MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các từ viết tắt iv Danh mục các bảng v Danh mục các hình ảnh, đồ thị vi MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4 1. 1. Hoạt động sinh sản và mang thai của trâu đầm lầy 5 1.1.1. Chăn nuôi trâu ở Việt Nam 5 1.1.2. Chu kỳ sinh sản của trâu đầm lầy 8 1.1.3. Môi trường và biểu hiện động dục trên trâu đầm lầy 10 1.1.4. Sự phát triển của bào thai 11 1.1.5. Tương quan giữa các số đo khác nhau của thai 12 1.1.6 Sự phát triển nhau thai ở động vật nhai lại 14 1.1.7. Hocmon nhau thai 19 1.2. Nghiên cứu về glycoprotein thời kỳ có chửa (PAG) 20 1.2.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu PAG 20 1.2.2. Chức năng của PAG 24 1.2.3. Biểu hiện của PAG ở các động vật nhai lại 25 1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu lactogen nhau thai 27 1.3.1. Tổng quan tài liệu về PL 27 1.3.2. Chức năng PL 30 1.3.3. Biểu hiện của PL ở các động vật nhai lại 32 iii Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. Động vật thí nghiệm 33 2.2. Thu thập mẫu vật 34 2.2.1. Thu mẫu từ lò mổ 34 2.2.2. Phương pháp đo thai 35 2.2.3. Gây động dục đồng pha ở trâu trong nông hộ 37 2.2.4. Thu mẫu máu từ trâu trong nông hộ 38 2. 3. Phương pháp miễn dịch phóng xạ (Radio immunoassay – RIA) 38 2.3.1. Kháng nguyên 38 2.3.2. Chuẩn bị kháng thể 39 2.3.3. Chuẩn bị kháng thể thứ cấp 39 2.3.4. Chuẩn bị PAG đánh dấu phóng xạ 40 2.3.5. Chuẩn bị rbPL đánh dấu phóng xạ 41 2.3.6. Chuẩn bị đường chuẩn 42 2.3.7. Phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA) 43 2.3.8. Kiểm tra độ nhạy 44 2.3.9. Kiểm tra tính tương đồng 44 2.4. Phương pháp Elisa 45 2.4.1. Tạo ra và phân lập IgG 45 2.4.2. Sự kết hợp IgG – Biotine 46 2.4.3. Xác định độ pha loãng tối ưu cho kháng thể gắn enzyme 46 2.4.4. Phương pháp ELISA kẹp gián tiếp cho định lượng PAG 46 2.5. Phân tích số liệu 48 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 3.1. Phát triển trước sinh của trâu đầm lầy 49 3.1.1. Kích cỡ bào thai 49 iii 3.1.2. Tương quan giữa chiều dài đầu đuôi với các chỉ số đo khác 53 3.1.3. Tương quan giữa khối lượng thai với các chỉ số đo khác 60 3.2. Thiết lập hệ thống RIA cho việc định lượng PAG trâu đầm lầy 65 3.2.1. Hệ thống RIA với phương pháp có ủ trước kháng thể 66 3.2.2. Hệ thống RIA sử dụng phương pháp không ủ trước kháng thể 68 3.2.3. Hàm lượng PAG trâu đầm lầy khi định lượng bằng ba hệ thống RIA 71 3.2.4. Tương quan giữa hàm lượng PAG trâu và tuổi thai ước lượng 78 3.2.5. Định lượng PAG trong mẫu máu bò b ằng các kháng thể kháng PAG khác loài 83 3.3. Thiết lập hệ thống sandwich ELISA cho định lượng PAG 86 3.3.1. Tối ưu phương pháp sandwich ELISA 86 3.3.2. Tương quan hàm lượng PAG trâu trong các loại mẫu được định lượng bằng phương pháp ELISA và RIA 90 3.3.3. Định lượng hàm lượng PAG bằng các hệ thống ELISA 98 3.3.4. Chẩn đoán có thai sớm trên trâu bằng phương pháp định lượng PAG 99 3.4. Hàm lượng PL ở trâu đầm lầy 101 3.4.1. Thiết lập phương pháp định lượng PL ở trâu đầm lầy 101 3.4.2. Hàm lượng PL trong các loại mẫu khác nhau của trâu đầm lầy 104 3.4.3. Tương quan giữa hàm lượng PL với tuổi thai ước lượng 105 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO 116 iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT As (Antiserum) Kháng huyết thanh Ac-PAG (PAG antibody) Kháng thể kháng PAG B (Tracer bound) Gắn kết đánh dấu phóng xạ bCG (Bovine chorionic gonadotrophin) Gonadotrophin nhau thai bò BNC (Binucleate cell) Tế bào hai nhân bPL (Bovine placental lactogen) Lactogen nhau thai bò cPL (Caprine placental lactogen) Lactogen nhau thai dê oPL (Ovine placental lactogen) Lactogen nhau thai cừu rbPL (recombination placental lactogen) Lactogen nhau thai tái tổ hợp bò CRL (Crown rump length) Dài đầu đuôi Cs Cộng sự DEAE (Diethylaminoethyl) Diethylaminoethyl ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FAO (Food associated organization) Tổ chức nông lương thế giới 125 I (ioden 125) Iốt phóng xạ 125 kDa kilo Danton MDL (Minimal detection limit) Giới hạn định lượng nhỏ nhất OD (optical density) Độ hấp thụ P4 Progesteron PAG (Pregnancy-associated glycoprotein) Glycoprotein thời kỳ có chửa boPAG (bovine PAG) Glycoprotein thời kỳ có chửa bò caPAG (caprine PAG) Glycoprotein thời kỳ có chửa dê ovPAG (ovine PAG) Glycoprotein thời kỳ có chửa cừu PEG Polyethylene glycol pI (isoelectric point) Điểm đẳng điện PSP60 (Pregnancy serum protein 60) Protein huyết thanh giai đoạn có chửa 60 PSPA (Pregnancy specific protein-A) Protein đặc hiệu giai đoạn có chửa A PSPB (Pregnancy specific protein-B) Protein đặc hiệu giai đoạn có chửa B R (r) (Correlation coefficient) Hệ số tương quan RIA (Radioimmunoassay) Miễn dịch phóng xạ ED-20 (20% bound) Vị trí có 20% gắn kết ED-50 (50% bound) Vị trí có 50% gắn kết ED-80 (80% bound) Vị trí có 80% gắn kết SD (Standard deviation) Sai số tuyệt đối SF (serum free) Huyết thanh động vật không có chửa iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang 1.1. Phân bố quần thể trâu ở Việt Nam 6 1.2. Đặc điểm tăng trưởng khối lượng của trâu đầm lầy Việt Nam 8 1.3. Đặc điểm sinh sản của bò, trâu sông và trâu đầm lầy 9 1.4. Sự biểu hiện của các phân tử PAG bò và dê trong hợp b ào nhau thai (Green vcs, 2000) 26 2.1. Đường chuẩn của phương pháp RIA không ủ trước kháng thể 42 2.2. Đường chuẩn của phương pháp RIA có ủ trước kháng thể 43 2.3. Phương pháp RIA có và không ủ trước với kháng thể 44 3.1. Trung bình các chỉ số kích thước của phôi/thai trâu đầm lầy giai đoạn mang thai và nghé sơ sinh 50 3.2. Tương quan hồi quy giữa CRL với chiều dài thai 54 3.3. Tương quan hồi quy giữa CRL với kích thước thân thai 55 3.4. Tương quan hồi quy giữa CRL với bốn chỉ số đo đầu thai 56 3.5. Tương quan hồi quy giữa CRL với chỉ số đo chân thai 57 3.6. Tương quan hồi quy giữa CRL với chu vi cuống rốn 58 3.7. Tương quan hồi quy giữa CRL với khối lượng thai 59 3.8. Tương quan hồi quy giữa khối lượng thai và chiều dài thai 60 3.9. Tương quan hồi quy giữa khối lượng thai và thân thai 61 3.10 Tương quan hồi quy giữa khối lượng thai và số đo đầu thai 62 3.11 Tương quan hồi quy giữa khối lượng thai và kích thước chân 63 3.12 Tương quan hồi quy giữa khối lượng thai và chu vi cuống rốn 64 3.13 Đặc điểm đường chuẩn của bốn hệ thống RIA trong ph ương pháp có ủ trước kháng thể 66 3.14 Đặc điểm đường chuẩn của ba hệ thố ng RIA trong phương pháp không ủ trước kháng thể 70 3.15 Hàm lượng PAG trong các loại mẫu khác nhau của trâu đư ợc v định lượng bằng ba hệ thống RIA 72 3.16 Phương trình hồi quy mối tương quan của hàm lư ợng PAG trong huyết tương trâu được định lượng bằng ba hệ thống RIA 74 3.17 Phương trình hồi quy mối tương quan của hàm lư ợng PAG trong huyết tương thai được định lượng bằng ba hệ thống RIA 75 3.18 Phương trình hồi quy mối tương quan của hàm lư ợng PAG trong dịch niệu được định lượng bằng ba hệ thống RIA 76 3.19 Phương trình hồi quy mối tương quan của hàm lư ợng PAG trong dịch ối được định lượng bằng ba hệ thống RIA 77 3.20 Kết quả chẩn đoán có chửa của mẫu huyết tương bò 85 3.21 Phương trình hồi quy mổ tả tương quan của ba hệ thống RIA 86 2.22 Giá trị OD trong thử nghiệm độ pha loảng của biotine và avidine 90 3.23 Giá trị trung bình hàm lượng PAG định lượng bằng RIA v à ELISA 92 3.24 Hàm lượng PAG trong các loại mẫu khác nhau khi định lư ợng bằng các phương pháp RIA và ELISA 92 3.25 Tương quan hồi quy của hàm lượng PAG trong huyết t ương trâu được định lượng bằng ELISA và ba hệ thống RIA 94 3.26 Tương quan hồi quy của hàm lượng PAG trong huyết t ương thai được định lượng bằng ELISA và ba hệ thống RIA 95 3.27 Tương quan hồi quy của hàm lượng PAG trong dịch niệu đư ợc định lượng bằng ELISA và ba hệ thống RIA 96 3.28 Tương quan hồi quy của hàm lượng PAG trong dịch ối đư ợc định lượng bằng ELISA và ba hệ thống RIA 97 3.29 Hàm lượng PAG trong các loại mẫu khác nhau khi định lư ợng bằng ba hệ thống ELISA 98 3.30 Tỷ lệ chẩn đoán có chửa trên trâu dựa vào định lượng PAG 99 3.31 Hàm lượng PL trong các loại mẫu khác nhau của trâu đầm lầy 104 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Trang 1.1. Hình ảnh trâu đực 6 1.2. Hình ảnh trâu cái mẹ và con 7 1.3. Thai trâu trong bọng dịch ối 16 1. 4. Sự di trú và phát triển của tế bào đa nhân (Wooding vcs., 1992). 18 1.5. Đồ thị biểu hiện sự tồn tại của các phân tử PAG trên bò trong suốt quá trình mang thai (Green vcs., 2000) 26 2.1. Hình ảnh đàn trâu ở Việt Nam 33 2.2. Thu mẫu máu thai từ tim thai 35 2.3. Các vị trí đo kích thước thai 37 2.4. Thu mẫu máu trâu tại nông hộ 38 2.5. Phản ứng gắn I 125 40 2.6. Bi ến động của PAG gắn phóng xạ trong các phân đoạn sau khi lọc phân đoạn bằng sephadex 40 2.7 Sơ đồ các bước trong phương pháp Elisa 47 3.1. Biến thiên kích thước trung bình của thai trâu trong suốt quá tr ình mang thai và sơ sinh 52 3.2. Tương quan hồi quy giữa CRL và chiều dài thai theo đường cong 53 3.3. Đồ thị chỉ sự tương quan giữa CRL và kích thước thân thai 54 3.4. Đường hồi quy mô tả mối tương quan giữa CRL và b ốn chỉ số đo kích thước đầu 55 3.5. Tương quan giữa dài đầu (đầu-mũi) và r ộng đầu với CRL trong khoảng quý đầu mang thai trên bò (George và cs, 2008). 56 3.6. Đường tương quan giữa CRL và chỉ số đo kích thước chân của thai 57 3.7. Đường đồ thị thể hiện mối tương quan giữa CRL với chu vi rốn 58 3.8. Đường đồ thị thể hiện mối tương quan giữa CRL với khối lượng thai 59 vi 3.9. Đường hồi quy mô tả mối tương quan giữa khối lượng thai v à chiều dài thai 60 3.10 Đường hồi quy mô tả mối tương quan giữa khối lượng thai v à ba chỉ số đo kích thước thân. 61 3.11 Đường hồi quy mô tả mối tương quan giữa khối lượng thai và b ốn chỉ số đo kích thước đầu 62 3.12 Đường hồi quy mô tả mối tương quan giữa khối lượng thai và b ốn chỉ số đo kích thước chân 63 3.13 Đường hồi quy mô tả mối tương quan giữa khối lượng thai v à chu vi cuống rốn 64 3.14 Sự tương đồng giữa đường chuẩn PAG bò với d ãy pha loãng các mẫu vật khác nhau từ trâu đầm lầy trong phương pháp RIA có ủ trước kháng thể 67 3.15 Sự tương đồng giữa đường chuẩn PAG bò với d ãy pha loãng các mẫu vật khác nhau từ trâu đầm lầy trong ph ương pháp RIA không ủ trước kháng thể 69 3.16 Tương quan của hàm lượng PAG trong huyết tương trâu khi đ ịnh lượng bằng ba hệ thống RIA 73 3.17. Tương quan giữa hàm lương PAG trong huyết tương thai đư ợc định lượng bằng ba hệ thống RIA 74 3.18 Tương quan giữa hàm lương PAG trong dịch niệu đư ợc định lượng bằng ba hệ thống RIA 75 3.19 Tương quan giữa hàm lương PAG trong dịch ối được định lư ợng bằng ba hệ thống RIA 76 3.20 Tương quan giữa hàm lượng PAG trong huyết tương trâu v ới tuổi thai ước lượng 79 3.21 Tương quan giữa hàm lượng PAG trong huyết tương thai v ới tuổi vi thai ước lượng 80 3.22 Tương quan giữa hàm lư ợng PAG trong dịch niệu với tuổi thai ước lượng 81 3.23 Tương quan giữa hàm lượng PAG trong dịch ối với tuổi thai ư ớc lượng 82 3.24 Tương quan giữa hàm lượng PAG ở thai bò với tuổi thai ư ớc lượng (Zoli và cs., 1992) 83 3.25 Kết quả tương đồng của đường chuẩn PAG bò với d ãy pha loãng mẫu huyết tương bò trong phương pháp định lư ợng bằng RIA có ủ trước kháng thể kháng PAG của dê và trâu. 84 3.26 Đồ thị chỉ sự tương quan của hàm lư ợng PAG trong mẫu huyết thanh bò được định lượng bằng ba hệ thống RIA. 85 3.27 Đĩa ELISA kiểm tra độ pha loãng của kháng thể kháng PAG dê (As#726) (dừng phản ứng sau 30 phút) 87 3.28 Đặc điểm đường chuẩn của phương pháp ELISA - PAG 87 3.29 Đường chuẩn phương pháp ELISA theo Green và cs., (2005) 88 3.30 So sánh kết quả hàm lượng PAG khi định lượng bằng RIA v à ELISA 91 3.31 Tương quan của hàm lượng PAG trong huyết tương trâu