ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM CHU QUANG MẠNH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHÂN NHANH BÌNH VÔI TÍM (Stephania rotunda Lour) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2010 - 2014 Thái Nguyên, năm 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM CHU QUANG MẠNH Tền đề tài: NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHÂN NHANH BÌNH VÔI TÍM (Stephania rotunda Lour) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn: Th.S Nguyễn Thị Tình Khoa CNSH - CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2014 LỜI CẢM ƠN Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) bằng phương pháp in vitro”. Qua đây em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Nguyễn Thị Tình, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. Em xin gửi lời cảm ơn tới Ks. Lã Văn Hiền, Ks. Nguyễn Trúc Quỳnh đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Đồng thời, em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian học tập. Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên để em có tự tin trong học tập và nghiên cứu khoa học. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày 5 tháng 6 năm 2014 Sinh viên Chu Quang Mạnh DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ABA : Axit absisic ADN : Acid Deoxyribo Nucleic APG : Angiosperm Phylogeny Group BA : 6-Benzyladenin CT : Công thức CV : Coefficient of variation IAA : Indole-3 acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid NAA : a- Naphlene axetic acid Kinetin : 6-Furfurylaminopurine TDZ : Thidiazuron LSD : Least Significant Difference MS : Murashige & Skoog’s MT : Môi trường TN : Thí nghiệm Đ/C : Đối chứng B5 : Gamborg’s HSN : Hệ số nhân Cồn C 2 H 5 OH DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1: Kết quả ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) (sau 1 tuần theo dõi) 26 Bảng 4.2: Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng khoáng 1/2 MS, B5, MS, 2MS đến khả năng tái sinh chồi Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) (sau 3 tuần nuôi cấy) 28 Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ loại cytokinin (Kinetin, BA, TDZ) đến khả năng nhân nhanh chồi Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) (sau 4 tuần nuôi cấy) 30 Bảng 4.4: Kết quả ảnh hưởng nồng độ BA (0,5mg/l) kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) (sau 4 tuần nuôi cấy) 38 Bảng 4.5: Kết quả ảnh hưởng hàm lượng BA (0,5mg/l) kết hợp với IBA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) (sau 4 tuần nuôi cấy) 40 Bảng 4.6: Kết quả ảnh hưởng hàm lượng nồng độ BA (0,5mg/l) kết hợp với IAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) (sau 4 tuần nuôi cấy) 42 Bảng 4.7: Kết quả ảnh hưởng hàm lượng nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) (sau 4 tuần nuôi cấy) 45 Bảng 4.8. Kết quả ảnh hưởng hàm lượng IAA đến khả năng ra rễ của Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) (sau 5 tuần nuôi cấy) 47 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 4.1: Kết quả ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến hiệu quả tại vật liệu sạch (nấm, vi khuẩn), của mẫu Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) (sau 1 tuần nuôi cấy) 26 Hình 4.2: Biểu đồ kết quả ảnh hưởng của hàm lượng khoáng 1/2 MS, B5, MS, 2MS, đến khả năng tái sinh chồi Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) 28 (sau 4 tuần nuôi cấy) 28 Hình 4.3: Biểu đồ kết quả ảnh hưởng của nồng độ loại cytokinin (Kinetin, BA, TDZ) đến khả năng nhân nhanh chồi Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) (sau 4 tuần nuôi cấy) 35 Hình 4.4: Biểu đồ kết quả ảnh hưởng nồng độ BA (0,5mg/l) kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) (sau 4 tuần nuôi cấy) 39 Hình 4.5: Biểu đồ kết quả ảnh hưởng nồng độ BA (0,5mg/l) kết hợp với IBA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) (sau 4 tuần nuôi cấy) 41 Hình 4.6: Biểu đồ ảnh hưởng hàm lượng nồng độ BA (0,5mg/l) kết hợp với IAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) (sau 4 tuần nuôi cấy) 43 Hình 4.7:Biểu đồ kết quả ảnh hưởng hàm lượng nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) (sau 5 tuần theo dõi). 46 Hình 4.8: Biểu đồ kết quả ảnh hưởng hàm lượng IAA đến khả năng ra rễ của Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) (sau 5 tuần nuôi cấy) 48 MỤC LỤC PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích của đề tài 2 1.3. Yêu cầu của đề tài 2 1.4. Ý nghĩa của đề tài 2 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Giới thiệu chi Bình Vôi 3 2.1.1.Phân loại khoa học 3 2.1.2. Đặc điểm chung chi Bình Vôi 4 2.2. Tổng quan về cây Bình Vôi Tím 7 2.2.1. Đặc điểm hình thái 7 2.2.2. Đặc điểm sinh thái 7 2.2.3. Giá trị cây Bình Vôi Tím 7 2.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 9 2.3.