BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 NINH THỊ NHƢ QUỲNH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH TỪ VÙNG RỄ CÂY NGẢI CỨU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học HÀ NỘI, 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 NINH THỊ NHƢ QUỲNH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH TỪ VÙNG RỄ CÂY NGẢI CỨU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. DƢƠNG MINH LAM HÀ NỘI, 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày t lòng bin TS. Dƣơng Minh Lam n tình ng d tôi trong quá trình thc hi tài. Tôi xin chân thành c phòng thí nghim Vi sinh, khoa Sinh - i hm Hà N. Tôi chân thành co Ti hm Hà Ni 2, Ban ch nhim khoa Sinh - o mu kin cho tôi hc tp và hoàn  tài. Tôi xin cy cô và bng viên, to mu ki tôi trong sut th tài. Li cc nhi thân yêu ng  tôi. Hà N Tác gi Ninh Th nh LỜI CAM ĐOAN u ca riêng tôi. Các kt qu nghiên cu, s lic trình bày trong khóa lun là trung thc và không trùng vi công trình ca các tác gi khác. Hà N Tác gi Ninh Th nh MỤC LỤC M U 1 1. Lí do chn  tài 1 2. M tài 2 3. Ni dung nghiên cu 2  2 m mi c tài 2 . TNG QUAN TÀI LIU 3 1.1. V trí và phân loi x khun 3 1.1.1. V khun trong sinh gii 3  khun 3 c s phân loi x khun 3 1.1.2.2. Mt s i x khun 5 m sinh hc ca x khun 9 m hình thái ca x khun 9 1.2.2. Cu to x khun 10 1.2.m sinh lý, sinh hóa ca x khun 10 1.2.4. Sinh sn ca x khun 12 1.3. Cht kháng sinh t x khun 12 1.3.1. Khái nim cht kháng sinh 12 c s nghiên cu cht kháng sinh 12 1.3.3. S hình thành cht kháng sinh  x khun 14 1.3.4. Các yu t n sinh tng hp cht kháng sinh 15 1.3.4.1. ng cu kin nuôi cy 15 1.3.4.2. ng ca thành phng lên men 16 1.4. Tình hình nghiên cu trên th gii và  Vit Nam v kháng sinh 17 1.5. Cây ngi cu 18 . U 20 2.1. Nguyên liu và vi sinh vt 20 2.1.1. Vi sinh vt 20 2.1.2. Hóa cht và thit b 20 ng 21 ng phân lp, bo qun và gi ging x khun 21 ng th hot tính kháng sinh 21 u 21 y mu 21 2.3.2. Phân lp tuyn chn x khun 22  khun 23 nh hot tính kháng sinh 23 ng kê và x lý kt qu bng toán hc 25 . KT QU VÀ THO LUN 26 3.1. Phân lp x khun trên vùng r cây Ngi cu 26 3.2. nh kh a x khun 30 m hình thái và sc t tan ca các chng x khup 32 3.3.1. Nghiên cm khun lc các chng x khup 32 3.3.2. Nghiên cu hình dng cung sinh bào t ca các chng x khun NR34 p 35 3.3.3. Nghiên cu sc t tan ca chng x khup 36 KT LUN VÀ KIN NGH 41 TÀI LIU THAM KHO 42 CÁC TỪ VIẾT TẮT m-ADP : meso-Diaminopimelic Acid CFU : Colony Forming Unit CKS : Cht kháng sinh DNA : Deoxyribonucleic Acid HSCC : H st HSKS : H si khí sinh HTKS : Hot tính kháng sinh ISP : International Streptomyces Project VSV : Vi sinh vt : Vi sinh vt kinh VK : Vi khun RNA : Ribonucleic Acid rRAN : Riboxom Ribonucleic Acid PG : Peptido Glycan G +  G - : Gram âm DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH Bng 3.1. Các chng x khun phân lc t vùng r cây Ngi cu 27 Bng 3.2. Kt qu kho sát kh a các chng x khun phân lc t vùng r cây Ngi cu 30  Kt qu thng kê hot tính kháng sinh các chng x khun phân lp t vùng r cây Ngi cu 31 Bng 3.4. m khun lc ca các chng x khun nghiên cu 33 Bng 3.5. Sóm màu 34 Bng 3.6. m sc t tan ca chng x khun nghiên cu 37 Hình 1.1.a. Ngi cu 19 Hình 1.1.b. Vùng r Ngi cu 19 Hình 3.1. Khun lc x khun 28 Hình 3.2. Mt s chng x khun phân lp 29 Hình 3.3. Hình nh th hot tính kháng sinh ca mt s chng x khun nghiên cu 31 Hình 3.4. Nuôi cy 2 chng NR34 và ND2 35 Hình 3.5. Cung sinh bào t và bào t ca chng ND2, NR34 36 Hình 3.6. Sc t tan ca mt s chng x khun phân lc 39 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Ninh Thị Như Quỳnh 1 K36B - Sinh MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Tìm ra thu cha bi, t c ca nhân loi. n ra Penicillin - mt CKS có ngun gc t nm Penicillium. t nhóm các nhà khoa hc mi tách chic Penicillin. K t i chính th    cha b   ng vt và s dng trong nhiu ngành khác. Tuy nhiên, vic s dng các CKS không hn s xut hin ngày càng nhiu các VSV gây bnh có kh i các thuc kháng sinh hic bit là nhiu loài VSV có kh u CKS có c c tìm ra nhng CKS mi, nht là các CKS có cu trúc hóa hc t nhiên do chính VSV tit ra cc quan tâm nhi Cho ti nay khot kháng sinh hin bit trên th gii thì có ti 80% là do x khun sinh ra. Trong s n gc t các loi x khun hi  Micromonospora, Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, u  x khun hip nhiu cht kháng sinh có giá tr  gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixin. Ngoài ra, x khun tham gia tích cc vào các quá trình chuyn hoá vt cht trong t nhiên sn xut nhiu enzyme t s axit amin và axit hu  Mt s x khun có th gây bng vt. Xut phát t nhng yêu cu thc t trên, t ng nghiên cu trên th gii hi  góp phn khai thác ngun VSV vô cùng phong phú ca vùng r cây Ngi cu ti c hi tài: p và tuyn chn mt s chng x khun sinh kháng sinh t vùng r cây Ngi c Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Ninh Thị Như Quỳnh 2 K36B - Sinh 2. Mục tiêu đề tài Phân lp và tuyn chn mt s chng x khun có hot tính kháng sinh có nhiu trin vng ng dng trong thc t. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân lp và thun chng x khun t các mt, mu r cây Ngi cu khu vc Xuân Hòa,  3.2. Kim tra HTKS ca các chng x khun   p, la chn ra các chng có HTKS cao. 3.3. Nghiên cm hình thái và sc t tan các chng x khun phân lp c. 4. Ý nghĩa 4.1. Ý n Góp phn i nhng hiu bit v i sng t nhiên ca vi sinh vt nói chung và x khu tài cho phép hi vai trò ca x khut, kh a x khun. 4.2. Ý ngha thc tin Tuyn chn mt s chng x khun có hot tính kháng sinh cao, ng dng các chng x khu   i sng (trong y t  các chng x khun có hot tính kháng sinh cao này có th to ra các ch phm thuc kháng sinh phc v cho cha bnh, y t 5. Điểm mới của đề tài Tuyn chc 2 chng ND2 và NR34 cho hot tính kháng sinh cao ng còn l tip tc nghiên cu. [...]... thu đƣợc từ đất và 12 chủng từ rễ cây Ngải cứu Điều đó cho thấy trong đất có số chủng xạ khuẩn nhiều hơn so với trên rễ cây Ngải cứu Ninh Thị Như Quỳnh 26 K36B - Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Kết quả phân lập đƣợc trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1 Các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ vùng rễ cây Ngải cứu Địa điểm Độ sâu Vành đai 5 cm Độ pha loãng Chủng xạ khuẩn 10-2 ND1, ND2 10-3... có khuẩn lạc hoặc các khuẩn lạc phát triển dày khít nhau Xạ khuẩn mới phân lập thƣờng có hoạt tính kháng sinh chống VSVKĐ, nên có thể xung quanh khuẩn lạc s có vòng vô khuẩn Một số khuẩn lạc xạ khuẩn thƣờng có dạng tia phóng xạ Quan sát các mẫu phân lập sau 5 - 7 ngày nuôi cấy tôi thu đƣợc 36 chủng xạ khuẩn khác nhau từ vùng rễ Ngải cứu của khu vực nghiên cứu Trong đó có: 24 chủng thu đƣợc từ đất và. .. cầm máu, sát trùng Hình 1.1.a Ngải cứu Ninh Thị Như Quỳnh Hình 1.1.b Vùng rễ Ngải cứu 19 K36B - Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và vi sinh vật 2.1.1 Vi sinh vật Các chủng xạ khuẩn bao gồm các chủng phân lập đƣợc từ vùng rễ cây Ngải cứu khu vực Xuân Hòa, húc Yên, Vĩnh húc 2.1.2 Hóa chất và thiết bị Hóa chất Cao thịt,... ND35 Rễ NR8, NR13, NR23, NR25, NR29, NR36 Đất Mỹ ND7, ND15 10-3 7 cm 10-2 ND3, ND4 10-4 Vƣờn Yên ND5, ND6, ND21, ND22 Rễ NR18, NR19, NR30 9 cm 10-2 10-3 Đất Yên Mỹ ND16, ND21 ND11, ND28 10-4 Ruộng ND27, ND32, ND33, Rễ NR14, NR17, NR34, (Ghi chú: kí hiệu chủng ND: xạ khuẩn phân lập từ đất xung quanh rễ Ngải cứu NR: xạ khuẩn phân lập từ rễ Ngải cứu) Trên môi trƣờng Gause I cả xạ khuẩn, nấm mốc và một số. .. Streptomycetaceae là họ xạ khuẩn có hệ sợi phát triển mạnh và đƣợc nghiên cứu khá kỹ ạ ạ khuẩn 1 1 2 1 Lược sử phân loại xạ khuẩn Trƣớc thế kỉ XIX, xạ khuẩn đƣợc xếp vào giới nấm (Fungi) Về sau các nghiên cứu cho thấy chủng có nhân nguyên thủy, kích thƣớc bề ngang nhỏ nhƣ vi khuẩn nên ngƣời ta xếp vào giới vi khuẩn (Eubacteria) Fosters là ngƣời đầu tiên phân lập một số xạ khuẩn có tuyến mắt của ngƣời và đƣợc Jonh... khuẩn bao quanh, khuẩn lạc to ( Hình 3.1 A,B ) B A Hình 3.1 Khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập từ vùng rễ cây Ngải cứu A: khuẩn lạc xạ khuẩn 10 ngày B: khuẩn lạc xạ khuẩn 20 ngày Môi trƣờng Gause I có thành phần môi trƣờng thích hợp với sự phát triển của xạ khuẩn nên khuẩn lạc xạ khuẩn mọc trên môi trƣờng này khá tốt Ninh Thị Như Quỳnh 28 K36B - Sinh ... nghiệp 1.1.2.2 Một số phương pháp trong ph n oại xạ khuẩn Dựa vào sự phát triển của khoa học kĩ thuật, số lƣợng xạ khuẩn đƣợc mô tả ngày càng nhiều và chính xác trên cơ sở sự phát triển của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học Để phân loại nhanh chóng và chính xác các xạ khuẩn đến loài, ngƣời ta đã sử dụng phƣơng pháp phân loại số (Numberical taxonomy), nghiên cứu chủng loại phát sinh ( hylogeny... thực vật: lá rụng, thân cành cây chết, xác các động vật nguyên sinh trong đất… cùng sản phẩm tiết của rễ cây sống làm cho hệ vi sinh vật đất phát triển phong phú trong đó có xạ khuẩn Tiến hành phân lập theo phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu vùng rễ Ngải cứu (mục 2.3.2 chƣơng 2) Chọn các hộp petri mà ở đó các khuẩn lạc mọc riêng r , không thấy có nấm mốc, không xét các khuẩn lạc nhẵn, nhày, ƣớt, loại... TÀI LIỆU 1.1 Vị trí và phân loại xạ khuẩn 1.1.1 Vị tr ạ khuẩn trong sinh giới Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi sinh vật Gram+ lớn trong giới Bacteria Theo Krassilnikov (1970) xạ khuẩn đƣợc tách thành một lớp riêng gồm có xạ khuẩn bậc cao có hệ sợi phát triển, có cơ quan sinh sản riêng và nhóm xạ khuẩn bậc thấp có hệ sợi kém phát triển, tế bào có dạng hình que hoặc hình cầu Xạ khuẩn có hệ sợi ngắn... bào tử, xạ khuẩn còn có hình thức sinh sản bằng khuẩn ty Các đoạn khuẩn ty gãy ra môi trƣờng phát triển thành hệ khuẩn ty [11] 1.3 Chất kháng sinh từ xạ khuẩn 1.3.1 Khái niệm chất kháng sinh Theo định nghĩa truyền thống thì chất kháng sinh (còn gọi là trụ sinh) là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu Nó tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 NINH THỊ NHƢ QUỲNH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH TỪ VÙNG RỄ CÂY NGẢI CỨU KHÓA. Vi sinh vật học HÀ NỘI, 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 NINH THỊ NHƢ QUỲNH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH TỪ. thành h khun ty [11]. 1.3. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn 1.3.1. Khái nim cht kháng sinh n thng thì cht kháng sinh (còn gi là tr sinh) là nhng cht có kh t