ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  HÀ THỊ HỒNG Tên đề tài: THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GENE SINH TỔNG HỢP CAROTENOID TRONG E.coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2012- 2014 Thái Nguyên, 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  HÀ THỊ HỒNG Tên đề tài: THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GENE SINH TỔNG HỢP CAROTENOID TRONG E.coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : Công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm Lớp : LTK8 - CNSH Khóa học : 2012- 2014 Giáo viên hướng dẫn: TS. Dương Văn Cường – Khoa công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm – Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Dương Văn Cường - Phòng sinh học phân tử và công nghệ gen – Viện Khoa Học Sự Sống- Đại Học Thái Nguyên, người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ và định hướng tôi trong suốt quá trình thực tập tại Viện. Tôi xin cảm ơn KS. Ma Thị Trang, Phòng sinh học phân tử và công nghệ gen – Viện Khoa học Sự Sống đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi trong quá trình thực tập và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tập thể cán bộ giáo viên Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã truyền đạt những kiến thức cho tôi trong quá trình học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ban bè, đặc biệt là Bố Mẹ tôi đã luôn bên tôi, ủng hộ và kích lệ tôi học tập, nghiên cứu để hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp này. Thái Nguyên, 03/06/2014 Sinh viên Hà Thị Hồng MỤC LỤC PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3 Yêu cầu của đề tài 2 1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Cơ sở khoa học 3 2.1.1. Nhóm sắc tố Carotenoid 3 2.1.1.1. Cấu trúc phân tử các carotenoid 4 2.1.1.2 .Tính chất vật lý và tính chất hóa học của carotenoid 4 2.1.2 Phương pháp tổng hợp carotenoid 4 2.1.2.1 Con đường sinh tổng hợp tự nhiên 4 2.1.2.2. Sản xuất từ thực vật 6 2.1.2.2 Phương pháp tổng hợp bằng hóa học 7 2.1.2.3 Sản xuất phương pháp bằng phương pháp điều hướng trao đổi chất (Metabolic engineering) 9 2.1.3 Vai trò carotenoid với sức khỏe con người 10 2.2 Tình hình nghiên cứu carotenoid trong và ngoài nước 16 2.2.1 Tình hình nghiên cứu thế giới 16 2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 17 PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1. Vật liệu nghiên cứu 19 3.2 Hóa chất 19 3.2.1. Hóa chất cho quá trình biến nạp 19 3 2.2 Hóa chất dung cho gắn nối gene vào vector 19 3.2 .3 Hóa chất dùng cho thí nghiệm biến nạp và nuôi khuẩn 21 3.2.4. Hóa chất dung cho phản ứng cắt enzyme giới hạn 21 3.2.5 Hóa chất dùng cho tách chiết DNA plasmid 21 3.3 Thiết bị 22 3.4. Địa điểm và thời gian thực tập 22 3.5. Nội dung nghiên cứu 23 3.6 Phương pháp nghiên cứu 24 3.6.1 Quy trình gắn nối cụm gen iEIB vào vector pET 28 24 3.6.2. Phản ứng cắt enzyme giới hạn để thôi gel 26 3.6.3 .Phương pháp điện di 26 3.6.4 Thôi gel , thu nhận DNA 26 3.6.5. Phản ứng nối cụm gen iEIB vào vector pET28 27 3.6.6 Biến nạp 28 3.6.7. Phương pháp tách chiết Plasmid 29 3.6.7.1. Tách plasmid bằng phương pháp ankaline lysis 29 3.6.7.2. Tách plasmid bằng Kit “Gene JET plasmid Miniprep “ 29 3.6.8. Thành phần phản ứng cắt kiểm tra chiều gắn nối bằng enzyme giới hạn 30 3.6.9 Kiểm tra gen gắn nối bằng phương pháp PCR 30 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Kết quả sàng lọc dòng tái tổ hợp 32 4.2. Kết quả biểu hiện pET28-iEIB trong E.coli BL21 (DE3) 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT IPP : isopentenyl diphosphat DMPP : Dimethyllalyl diphosphate GPP : Geranyl diphosphate GGPP : Geranylgeranyl diphosphate FPP : Farnesyl diphosphate MVA : mevalone MEP : C-methyl-D-erthritol-4- phosphate DXP : 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphat HPLC : Hight Performance Liquid Chromatography- sắc kí lỏng hiệu suất cao TAE : Tris-acetate-EDTA LB : Lauria Broth IPTG : Isopropyl Thiogalactoside Bp : Base pair- cặp bazo nito PCR : Polymerase Chain Reaction- phản ứng trùng hợp RE : Reaction enzyme v/p : vòng / phút DANH MỤC HÌNHẢNH Hình 2.1: Tính chất vật lý và hóa học của carotenoid 4 Hình 2.2.Hai con đường sinh tổng hợp isoprenoids (IPP và DMAPP) và sự hình thành các carotenoid từ các đơn vị isoprenoids (building block) (Lee and Schmidt- Dannert 2002) 5 Hình 2.3 Sơ đồ tổng hợp công nghiệp hợp chất Lycopene (Ernst 2002) 8 Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp Xanthophyll (Ernst 2002) 9 Hình 2.5 : Vai trò carotenoid với sức khỏe con người(Debjani Dutta 2005) 11 Hình 2.6 Các gen sinh tổng hợp carotenoid trong vi khuẩn Pantoea ananatis 16 Hình 2.7: Con đường tổng hợp carotenoid trong vi khuẩn Pantoea ananatis 11 Hình 3.1: Cấu trúc vector biểu hiện pET28 20 Hình 3.2. Sơ đồ thiết kế vector pET28-iEIB 23 Hình 3.3 Quy trình gắn nối gen 25 Hình 3.4. Sơ đồ biến nạp plasmid pET28-iEIB vào E.coli DH5α 28 Hình 4.1: Kết quả điện di kiểm tra các dòng plasmid 33 Hình 4.2 : Kết quả điện di sản phẩm cắt Hình 4.3.Sơ đồ vector biểu hiện 34 plasmid các dòng bằng XbaI và EcoRI 34 Hình 4.4 Minh họa 2 khả năng gắn nối của cụm gen iEIB trong pET28 35 Hình 4.5 Kết quả cắt pET-iEIB với XhoI 36 Hình 4.6 Kết quả sản phẩm chạy điện di PCR 37 Hình 4.7 Biểu hiện sản xuất carotenoid trên dòng tế bào E.coli BL21 38 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 : Hàm lượng carotenoid có trong thực vật 7 Bảng 2.2 : Lợi ích về sức khỏe của một số carotenoid 14 Bảng 2.3. Một số carotenoid được sử dụng làm phụ gia trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi 15 Bảng 3.1 thành phần cấu trúc vector pET28 20 Bảng 3.2 : Các thiết bị sử dụng trong đề tài 22 Bảng 3.3: Thành phần phản ứngcắt 26 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng nối 27 Bảng 3.5. Thành phần phản ứng cắt XhoI 30 Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR 31 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Carotenoid là nhóm sắc tố phân bố rộng rãi và đa dạng trong tự nhiên. Nhóm sắc tố này được tổng hợp trong một số sinh vật quang hợp bao gồm thực vật, vi khuẩn lam và sinh vật không quang hợp bao gồm một số loài nấm và vi khuẩn. Trong thực vật, carotenoid giữ vai trò quan trọng như tham gia vào quá trình quang hợp, hình thành màu sắc và tạo thành các hormone thực vật. Cơ thể người và động vật không tự tổng hợp được carotenoid [1] Carotenoid không chỉ quan trọng với sinh vật tổng hợp ra nó mà nó còn quan trọng với người và động vật: Carotenoid có tác dụng loại bỏ gốc oxy tự do để bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa quá trình ung thư và các bệnh tim mạch [2], tăng cường đáp ứng miễn dịch [3]. Qua nghiên cứu người ta tìm thấy có hơn 20 loại có ý nghĩa quan trọng trong tế bào động vật, là sắc tố không thể thiếu trong cơ thể động vật như: α- carotene, β- carotene, lycopene, lutein, crytoxanthin … [4]. Trong công nghiệp, carotenoid đã được sử dụng làm chất màu thực phẩm, chất bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, và gần đây hơn là sử dụng trong ngành công nghiệp sản