồ được xử lý trên phần mềm VideoScan 1.01
Trang 25So sánh các vết trên sắc ký đồ của 3 mẫu và so sánh với chất chuẩn Bước đầu đưa
ra hình ảnh “dấu vân tay” của cao đặc Xấu hổ
2.3.3 Đánh giá độc tính cấp của cao đặc Xấu hổ
2.3.3.1 Chuẩn bị mẫu thử:
* 700 gam dược liệu khô - mẫu Xấu hổ Mimosa pudica L thu hái tại Hà Nội (hàm
ẩm 11,78 %) đã tán nhỏ cho vào bình cầu, chiết hồi lưu bằng ethanol 90% trong 1h Sau 1h, lọc lấy dịch chiết Bã dược liệu được đem chiết tiếp lần 2 trong 45 phút Gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được dịch đậm đặc Tiếp tục đem bay hơi cách thủy thu được 68,51 g cao đặc (hàm ẩm 15,99 %)
* Chuẩn bị 3 mẫu thử:
- Dịch thuốc 1: cao đặc (1ml cao đặc tương đương 1,23 g cao đặc)
- Dịch thuốc 2: pha 20 g cao đặc thành 18 ml bằng nước nóng (nồng độ 1,11 g cao đặc/ml)
- Dịch thuốc 3: pha loãng 5ml dịch thuốc 2 thành 10 ml bằng nước nóng (nồng độ 0,56 g cao đặc/ml)
2.3.3.2 Phương pháp xác định độc tính cấp
Phương pháp xác định độc tính cấp theo Đỗ Trung Đàm [9]
Để chuột nhịn đói 2 giờ trước khi dùng thuốc Chuột được chia nhiều lô, mỗi lô
10 con Cho từng lô uống chế phẩm thử với liều tăng dần Thể tích chế phẩm thử cho uống tương ứng với 0,1ml/10g chuột
Theo dõi liên tục trong vòng 4-6 giờ sau khi uống thuốc và tiếp tục theo dõi trong
7 ngày các thông số sau:
- Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, phân, nước tiểu…
- Sự tiêu thụ thức ăn, nước uống
Trang 26- Tính tỷ lệ chuột chết ở các lô trong vòng 72h Khi có động vật chết, mổ để quan sát đại thể các cơ quan phủ tạng Nếu cần, làm thêm vi thể để xác định nguyên nhân
LD50 (nếu có) được tính bằng phương pháp Litchfield - Wilcoxon
Trang 27CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Chiết xuất cao đặc Xấu hổ
3.1.2 Xác định hàm ẩm và hàm lượng cao đặc thu được
Kết quả xác định hàm ẩm và hàm lượng cao đặc mỗi mẫu được trình bày trong bảng 3.2
Trang 28Bảng 3.2 Kết quả xác định hàm ẩm và hàm lƣợng cao đặc 3 mẫu dƣợc liệu:
Mẫu
m (g) X (%) H (%) m (g) X (%) H (%) m (g) X (%) H (%) Phú
Thọ 3,45 7,58 10,16 3,62 7,76 10,55 3,51 7,42 9,11
Hà
Nội 5,29 11,80 9,20 5,60 12,26 14,52 5,17 11,56 11,07 Thanh
Hóa 3,88 8,74 11,15 4,10 9,06 10,38 4,03 9,36 10,31
Trong đó: m- khối lƣợng cao đặc thu đƣợc (gam)
H - hàm ẩm cao đặc thu đƣợc (%)
X - hàm lƣợng cao đặc thu đƣợc tính theo dƣợc liệu khô tuyệt đối (%)
Nhận xét: Hàm lƣợng cao đặc thu đƣợc của 3 mẫu khác nhau Mẫu Hà Nội có hàm lƣợng cao nhất, mẫu Phú Thọ thấp nhất Hàm ẩm của các mẫu cao đặc Xấu hổ dao động từ 9% đến 15%
3.2 Xây dựng tiêu chuẩn định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng