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 9 2.3.2. Một số chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 2.3.3. Các điều kiện nuôi cấy 11 2.3.4. Các giai đoạn trong nhân giống in vitro 12 2.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước 13 2.4.1. Tình hình nghiên cứu Bình Vôi Tím trên thế giới 13 2.4.2. Tình hình nghiên cứu Bình Vôi Tím ở Việt Nam 14 PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 16 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 16 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 16 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu 16 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16 3.3. Hóa chất và thiết bị 16 3.3.1. Hóa chất 16 3.3.2. Thiết bị 17 3.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 17 3.4.1. Nội dung nghiên cứu 17 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu 17 PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 4.1. Kết quả ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến hiệu quả tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn của mẫu Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) 25 4.2. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng khoáng 1/2 MS, B5, MS, 2MS, đến khả năng tái sinh chồi Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) 27 4.3. Kết quả ảnh hưởng nồng độ loại cytokinin (Kinetin, BA, TDZ) đến khả năng nhân nhanh chồi Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) 29 4.4. Kết quả ảnh hưởng hàm lượng BA (0,5mg/l) kết hợp với nồng độ NAA, IBA và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) 37 4.5. Kết quả ảnh hưởng hàm lượng nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) 44 4.6. Kết quả ảnh hưởng hàm lượng IAA đến khả năng ra rễ của Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) 47 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 5.1. Kết luận 49 5.2. Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nguồn dược liệu Việt Nam rất phong phú và đa dạng, bao gồm động vật và thực vật. Trong đó, dược liệu từ cây cỏ đứng vị trí quan trọng về thành phần, chủng loại và giá trị sử dụng. Một số loại dược liệu có giá trị sử dụng lâu đời như Sâm Ngọc Linh, Bình Vôi Tím, cây Bảy lá một hoa, Sâm cau, Lan kim tuyến. Cây Bình Vôi Tím có tên khoa học Stephania rotunada Lour, họ Tiết dê menispermaceae [22]. Bình Vôi Tím có nguồn gốc ở miền đông và nam châu Á cũng như Australasia, là một loại cây thân dây leo, mọc bám vào vách đá, dưới gốc rễ hình thành củ. Vỏ củ màu nâu, dây màu tím phần thịt củ màu đỏ, nhựa dây cũng màu đỏ [30]. Cây Bình Vôi Tím được sử dụng làm thuốc an thần, gây ngủ, chữa nhức đầu, sốt nóng, đau dạ dày, ho nhiều đờm, hen suyễn, khó thở. Ngoài ra hoạt chất L-tetrahydropalmatin và roemerin trong cây Bình Vôi Tím được dùng làm thuốc bổ sức cho người lao lực, chữa đau tim, trị hen suyễn, lỵ amíp, suy nhược và rối loạn tâm thần [10], [31]. Với các ưu thế đó, Bình Vôi Tím đã rất được quan tâm và ưa chuộng. Tuy nhiên nguồn cây Bình Vôi Tím làm dược liệu hiện nay, chủ yếu được khai thác từ tự nhiên. Tốc độ khai thác ngày càng tăng hầu như không có kế hoạch tái sinh, do đó sự phân bố và số lượng cây Bình Vôi Tím trong tự nhiên ngày càng bị thu hẹp và khan hiếm. Mặt khác phương pháp nhân giống truyền thống cho hệ số nhân thấp, dễ bị thoái hóa không cung cấp đủ số lượng lớn cây giống. Phương pháp nhân giống in vitro trong thời gian ngắn cho số lượng lớn cây giống đảm bảo đồng nhất về mặt di truyền, hình thái và hoàn toàn sạch bệnh. Từ những lí do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài : “Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh nhanh Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) bằng phương pháp in vitro”. 2 1.2. Mục đích của đề tài Nghiên cứu về quy trình nhân nhanh giống cây Bình Vôi Tím từ đoạn thân non, bánh tẻ bằng phương pháp in vitro. 1.3. Yêu cầu của đề tài - Xác định được ảnh hưởng phương pháp khử trùng đến khả năng tạo nguồn vật liệu sạch nấm và vi khuẩn đưa vào nuôi cấy. - Xác định được ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đến khả năng tái sinh chồi cây Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour). - Xác định được các chất kích thích sinh trưởng và nước dừa tới khả năng nhân nhanh chồi Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour). - Xác định được ảnh hưởng của hàm lượng IAA đến khả năng ra rễ của chồi cây Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour). 1.4. Ý nghĩa của đề tài Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học - Kết quả nghiên cứu của đề tài đưa ra quy trình nhân nhanh giống cây Bình Vôi Tím bằng phương pháp in vitro phục vụ cho việc nhân giống cây dược liệu ở quy mô lớn. - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hoá lại kiến thức đã học vào nghiên cứu khoa học. - Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học. Ý nghĩa thực tiễn - Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống Bình Vôi Tím bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, để đảm bảo cung cấp số lượng lớn cây giống có chất lượng cao, đồng đều cho sản xuất. - Nhân nhanh cây giống với số lượng lớn - Bảo tồn được loại dược liệu quý. [...]... Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đến khả năng tái sinh chồi cây Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng các chất kích thích sinh trưởng và nước dừa tới khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng IAA đến khả năng ra rễ của chồi cây Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) 3.4.2 Phương pháp nghiên. .. tượng nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Cây Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) - Vật liệu nghiên cứu: Đoạn thân non, bánh tẻ cây Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu - Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu vào mẫu tạo vật liệu sạch (nấm, vi khuẩn), khả năng tái sinh, nhân nhanh và ra rễ cây Bình. .. alkaloid: isocorydin, tetrahydropalmatin, dicentrin, sinomenin, corytuberin, sinoacutin, dehydrodicentrin, isoboldin, dihydrosalutaridin và Nmetyllaurotetanin [10] Từ rễ củ loài S.cepharantha đã phân lập được alkaloid chính là cepharanthin và những alkaloid phụ khác: isotetrandin,berbamin, cepharanolin, cycleanin, stephanin, crebanin,o-nornuciferin, stesakin, palmatin, 6 cepharamin Trong rễ của loài... tetrahydropalmatin (0,2%), dicentrin (0,3%), sinomenin (0,1%), corytuberin (0,04%), sinoacutin (0,006%), dehydrodicentrin (0,006%), isoboldin (0,004%), dihydrosalutaridin (0,001%) và N-metyllaurotetanin (0,006%) Trong rễ củ loài S.kwangsiensis có: tetrahydropalmatin, capaurin, isocorydin, roemerin, dihydroromerin, dehydrostephanin, stephanin, dihydropalmatin và palmatin [10] Theo Bùi Thị Bằng (2006),... này, rễ mới được sinh ra và bắt đầu hình thành lá mới Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thường 2.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước 2.4.1 Tình hình nghiên cứu Bình Vôi Tím trên thế giới Fakhrutdinov Sf (1962) nghiên cứu tác dụng gây tê niêm mạc và phong bế của roemerin chiết xuất từ củ Bình Vôi [27] Mutsuo Kozuka và cs (1984) đã nghiên cứu cepharanthin và thấy chúng có... dung : Sản xuất L-rotundin và L-rotundin sulfat từ củ Bình Vôi (stephania rotunda) và D,L-rotundin sulfat từ palmatin hydrochlorid chiết xuất từ cây hoằng đằng (Fibraurea tinctoria) [17] Trịnh Ngọc Nam và Nguyễn Văn Vinh (2011) thành công trong nhân giống in vitro và khảo sát hợp chất alkaloid rotundine từ cây Bình Vôi (Stephania rotunda Lour) Môi trường tạo môi sẹo từ cành Bình Vôi là môi trường có bổ... mới hình thành + Tỷ lệ bật chồi + Chất lượng chồi 3.4.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và nước dừa tới khả năng nhân nhanh chồi Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) - Sử dụng môi trường dinh dưỡng tốt nhất được lựa chọn ở thí nghiệm 2 và bổ sung các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin và Cytokinin, nước dừa vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau... phân bố của mỗi loài rất khác nhau, tùy theo đặc tính sinh học của chúng Đặc điểm riêng của một số loài [6], [11] 2.1.2.5 Phương pháp nhân giống Bình Vôi Củ Bình Vôi có thể được nhân giống bằng cả hai phương pháp hữu tính và vô tính [11] Phương pháp nhân giống hữu tính Trồng Bình Vôi bằng hạt hoặc phần đầu của củ Thu hái quả chín vào khoảng tháng 8-10, đãi vỏ lấy hạt để gieo trong vườn ươm vào tháng 2-3... NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA, NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ [1] Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi [4] 2.3.2.2 Cytokinin Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào Các cytokinin thường gặp là kinetin, 6 - Benzyl aminopurin (BA) Kinetin được Skoog... thích sinh trưởng: BA, Kinetine, TDZ, α-NAA, IBA, IAA 17 3.3.2 Thiết bị - Máy đo pH - Máy khuấy từ - Cân phân tích 10-4, cân kỹ thuật 10-2 - Bếp ga - Lò vi sóng - Tủ sấy - Nồi hấp vô trùng - Box cấy vô trùng 3.4 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp khử trùng đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn đưa vào nuôi cấy Nội dung 2: Nghiên . hành nghiên cứu đề tài : Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh nhanh Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) bằng phương pháp in vitro . 2 1.2. Mục đích của đề tài Nghiên cứu về quy trình nhân. nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh Bình Vôi Tím (Stephania rotunada Lour) bằng phương pháp in vitro NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHÂN NHANH BÌNH VÔI TÍM (Stephania rotunda Lour) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh