TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN NGUYỄN THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN SINH POLYHYDROXYALKANOATE (PHA) PHÂN LẬP TỪ RƠM RẠ MỤC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học HÀ NỘI, 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN NGUYỄN THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN SINH POLYHYDROXYALKANOATE (PHA) PHÂN LẬP TỪ RƠM RẠ MỤC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. ĐOÀN VĂN THƢỢC `HÀ NỘI, 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến thầy giáo TS. Đoàn Văn Thƣợc - giảng viên Bộ môn Công nghệ Sinh học - Vi sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội - ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi tới cô giáo PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung lời cảm ơn chân thành và sâu sắc! Cảm ơn cô đã truyền niềm đam mê và tạo cho tôi cơ hội đến với chuyên ngành này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn trong bộ môn Công nghệ Sinh học - Vi sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội, đặc biệt là thầy giáo Ths. Trần Hữu Phong, bạn Mùi, bạn Phƣơng đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Con cảm ơn bố mẹ, anh trai vì đã luôn yêu thƣơng con và cho con cơ hội để học bao điều hay trong cuộc sống… Cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin trân trọng cảm ơn !  Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng với tác giả khác.  Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Công thức tổng quát của polyhydroxyalkanoate (PHA) với R là hydro hoặc nhóm ankyl (C 1 - C 13 ), x = 1 - 4 và n = 100 - 30.000 9 Hình 1.2. Sơ đồ tổng quát quá trình sinh tổng hợp PHA ở vi khuẩn 10 Hình 1.3. Ba bƣớc của con đƣờng sinh tổng hợp PHB. Một promoter nằm trƣớc gen phbC đóng vai trò khởi động quá trình sinh tổng hợp 12 Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc hạt PHA 12 Hình 3.1. Khả năng sinh sinh khối và tích lũy PHBV trong các chủng vi khuẩn 28 Hình 3.2. Khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trƣờng MT2 đặc 29 Hình 3.3. Ảnh chụp qua kính hiển quang học cho thấy hình thái tế bào và hạt PHA tích lũy trong tế bào vi khuẩn 30 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đế sự sinh trƣởng của chủng V 63 31 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đế sự sinh trƣởng của chủng V 182 31 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng của chủng V 63 32 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng của chủng V 182 33 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của các nguồn cacbon đến sự sinh trƣởng và tích lũy hạt PHA của chủng vi khuẩn V 63 34 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của các nguồn cacbon đến sự sinh trƣởng và tích lũy hạt PHA của chủng vi khuẩn V 182 34 Hình 3.10. Động thái sinh trƣởng và khả năng tích lũy PHA của chủng vi khuẩn V 63 36 Hình 3.11. Động thái sinh trƣởng và khả năng tích lũy PHA của chủng vi khuẩn V 182 36 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Khu vực phân bố và nguồn rơm rạ ở Việt Nam 4 Bảng 1.2. Thành phần hóa học của rơm rạ 5 Bảng 1.3. Hàm lƣợng một số chất có trong rơm rạ 5 Bảng 1.4. Ứng dụng rơm rạ trong nông nghiệp 6 Bảng 1.5. Ứng dụng rơm rạ trong lĩnh vực hóa chất 7 Bảng 1.6. Tên gọi của một số PHA tƣơng ứng với nhóm R và x 9 Bảng 1.7. Bốn nhóm enzyme PHA synthase 11 Bảng 1.8. So sánh tính chất vật lý của một số dạng PHA với polypropylene 14 Bảng 1.9. Các công ty thƣơng mại tham gia nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng PHA 16 Bảng 2.1. Công thức của các loại môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu 19 Bảng 3.1. Các chủng vi khuẩn thu đƣợc qua 5 lần phân lập 26 Bảng 3.2. Các chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng sử dụng thuốc nhuộm Nile blue A và quan sát dƣới kính hiển vi quang học 27 CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN CDW (cell dry weight) : Khối lƣợng tế bào khô Cs : Cộng sự HA : Hydroxyalkanoate -Đơn phân cấu tạo nên PHA mcl (medium-chain-length) : Mạch trung bình OD (Optical Density) : Mật độ quang PHA : Polyhydroxyalkanoate PhaC : PHA synthase PhaP : Phasin protein PhaR : Protein điều hòa quá trình sinh tổng hợp PHA PhaZ : PHA depolymerase PHB (hay P(3HB)) : Poly(3-hydroxybutyrate) phbA : Gen quy định enzyme β-ketoacyl-CoA thiolase phbB : Gen quy định enzyme acetoacetyl-CoA reductase phbC : Gen quy định enzyme PHB polymerase P(3HB-co-3HV) (hay PHBHV) : Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) PHV (hay P(3HV)) : Poly(3-hydroxyvalerate) PLA : Polylactic acid scl (short-chain-length) : Mạch ngắn UV (Untraviolet) : Tia tử ngoại wt% (weight percent) : Phần trăm khối lƣợng %, w/v : Phần trăm khối lƣợng trên thể tích MỤC LỤC MỞ ĐẦU …………………………………………………………………….1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Giới thiệu về rơm rạ và hệ vi sinh vật trong rơm rạ 4 1.1.1. Nguồn rơm rạ ở Việt Nam 4 1.1.2. Thành phần chính của rơm rạ 5 1.1.3. Ứng dụng của rơm rạ ở thế giới và ở Việt Nam 6 1.1.4. Hệ vi sinh vật trong rơm rạ 7 1.2. Polymer sinh học 7 1.2.1. Các dạng polymer sinh học chủ yếu 7 1.2.2. Polyhydroxyalkanoate (PHA) 8 1.2.2.1. Sinh tổng hợp PHA trong tế bào vi khuẩn 9 1.2.2.2. Phân loại và tính chất của PHA 13 1.2.3. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng polymer sinh học trên thế giới và ở Việt Nam 15 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 19 2.2. Vật liệu nghiên cứu 19 2.2.1. Hóa chất 19 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị 20 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.3.1. Phƣơng pháp thu mẫu 20 2.3.2. Phƣơng pháp phân lập 20 2.3.3. Phƣơng pháp giữ giống vi khuẩn 21 2.3.3.1. Phƣơng pháp cấy truyền định kỳ 21 2.3.3.2. Phƣơng pháp lạnh đông bằng 15% glycerol 21 2.3.3.3. Phƣơng pháp đông khô 21 2.3.4. Phƣơng pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn có tích lũy PHA bằng thuốc nhuộm Nile blue A và quan sát dƣới kính hiển vi điện tử để phát hiện các hạt dự trữ 21 2.3.5. Phƣơng pháp lên men thu sinh khối của tế bào khô 22 2.3.6. Phƣơng pháp sắc kí khí, phân tích hàm lƣợng PHA tích lũy trong tế bào vi khuẩn 22 2.3.7. Phƣơng pháp mô tả hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn 24 2.3.8. Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố dinh dƣỡng và điều kiện môi trƣờng đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 24 2.3.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 24 2.3.8.2. Hoạt hóa chủng nghiên cứu 24 2.3.8.3. Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. 24 2.3.8.4. Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến sự sinh trƣởng, phát triển và tích lũy PHA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 25 2.3.8.5. Động thái sinh trƣởng và hàm lƣợng PHA tích lũy trong tế bào các chủng vi khuẩn tuyển chọn ở các thời điểm khác nhau 25 2.3.9. Phƣơng pháp thống kê toán học trong xử lý số liệu 25 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh PHA từ rơm rạ mục 26 3.2. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 29 3.2.1. Hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn tuyển chọn….………….29 3.2.2. Hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn tuyển chọn… …… ………29 3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 30 3.4. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 32 3.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trƣởng, phát triển và tích lũy PHA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 33 3.6. Động thái sinh trƣởng, phát triển và tích lũy PHA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 [...]... cứu nào về vi sinh vật sản xuất PHA phân lập từ rơm rạ ở Vi t Nam Xuất phát từ lí do trên chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn sinh polyhydroxyalkanoate (PHA) phân lập từ rơm rạ mục 2 Mục đích nghiên cứu Phân lập đƣợc chủng vi khuẩn sinh PHA từ rơm rạ, nghiên cứu một số đặc tính sinh học và khả năng tích lũy PHA của chủng vi khuẩn tuyển chọn Nghiên cứu này là... chuyển hóa rơm rạ thành nhựa sinh học 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh PHA từ rơm rạ mục 3.2 Nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc và hình thái của chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng của độ pH đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn. .. (PHB), một số chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp co-polymer poly(3-hydroxyalkanoate-co3-hydroxyvalerate) (PHBV) [1, 27] Hiện chƣa có một nghiên cứu nào về vi sinh vật sản xuất PHA phân lập từ rơm rạ mục Nguyễn Thị Ngọc 18 K36B - Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn phân lập từ rơm rạ mục ở... polymer sinh học từ sự phối trộn tinh bột sắn và glycerol [32] Vi n hóa học Vi t Nam hiện nay cũng đang tiến hành một số nghiên cứu sản xuất các polymer sinh học có nguồn gốc từ tinh bột và một số polymer khác nhƣ: polylactic acid, polycaprolacton, polyethylenglycol, polyglycolic acid [33] Bộ môn công nghệ sinh học vi sinh, khoa sinh học, trƣờng đại học sƣ phạm Hà Nội đã tiến hành đề tài “ phân lập và nghiên. .. thành nhựa sinh học 5 Điểm mới của đề tài Tìm ra đƣợc chủng vi khuẩn sinh polyhydroxyalkanoate từ rơm rạ mục tối ƣu nhất Nguyễn Thị Ngọc 3 K36B - Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về rơm rạ và hệ vi sinh vật trong rơm rạ 1.1.1 Nguồn rơm rạ ở Vi t Nam Cây lúa luôn giữ vị trí trung tâm trong nông nghiệp và kinh tế Vi t Nam Đặc biệt hai... 3.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trƣởng, phát triển và tích lũy PHA của các chủng tuyển chọn 3.6 Động thái sinh trƣởng, phát triển và tích lũy PHA của chủng tuyển chọn 4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu đi sâu vào tìm hiểu các chủng vi khuẩn có khả năng sinh PHA và đặc tính sinh học của chúng 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Đƣa ra ứng dụng chuyển hóa rơm rạ. .. Polymer sinh học 1.2.1 Các dạng polymer sinh học chủ yếu Polymer sinh học là loại polymer có nguồn gốc từ các sinh vật (chủ yếu là từ vi khuẩn, vi sinh vật cổ và thực vật), có khả năng phân hủy bởi nhiều sinh vật trong tự nhiên Nhờ khả năng này mà các sản phẩm đƣợc chế tạo từ Nguyễn Thị Ngọc 7 K36B - Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp polymer sinh học sau khi qua sử dụng có thể phân. .. với một số hợp chất khác để tạo ra các polymer sinh học Vi t Nam - một nƣớc xuất khẩu gạo lớn thứ 2 thế giới, nên rơm rạ sản phẩm phụ của nông nghiệp có số lƣợng rất lớn Rơm rạ hoại mục có chứa Nguyễn Thị Ngọc 2 K36B - Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp lƣợng cacbon dồi dào là điều kiện tƣơng đối thuận lợi cho vi sinh vật tích lũy PHA phát triển Tuy nhiên chƣa có một nghiên cứu. .. hình thái tế bào của chủng vi khuẩn tuyển chọn trên kính hiển vi quang học 2.3.8 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng và điều kiện môi trường đến khả năng sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 2.3.8.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn Nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trƣờng MT2 đặc ở các nhiệt... khoảng 10 - 12% Rơm rạ, có hàm lƣợng tro cao và lƣợng protein thấp [30] Trong rơm rạ chứa một lƣợng lớn các chất hóa học và cacbon-hydrate thể hiện trong bảng 1.2 và bảng 1.3 [22] Bảng 1.2 Thành phần hóa học của rơm rạ Các chất hóa học Rơm rạ (%) Cellulose 32 - 47 Hemicelluose 19 - 27 Ligin 5 - 24 Protein - Tro 12.4 Bảng 1.3 Hàm lƣợng một số chất có trong rơm rạ Cacbon-hydrate Rơm rạ (%) Glucose 41 . Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn sinh polyhydroxyalkanoate (PHA) phân lập từ rơm rạ mục . 2. Mục đích nghiên cứu Phân lập đƣợc chủng vi khuẩn sinh PHA từ rơm rạ, nghiên cứu một số. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN SINH POLYHYDROXYALKANOATE (PHA) PHÂN LẬP TỪ RƠM RẠ MỤC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời. cứu 3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh PHA từ rơm rạ mục. 3.2. Nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc và hình thái của chủng vi khuẩn tuyển chọn. 3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