TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN LƯU THỊ NHƯ PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA SÂM LÀO (PANAX SP.) VÀ SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) VỚI MỘT SỔ LOÀI KHÁC TRONG CHI PANAX KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC • • • • Chuyên ngành:Thực vật học Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG TRANG TS. HÀ MINH TÂM Hà Nội, 2013 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình làm khóa luận, tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ của TS. Nguyễn Thị Phương Trang và TS. Hà Minh Tâm. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô. Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Lưu Thị Như K35C - Sinh Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tìm hiểu và nghiên cứu tại viện. Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi còn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức, cá nhân trong và ngoài trường. Nhân dịp này, tôi xin ưân trọng cảm ơn: Ban chủ nhiêm khoa Sinh - KTNN - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2; đặc biệt là sự giúp đỡ, động viên của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian tôi học tập và nghiên cứu. Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2013 Sinh viên Lưu Thị Như LỜI CAM ĐOAN Để đảm bảo tính trung thực, khách quan của khóa luận, tôi xin cam đoan: Khóa luận “Phân tích mối quan hệ di truyền của Sâm lào (Panax sp.) và Sâm ngọc linh (Panax vỉetnamensỉs Ha et Grushv.) với một số loài Sâm khác trong chi Panax ” là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Phương Trang và TS. Hà Minh Tâm. Các kết quả trình bày trong khóa luận là trung thực, khách quan và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào trước đây. Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2013. Sinh viên Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Lưu Thị Như K35C - Sinh Lưu Thị Như CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABI Applied Biosystems ABI 3100 DNA Sequencer (máy đọc trình tự) ADN Acid Deoxyribonucleic AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài các đoạn ADN khuếch đại) ARN Acid Ribonucleic Bp Base pair (cặp bazơ) Cl Cloroform-Isoamyalcohol cpDNA Chloroplast Acid Deoxyribonucleic (genome lục lạp) cpSSR Chloroplast-Simple Sequence Repeat (trình tự lặp lại đơn giản trong genome lục lạp) (ỈH2O Nước khử ion dNTP Deoxyribonucleotide triphosphtate (các nucleotide tự do) Genbank Ngân hàng gen quốc tế ISSR Internal sinple sequence repeat (vùng giữa các đoạn trình tự lặp lại đơn giản) ITS Internal Transcribed Spacer Kb Kilobase MEGA Phần mềm phân tích di ữuyền tiến hóa phân tử NCBI Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc tế PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) rDNA ADN ribosome RE Restriction Enzyme (enzyme giới hạn) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism DNA Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Lưu Thị Như K35C - Sinh Simple Sequence Repeat (ưình tự các đoạn lặp đơn giản) DANH LUC BẢNG trang và Panax vỉetnamensỉs với một số loài khác trong chi Panax trên cơ sở phân tích trình tự vùng ITS- rDNA bằng phương pháp Maximum Parsimony Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Lưu Thị Như K35C - Sinh SSR Bảng 1 MỞ ĐÀU Lý do chọn đề tài: Sâm ngọc linh {Panax vỉetnamensỉs Ha et Grushv. 