xuất mỹ phẩm và dược phẩm [5]. Với những lợi ích và tiềm năng ứng dụng to lớn của chúng, người ta đã tìm ra các nguồn và phương pháp nhằm sản xuất thương mại các carotenoid. Trong suốt quá trình đó, khi mà các phương pháp tách chiết carotenoid từ thực vật hay tổng hợp hóa học đều có những nhược điểm nhất định thì sử dụng vi sinh vật để tổng hợp carotenoid là một giải pháp tốt, với những ưu điểm vượt trội như thân thiện với môi trường, giúp hạ giá thành sản phẩm và cho phép đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng về carotenoid. Gần đây, các nhà khoa học đã thành công trong việc sản xuất các carotenoid trong các vi sinh vật dị carotenoid bằng kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Các nghiên cứu của họ đã tiến hành biểu hiện các gen cần thiết để tổng hợp các đồng phân khác nhau của carotenoid trong một số loài vi khuẩn như Zymomonas mobilis, Agrobacterium tumefaciens [6]; trong nấm men [7] và trong Escherichia coli [8] 2 Việc thiết kế các gen sinh tổng hợp carotenoid trên các vector khác nhau nhằm mang lại vật liệu phong phú trong quá trình chọn lọc chủng E.coli phù hợp trong nghiên cứu, có khả năng tổng hợp carotenoid cao. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn tôi thực hiện đề tài : “Thiết kế vector biểu hiện mang gene sinh tổng hợp carotenoid trong E.coli”. Nhằm tạo ra nguồn vector mang gene tổng hợp carotenoid phong phú có năng suất tổng hợp cao và là nguyên liệu cho quá trình tổng hợp β-carotene, lycopene sau này 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế vector biểu hiện tái tổ hợp trên nền tảng pET28a(+) mang các gen mã hóa các enzyme xúc tác quá trình tổng hợp carotenoid. 1.3. Yêu cầu của đề tài Thiết kế được vector biểu hiện tái tổ hợp trên nền tảng pET28a(+) mang các gen mã hóa các enzyme xúc tác quá trình tổng hợp carotenoid. 1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 1.4.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu về các hợp chất khác của carotenoid sau này 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn Sản phẩm của nghiên cứu góp phần tạo ra một phương pháp mới để sản xuất carotenoid. [...]... đường tổng hợp carotenoid trong vi khuẩn Pantoea ananatis[8] Nghiên cứu này cũng đã chỉ ra vai trò của từng gene trong sinh tổng hợp các carotenoids trong Pantoea ananatis Trong đó gen CrtB mã hóa cho enzyme phytoen synthase xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tiền chất geranylgernyl PPi thành prephytoen Gen CrtE mã hóa cho enzyme GGPP synthase xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tiền phytoene (prephytoene PPi)... đường sinh tổng hợp các carotenoid đồng thời làm sáng tỏ con đường sinh tổng hợp các carotenoid trong vi khuẩn Pantoea ananatis bằng cách biến nạp các gene Crt của vi khuẩn này vào E coli và phân tích chức năng của các sản phẩm do các gene đó mã hóa từ đó làm sáng tỏ thứ tự và vai trò của các gene trong con đường sinh tổng hợp carotenoids trong vi khuẩn Pantoea ananatis Hình 2.6 Các gen sinh tổng hợp carotenoid. .. tra vector tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn, PCR để kiểm tra - Nội dung 2: Biểu hiện pET28-iEIB trong E. coli BL21 3.6 Phương pháp nghiên cứu 3.6.1 Quy trình gắn nối cụm gen iEIB vào vector pET 28 Để gắn được gen vào vector biểu hiện phải tiến hành nhiều thao tác, trải qua nhiều bước khác nhau Quy trình được thực hiện theo quy trình sau: 25 Vector pET 28 Vector pR-iEIB Thiết kế Cắt với RE Gen iEIB... trình tự các gene Crt tham gia con đường sinh tổng hợp các carotenoid đồng thời làm sáng tỏ con đường sinh tổng hợp các carotenoid trong vi khuẩn Pantoea ananatis bằng cách biến nạp các gene Crt của vi khuẩn này vào E coli và phân tích chức năng của các sản phẩm do các gene đó mã hóa từ đó làm sáng tỏ thứ tự và vai trò của các gene trong con đường sinh tổng hợp carotenoids trong vi khuẩn Pantoea ananatis... chuỗi polyprenyl diphosphate dài ra nhờ vào sự xúc tác của các enzyme Geranyldiphosphate (GPP, gồm 10 cacbon) và farnesyldiphosphate (FPP,gồm 15 cacbon) được tổng hợp nhờ enzyme FPP synthase do gene ispA mã hóa (trong E coli) , sau đó FPP sẽ kết hợp với 1 phân tử IPP tạo thành geranylgeranyldiphosphate (GGPP, gồm 20 cacbon) phản ứng này được xúc tác bởi enzyme GGPP synthetase do gene CrtE mã hóa FPP... 1-deoxy-D-xylulose-5- phosphate (DXP), phản ứng này được enzyme DXP synthase xúc tác, enzyme này do gene dxs mã hóa Sau đó DXP được chuyển hóa thành 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate (MEP) bởi enzyme DXP reductoisomerasedo gene ispC (dxr) mã hóa Một chuỗi các enzyme trong con đường MEP do các gene ispD (ygbP), ispE (ychB), ispF (ygbB), ispG (gcpE) và ispH (lytB) mã hóa được sử dụng cho các phản ứng tiếp theo, giúp chuyển... công trong các vi sinh vật dị carotenoid như: Escherichia coli, Saccharomyces ceverisiae, Candida untilis và Zymomonas mobilis, bằng cách biến nạp các gene tham gia sinh tổng hợp các carotenoid từ các sinh vật khác Điều hướng trao đổi chất đã được nghiên cứu áp dụng tăng cường sự biểu hiện bằng cách đưa các gen crt của P ananatis vào vi khuẩn E. coli 2.1.2.4 Vai trò của các gen trong tổng hợp carotenoid. .. Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gene, Viện Khoa học Sự sống, Đại học Thái Nguyên 23 - Thời gian: Từ tháng 3 đến tháng 6/2014 3.5 Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Thiết kế vector biểu hiện pET28-iEIB Cắt với XbaI và EcoRI Cắt với XbaI và EcoRI Hình 3.2 Sơ đồ thiết kế vector pET28-iEIB 24 • Biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng E coli DH5α khả biến • Chọn lọc các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp •... 368-386 gene Vùng khởi đầu sao chép Cho phép tạo ra số lương lớn trong Base 3270-3889 E coli Vị trí đa tách dòng Cho phép gắn gene quan tâm Xpress fwd primer Base 158-204 Base 222-240 ORF frame 1 Vị trí khung đọc 1 Base 523-1023 ORF frame 2 Vị trí khung đọc 2 Base 3995- 4810 origin Cho phép tổng hợp DNA Base 3270-3889 21 Ngoài ra, vector pET 28 có chứa gene kháng kanamycin Nhờ đó mà vi khuẩn mang plasmid... Germany Bể ổn nhiệt Techne- OSI Máy khử ion Casada Bio Water system - Pall Co-UK Tủ an toàn sinh học cấp 2 Nu- 425- 40 0E- Nuarie -USA Máy Vortex Vortex Genius 3- IKA Genmany/China Máy Spindown E- centrifuge- Wealtec- Taiwan/USA Máy li tâm Eppendorf – CHLB Đức Pipeete 8 - channel Thermo Labsystem- Germany Nồi hấp khử trùng HV-110-Hirayma- Japan Bể rửa song siêu âm Jeiotech - Korea 3.4 Địa điểm và thời . tôi thực hiện đề tài : Thiết kế vector biểu hiện mang gene sinh tổng hợp carotenoid trong E. coli . Nhằm tạo ra nguồn vector mang gene tổng hợp carotenoid phong phú có năng suất tổng hợp cao. trình tổng hợp β-carotene, lycopene sau này 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế vector biểu hiện tái tổ hợp trên nền tảng pET28a(+) mang các gen mã hóa các enzyme xúc tác quá trình tổng hợp carotenoid. . của carotenoid trong một số loài vi khuẩn như Zymomonas mobilis, Agrobacterium tumefaciens [6]; trong nấm men [7] và trong Escherichia coli [8] 2 Việc thiết kế các gen sinh tổng hợp carotenoid