khi đ ịnh lượng bằng ELISA và ba hệ thống RIA. 93 3.32. Tương quan của hàm lượng PAG trong huyết tương thai khi đ ịnh lượng bằng ELISA và ba hệ thống RIA. 94 3.33 Tương quan của hàm lượng PAG trong dịch niệu khi định lư ợng bằng ELISA và ba hệ thống RIA. 95 3.34 Tương quan của hàm lượng PAG trong dịch ối khi định lư ợng bằng ELISA và ba hệ thống RIA. 96 3.35 Tính tương giữa đường chuẩn PL bò và dãy pha loãng các d ịch vi mẫu khác nhau của trâu đầm lầy 102 3.36. Mi ễn dịch phóng xạ kháng thể đúp lactogen nhau thai (Forsyth, 1986). 103 3.37 Tương quan giữa hàm lượng PL trong huyết tương trâu m ẹ với tuổi thai ước lượng. 106 3.38 Tương quan giữa hàm lượng PL trong huyết tương thai v ới tuổi thai ước lượng. 106 3.39 Biến động của hàm lượng PL trên bò trong suốt quá tr ình mang thai (Beckers vcs, 1982) 107 3.40 Tương quan giữa hàm lượng PL trong dịch niệu với tuổi thai ư ớc lượng 108 3.41 Tương quan giữa hàm lượng PL trong dịch ối với tuổi thai ư ớc lượng 119 3.42 Tương quan giữa hàm lượng PL trong nư ớc tiểu trâu mẹ với tuổi thai dự kiến 110 vi [...]... Chăn nuôi trâu Trâu b n Vi t Nam a Vi t Nam là trâu v phân lo i gi ng trâu ml y m l y Chưa có tài li u chính th c nào Vi t Nam, nhưng m t s tác gi d a vào hình thái mà chia thành hai gi ng: trâu ng là gi ng có kích thư c l n và trâu Dé là gi ng có kích thư c nh hơn [105] Nư c ta l n u tiên nh p n i trâu sông vào năm 1970 g m 30 trâu thu c gi ng trâu Murrah t Trung Qu c ư c nuôi Tr i thí nghi m trâu Ng... khu v c có hình tròn hay hình ovan ư c g i là m m núm nhau S lư ng núm nhau trong m t nhau thai bò dao dãy bao g m c (3 dãy ng t 70 n 150 cái Các núm nhau n m phân b thành 5 s ng t cung có ch a bào thai và s ng không ch a bào thai gi a c a s ng và 2 dãy phía trư c c a s ng) Núm nhau trâu bò có d ng l i và có cu ng Khu v c gi a mào c a màng trong d con ch a tuy n ti t trong su t th i kỳ mang thai trong... sinh lý c a bào thai, bu ng tr ng và t cung ng v t có vú Trong nghiên c u này chúng tôi t p trung ch y u vào hocmon protein ư c s n xu t b i nhau thai (PAG và lactogen thu c nhau thai) Quá trình t ng h p các hocmon d ng peptide và hocmon d ng protein trong nhau thai thay i tùy theo loài Chúng có nh hư ng t i h th ng n i ti t c a m , s trao i ch t c a bào thai trong giai o n mang thai và giai o n sơ... thân và chân … c a thai trong su t quá m l y 2 Xây d ng phương pháp RIA s d ng các lo i kháng th khác nhau lư ng PAG sau: trâu và nghiên c u s bi n nh ng c a hàm lư ng PAG trong các d ch ni u, d ch i và huy t tương c a trâu m và thai trong quá trình mang thai trâu m l y 3 Xây d ng phương pháp ELISA nh lư ng PAG trâu và ánh giá kh năng ng d ng phương pháp này s m 4 Xác m l y Vi t Nam ch n oán có ch a trâu. .. này Vai trò c a lactogen thu c nhau thai chưa ư c nghiên c u m t cách tư ng t n; có th ch c năng ch y u c a chúng là tham gia i u ch nh s trao và huy ng dinh dư ng cho bào thai i ch t gi a m và bào thai m t s loài, chúng kích thích ch c năng c a th vàng và tham gia vào s phát tri n c a tuy n vú trư c khi sinh 1.2 Nghiên c u v glycoprotein th i kỳ có ch a (PAG) 1.2.1 T ng quan tình hình nghiên c u PAG... tri n c a thai K t qu c a các nghiên c u trên các hocmon nhau thai và s bi u hi n c a chúng trâu góp ph n quan tr ng vào vi c hình thành cơ s khoa h c v sinh lý sinh s n trâu Áp d ng các k t qu nghiên c u này ch n oán có thai s m và gây ng d c ng pha có th cho phép chúng ta rút ng n th i gian gi a hai l a , qua ó nâng cao hi u qu kinh t trong chăn nuôi trâu M t khác, các nghiên c u này cũng có th cung... i có s c i u ki n sinh thái a phương Trâu dài và kháng t t và thích nghi r t t t v i Vi t Nam ph n l n có màu en, ch có m t s ít có màu tr ng Kh i lư ng sơ sinh c a trâu ml y Vi t Nam dao ng t 20 t i 29 kg Kh i lư ng bình quân c a trâu cái trư ng thành dao ng t 310 t i 500 kg, ph thu c vào gi ng và i u ki n chăn nuôi (B ng 1.2, Hình 1.1 và 1.2) Nguy n c Th c (1983) [7] cho bi t m t chu kỳ s a c a trâu. .. (55,7%); vào th i i m này phương pháp ch n oán s mang thai b ng nh lư ng P4 còn chưa th áp d ng ư c PAG có th ng d ng nh lư ng ch n oán có thai t ngày th 28 sau th tinh [181] V i các k t qu này, ch n oán có thai d a vào d ng bò, k thu t nh lư ng PAG ã ư c áp các nư c Châu Âu và B c M Lactogen nhau thai (Placental lactogen - PL) là hocmon ư c ti t ra t nhau thai các loài linh trư ng, g m nh m và ng v... xu t bào và ư c ti t tr c ti p vào h tu n hoàn c a ng v t m khi có s di trú c a t bào hai nhân [175] Th tích các bóng xu t bào có th chi m hơn 50% t bào ch t [150] 18 1.1.7 Hocmon nhau thai Ngoài vai trò m b o s trao i ch t gi a cơ th m và bào thai trong su t quá trình mang thai, nhau thai còn có vai trò như m t cơ quan n i ti t Nhau thai t ng h p m t s lư ng l n các lo i hocmon và cytokinin có nh hư... kh năng nh lư ng PL trâu b ng phương pháp RIA s d ng kháng th kháng PL bò và nghiên c u s bi n ng c a hàm lư ng PL trong huy t tương trâu và thai, d ch i, d ch ni u và nư c ti u trâu m trong quá trình mang thai trâu m l y 3 Chương 1: T NG QUAN V N NGHIÊN C U Theo th ng kê g n ây c a FAO, qu n th trâu (Bubalus bubalis) trên th gi i hi n nay vào kho ng 168 tri u con Trong ó châu Á có kho ng 161 tri u . (Pregnancy-associated glycoprotein) Glycoprotein thời kỳ có chửa boPAG (bovine PAG) Glycoprotein thời kỳ có chửa bò caPAG (caprine PAG) Glycoprotein thời kỳ có chửa dê ovPAG (ovine PAG) Glycoprotein thời kỳ có. vi MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4 1. 1. Hoạt động sinh sản và mang thai của trâu đầm lầy 5 1.1.1. Chăn nuôi trâu ở Việt Nam 5 1.1.2. Chu kỳ sinh sản của trâu đầm lầy. quần thể trâu ở Việt Nam 6 1.2. Đặc điểm tăng trưởng khối lượng của trâu đầm lầy Việt Nam 8 1.3. Đặc điểm sinh sản của bò, trâu sông và trâu đầm lầy 9 1.4. Sự biểu hiện của các phân