1985) được tìm thấy ở Việt Nam và hiện đang được coi là loài đặc hữu hẹp, chỉ phân bố ở miền trung Việt Nam (vĩ độ 14°15) ở độ cao trên 1800m so với mặt biển [18]. Sâm ngọc linh được xác định là một cây thuốc quý về giá trị sử dụng cũng như giá trị nguồn gen [16]. Nhiều công trình nghiên cứu về Sâm ngọc linh đã được triển khai, đặc biệt từ năm 1985, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả, chủ yếu với các nhà khoa học Ba Lan và Nhật Bản đã cho thấy Sâm ngọc linh có 52 hợp chất Saponin, trong đó có 24 saponin đã được xác định là có cấu trúc hoàn toàn mới, lần đầu tiên được công bố. Khi so sánh với các nhóm sâm trồng có giá trị trên thế giới như Nhâm sâm (Panax ginseng), Sâm mỹ (P. quỉnqueỷolỉus) và Tam thất (pnotogỉnseng) thì thành phần saponin của Sâm ngọc linh rất giống với 3 loài trên nhưng hàm lượng lại cao hơn rất nhiều. Điều này càng khẳng định Sâm ngọc linh là một loài độc đáo về thành phần hóa học [17], là một cây thuốc quý có giá trị sử dụng cao. Tuy nhiên, hiện nay trên thị trường cây thuốc xuất hiện một loại sâm (đặc điểm hình thái gần giống Sâm ngọc linh) có nguồn gốc từ Lào, được làm giả Sâm ngọc linh. Do mẫu vật chúng tôi thu được mới chỉ là mẫu lá và củ nên chưa đủ cơ sở hình thái để chứng minh mối quan hệ của chúng với Sâm ngọc linh, vì vậy, để phân tích mối quan hệ di truyền của loài sâm này với Sâm ngọc linh của Việt Nam, chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu ‘Thân tích mối quan hệ di ữuyền của Sâm lào (Panax sp.) và Sâm ngọc linh (Panax vỉetnamensỉs Ha et Grushv.) với một số loài Sâm khác ữong chi Panax” Điểm mới của đề tài đề tài của tôi nghiên cứu hoàn toàn mới chưa được công bố trong công trình khoa học nào, đề tài được đăng trong hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học các trường sư phạm toàn quốc lần thứ VI. Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp Lưu Thị Như K35C - Sinh Mục đích của đề tài Đánh giá sự khác biệt về mặt di truyền của cây sâm có nguồn gốc từ Lào và Sâm ngọc linh của Việt Nam dựa trên phân tích trình tự gen ITS, từ đó đánh giá mối quan hệ di truyền của chúng với một số loài sâm khác trên thế giới. Nội dung nghiên cứu - Tách ADN tổng số của mẫu Sâm, nhân bản vùng gen ITS- rDNA - Giải trình tự gen ITS - rDNA - Phân tích số liệu: so sánh, phân tích các trình tự DNA của các mẫu thu được và so với Panax vietnamsis ở Quảng Nam, và các loài trong chi Panax. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ỷ nghĩa khoa học: Góp phần bổ sung vốn kiến thức về đa dạng thực vật ở cấpđộ phân tử, chuẩn bị cho các nghiên cứu tiếp theo về loài Sâm lào. Ỷ nghĩa thực tiễn: Đánh giá sự sai khác về mặt di truyền giữa cây sâm có nguồn gốc từ Lào và Sâm ngọc linh của Việt Nam. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1Giới thiệu về chi Sâm {Panax) Chi Nhâm sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae). Toàn bộ chi Sâm {Panax L.) trên thế giới đã biết chắc chắn có 11 loài và 1 dưới loài (thứ -var) [23]. Sự phân bố của chi Panax L. trên thế giới cho thấy chúng chỉ xuất hiện ở bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của Bắc Mỹ bao gồm bắc Hoa Kỳ và Tây Nam Canada (có 2 loài P. quinquefolius và (P. trỉỷolỉatus) . Vùng Đông Bắc Á (gồm viễn đông Nga, đông bắc Trung Quốc, bán đảo Triều Tiên và Nhật Bản) có 2 loài p. ginseng và P. japonica. Trung tâm phân bố của chi Panax L. có thể từ vùng Tây Nam của Trung Quốc lan tỏa xuống phía Bắc của Việt Nam. Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp Lưu Thị Như K35C - Sinh Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt Nam). Ở đây đang có tới 7 loài và thứ (dưới loài) mọc hoàn toàn tự nhiên. Hai loài trồng là p. notogỉnseng nhập tò Bắc Mỹ và p. pseudogỉnseng (không tìm thấy trong hoang dại nhưng giả thiết có nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi nào đó). Đây có thể coi là trung tâm phân bố của chi Sâm {Panax L.) của thế giới. Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (P. notoginseng; p. quỉnqueỷolỉus và p. trỉỷolỉatus). Giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi Panax L. là loài Sâm ngọc linh (Panax Vieừiamensis) ở miền trung của Việt Nam, tại 14°15 vĩ độ Bắc. Chính vì vậy Sâm ngọc linh được coi là loài đặc hữu hẹp của miền trung Việt Nam [6]. Các loài Nhâm sâm nói chung có tính hàn, ưa khí hậu ôn hoà, mát mẻ, sợ rét, sợ ánh nắng mặt trời mạnh chiếu trực tiếp, không ưa mưa nhiều và nhiệt độ cao, sợ gió nóng. Nhiệt độ thích hợp để sinh trưởng là 20 - 28°c. Candolle, 1830, Seemann 1868 mô tả Panax có cụm hoa tán, hoa nhỏ có năm cánh, bộ nhụy có 2 hoặc 3 lá noãn, quả mọng khi chín màu đỏ hoặc cam, có 2 - 5 hạt. Cây sống nhiều năm nhờ thân rễ, thân rễ nạc có chiều dài tuỳ theo số năm sinh trưởng [20]. Khái niệm này được chấp nhận bởi các công trình nghiên cứu sau này (Wen và Zimmer, 1999; Choi và Wen, 2000) [34, 39]. Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp Lưu Thị Như K35C - Sinh Hình 1: Sâm Vỉệt Nam - Panax vietnamensis (nguồn: Wikipedia.org) 1.2 Sâm ngọc lỉnh 1.2.1. Đăc điểm kình thái ■ Sâm ngọc linh là cây thân thảo, sống nhiều năm. Thân rễ có đường kính 3.5cm, không có rễ phụ dày dự trữ, đôi khi ở một số cây phàn cuối thân rễ có củ gần hình cầu, đường kính đến 5cm. Đốt trên cùng của thân rễ tồn tại 1-4 thân. Thân cao từ 40cm - lOOcm, rỗng, Lá mọc vòng, thường có 4 (ít khi 3, 5, 6). Lá kép chân vịt có 5 (ít khi 6,7) lá chét, lá dài 7 - 12cm (ít khi 15cm). Lá chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8 - 14cm, rộng 3 - 5cm, đầu lá thường nhọn đột ngột, mũi nhọn kéo 1.5 - 2cm, góc lá hình nêm, mép lá có răng cưa nhỏ đều . Cụm hoa dài 25cm, gấp 1 . 5 - 2 lần chiều dài của cuống lá, thường mang tán đơn độc. Tán hoa chính đường kính 2.5 - 4, có 50 - 120 hoa. Hoa màu vàng lục nhạt, đường kính hoa nở 3 - 4mm. Bầu 1 ô, 1 vòi (chiếm 80%) đôi khi có hai ô, hai vòi (chiếm 20%). Quả khi chín màu đỏ, thường có một chấm đen ở trên đỉnh quả. Quả một hạt hình thận, quả 2 hạt hình cầu hơi dẹt dài 7 - 1 0 mm rộng 4- 6 mm [12, 15] (Hình 2). Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp Lưu Thị Như K35C - Sinh Sinh thái: Sâm ngọc linh mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20 - 25°c, ban đêm 15 - 18°c, Sâm ngọc linh có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm. Công dụng: Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con. Sinh học: Vào đầu tháng 1 hàng năm, Sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả. Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9. Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng để lại 1 vết sẹo ở đầu củ sâm và bắt đầu giai đoạn ngủ đông đến tháng 12. Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông đến mà người ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi tức trên củ có 1 sẹo (sau 3 năm đầu sâm chỉ rụng 1 lá) mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 tuổi [18, 20]. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm. Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp Lưu Thị Như K35C - Sinh Hình 2: Sâm ngọc linh (Chụp tại vườn Sâm Đăc-Tô, Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam) 1.2.2. Phân bổ tự nhiên của Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) Cho đến nay, Sâm ngọc linh mới chỉ phát hiện thấy ở cao nguyên Trung phần, trong đó điểm phân bố tập trung vốn có (và quan trọng nhất) là núi Ngọc Linh. Cụ thể là ở các xã Tê Xăng, Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông; xã Mường Hoong, Ngọc Linh, huyện Đăk Glei (tỉnh Kon Tum) và xã Trà Cang, Trà Linh, Trà Nam, huyện Nam Trà My (tỉnh Quảng Nam). Theo Hà Thị Dụng, cây sâm do Phạm Hoàng Hộ phát hiện ở núi Lang Biang (tỉnh Lâm Đồng) năm 1970 cũng là Sâm ngọc linh [13]. Như vậy, nếu tính về “tính nguyên thuỷ” của nó thì Sâm ngọc linh đã có mặt ở 3 vùng núi khác nhau, tạm thời cho rằng thuộc 2 điểm phân bố (dãy Ngọc Linh và Lang Biang). Cả 2 khối núi này đều có độ cao trên 1.500m. Điểm phát hiện có Sâm ngọc linh mọc tự nhiên đều vào khoảng 1.800 - 2.200IĨ1 [6, 24]. 1.2.3 Tầm quan trọng, giá trị và thành phần hoá học của cây Sâm ngọc lỉnh a. Tầm quan trọng và giá trị Tất cả những loài thuộc chi Panax đều có giá trị làm thuốc, một số loài của chi này đã trở thành những cây thuốc nổi tiếng, không chỉ trong phạm vi của nền y học cổ truyền phương Đông mà trên toàn thế giới như Nhâm sâm (Panax ginseng); Giả Nhâm sâm (P. pseudoginseng); Tây Dương Sâm (P. quỉquefolỉus)\ Tam thất (P. notogiseng) và Sâm ngọc linh (P. vỉetnamensis Ha et Grushv.). Ở Việt Nam, ngay từ những năm kháng chiến chống Pháp (1952 - 1953) nhiều cán bộ cách mạng hoạt động nằm vùng ở Quảng Nam đã được đồng bào chỉ cho cây thuốc này được coi như một thứ thần dược để phòng thân những khi đau yếu, dùng để chữa cho người đau ốm nặng, người bị rắn cắn và các bệnh thông thường như đau bụng, cầm máu vết thương [20, 24]. Theo quan điểm hóa phân loại và dược lý học, những công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chia 12 loài thuộc chi Panax thuộc 2 nhóm chính: Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp Lưu Thị Như K35C - Sinh [...]... ngọc linh 2 Kết quả phân tích trình tự gen ITS cho thấy mẫu Sâm thu được tại Lào (Panax L.) có thể là một thứ của Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) 3 Sau khi sử dụng phương pháp sinh học phân tử chúng tôi đã phân tích được mối quan hệ di truyền của Sâm lào (Panax sp.) và Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) có thể cùng nằm trong 1 loài, có sự sai này nucleotit chỉ là sự khác trong nội bộ loài. .. p.japonicus, trong khi Sâm lào (Panax. sp) có quan hệ di truyền gàn gũi với p japonicus var bỉpỉnnatỉỷidus, trong khi p japonicus var bỉpinnatỉýỉdus là một thứ của loài P japonicus với hệ số sai khác di truyền là 0.025 Như vậy, dựa trên phân tích trình tự gen ITS, có thể kết luận, về quan hệ di truyền, Sâm lào là 1 thứ của loài Sâm ngọc linh (với chỉ số sai khác di truyền giữa Sâm lào và Sâm ngọc linh là... quan hệ di truyền của loàỉ Sâm lào (Panax sp.) và Panax vietnamensis VỚI một số loài khác trong chỉ Panax trẽn cor sở phân tích trình tự vùng ITS - rADN bằng phương pháp Maximum Parsimony Việc phân tích mối quan hệ di truyền trên cơ sở trình tự nucleotide của vùng ITS- rADN của 10 loài trong họ Ngũ gia bì theo phương pháp MP cho thấy Sâm ngọc linh (p .vietnamensis) có quan hệ di truyền gần gũi với p.japonicus,... mã 1 đoạn gen ITS của Sâm lào và Sâm ngọc linh, so sánh một số loài khác trong chi Panax để làm rõ vị trí phân loại của Sâm lào nói riêng cũng như mối quan hệ di truyền Sâm lào với Sâm ngọc linh 3.1 Kết quả tách ADN tổng số Mầu lá và củ của Sâm lào và Sâm ngọc linh được nghiền trong nitơ lỏng (196°C) thành dạng bột mịn Khoảng lOOmg bột nghiền được dùng để tách ADN tổng số, sử dụng Dneasy plant mini kit... đối chi u các trình tự tương đồng với trình tự ITS- rDNA của mẫu Sâm thu được ở Lào (Panax sp) và Quảng Nam (p .vietnamensis) với 7 loài khác trong chi Panax được thể hiện hình 7 Loài Aralia folíolo sa được sử dụng là loài tham chi u ngoài nhóm Từ kết quả tính toán về khoảng cách di truyền giữa các loài so sánh, sơ đồ mối quan hệ di truyền giữa các loài này được thiết lập (hình 7) Hình 9 Mối quan hệ di. .. là sự khác trong nội bộ loài Sâm lào có quan hệ gần gũi với các loài khác trong chi Panax ĐỀ NGHỊ Do thời than nghiên cứu và điều kiện nghiên cứu của chúng tôi có hạn nên chúng tôi đề nghị một số ý kiến: 1 Cần giải mã thêm một vài trình tự gen khác để so sánh, từ đó đưa đến kết luận chính xác về mối quan hệ di truyền giữa loài sâm có nguồn gốc từ Lào và loài Sâm ngọc linh của Việt Nam 2 Cần có nghiên... thứ của loài P.japonicus, khoảng cách di truyền giữa chúng là 0,025 Kết quả trên có thể kết luận : có sự sai khác về trình tự nucleotit vùng ITSrADN giữa Sâm lào và Sâm ngọc linh (Hình 6), nhưng với tỉ lệ thấp và không đặc trưng cho một đơn vị phân loại mới Như vậy, những khác biệt di truyền giữa Sâm lào và Sâm ngọc linh chỉ là sự sai khác ở cấp độ dưới loài Bảng 2: Khoảng cách di truyền của Sâm lào. .. thấy loài Aralia foliolosa là có khoảng cách di truyền xa nhất với tất các loài còn lại, điều này trùng khớp với dự kiến vì đây là loài nằm ngoài chi Panax, đây là mẫu đối chứng để chứng tỏ phương pháp và phần mềm chúng tôi sử dụng trong tính toán là chuẩn xác Khoảng cách di truyền giữa 2 mẫu Sâm lào (Panax sp.) và Sâm ngọc linh (Panax vỉetnamensis) là 0.028 Trong khi đó khoảng cách di truyền giữa 2 loài. .. ADN một các ngẫu nhiên Trong phản ứng sử dụng mồi tổng hợp là đoạn ADN mạch đơn có kích thước khoảng 20 nucleotit 1.4.2.3 Phân tích mối quan hệ di truyền Mỗi quan hệ di ưuyền của các loài được thể hiện bằng cây phát sinh chủng loại, đây là sơ đồ mô tả mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, được xây dựng dựa trên sự giống và khác nhau các đặc điểm vật chất di truyền hay cơ thể Trong các nghiên cứu phân. .. đó được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1% (Hình 5) Hình 5 Điện di tổng số ADN trên gel Agarose 1% Giếng 1 ADN tổng số từ Lá Sâm ngọc linh Giếng 2 ADN tổng số từ Củ Sâm ngọc linh Giếng 3 ADN tổng số từ Lá Sâm lào Giếng 4 ADN tổng số từ củ Sâm lào Ảnh điện di cho thấy đều có ADN xuất hiện ở tất cả các mẫu, tuy nhiên ở các giếng số 1 (mẫu lá Sâm ngọc linh) , 2 (củ Sâm ngọc linh) , 3 (lá Sâm lào) thì có . thực, khách quan của khóa luận, tôi xin cam đoan: Khóa luận Phân tích mối quan hệ di truyền của Sâm lào (Panax sp. ) và Sâm ngọc linh (Panax vỉetnamensỉs Ha et Grushv .) với một số loài Sâm khác trong. SINH - KTNN LƯU THỊ NHƯ PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA SÂM LÀO (PANAX SP. ) VÀ SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV .) VỚI MỘT SỔ LOÀI KHÁC TRONG CHI PANAX KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP. Sâm ngọc linh, vì vậy, để phân tích mối quan hệ di truyền của loài sâm này với Sâm ngọc linh của Việt Nam, chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu ‘Thân tích mối quan hệ di ữuyền của Sâm lào (Panax