Tách chiết Chlorophyll A và chuyển hóa thành Chlorin-e6-Trimetyl Este để làm hoạt chất chữa trị ung thư bằng liệu pháp quang

C hlorophyll và các dẫn xuất của chúng là m ột đối tượng nghiên cứu hấp dẫn và trở thành m ột lĩnh vực phát triển rộng lớn và được các nhà khoa học quan tâm bao gồm các nghiên cứu về hệ

H À N Ộ I - 2013

c Á 0 ( c m r r ? ỉ , L

í BAO CAO TOM TẢT:

n "l en đề tài: Tách chiết chlorophyll (I và chuyển hóa thành chlorin-efi-trimetyl estc đ ê là 111 h o ạ t c h â t c h ữ a trị 11 tì <4 th ư b a n g liệu p h á p q u a n g

M ụ c tiê n : X â y d ự n g quy trình tách ch iết ch lo ro p h y ll a từ vi khuẩn lam v à c h u y ển hóa

thành c h lo n n - e ó-triinetyl e ste để làm hoạt chất ch ữ a trị u n g thư b ằn g liệu pháp quang

N ộ i (h tiĩo :

• N g h iê n cứu quá trình ch iế t tách liên tục ch lo r o p h y ll a từ vi khuẩn lam và thực hiện phản ứ n g ch u y ển h ó a ch lo ro p h y ll a thành p h eo p h y tin a.

• N g h iê n cửu quá trình ch iết lá ch gián đoạn c h lo r o p h y ll a từ v i khuẩn lam v à

ch u y ển h óa trực tiếp thành m ety l p h eo p h o rb id e a b ằn g p h ư ơ n g pháp ch iết và

ch u yển vị e ste m ộ t g ia i đoạn.

• N g h iê n cứu phản ứ n g c h u y ể n hóa m ety l p h eo p h o rb id e a thành chlorin-er,- trim etyl e ste bằng phản ứrm m ở v ò n g c a c b o x y c lic

• X á c định cấu trúc c á c sản phẩm trung gian v à c h lo r in -e6-trim etyl este.

e C á c k êt q u ả đ ạ t d irọ c:

K ế t quả thự c nghiệm :

• Q uy trình tách ch iết và ch u y ể n h óa ch lo ro p h y ll a từ vi khuẩn lam thành ch lorin -

e6-trim ety] e ste có đ ộ tinh k h iế t cao.

• Đ iều ch ế 2 g c h lo r in -e 6-trh n eth yl este đủ để x á c định cấu trúc và p h ụ c vụ ch o

cá c n g h iên cứu tiếp th eo

K é t q u á c ô n g b ố : V ớ i k ết quả dó đã cône, bố cá c c ô n g trình sau đây:

Trần T hạch V ăn, Trần T hị Thanh V ân, Trần Thị H iền , Đ ặ n g Thị T hủy

A n ,N g u y ê n A n h D ĩìn o , Đ o à n D u y T iên, T á c h c h iê t c h lo r o p h ill a từ v i k h u â n

x é t q u ả đ à o tạ o : D ự a trên đề tài đà ctào tạo đư ợc

01 sinh v iên làm n g h iê n cứ u khoa h ọ c năm h ọ c 2 0 1 1 -2 0 1 2 : Đ ặ n g T hị T hùy A n

K 5 4 A

- 01 sinh v iê n làm khóa luận tốt n °h iệp : N g u y ễ n A n h D ũ n g K 5 4 A (n ăm 2 0 1 3 )

I liền H V C H k h óa 20.

f Tinh hình kinh phí cùa đề tài:

T ổ n g kinh p h í đ ư ợ c cấp ch o v iệ c thự c h iện đề tài trong 2 năm là 160 triệu đ ồ n g chủ y ếu đ ư ợc d ù n g để m ua h oá ch ất n g h iệm M ộ t phần kh ác đ ư ợ c d ù n g đ ể th u ê m ư ớ n chuyên m ôn v à lao độn g.

Đ ã quyết toán kình p h í của h a i năm

KIIOA QUAN LY

(Ký và ghi rõ ho tên)

CHỦ TRÍ ĐẺ TAI (Ký và ghi rõ họ tên)

T RƯ Ờ NG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỤ NHIÊN

a R ea serch in g P ro ject: Isolation and transformation o f chlorophyll a to

chlorin-e,,-trimethyl ester using for photodvnam ic therapy o f cancer

C ode: Q T -1 0 -1 8

b D irector: T ran T h ach V an, A ss.P ro f.P h D

c M em b ers: - D oan D uy T ien, Ph.D

- Tran Thi Thanh Van, Ph.D

- Tran Thi Hien, M.s

d Researching Attitudes and Contents:

- R esea rch in g A ttitu d e s: Build the process o f isolation chlorophyll a from

cya n o b a cteria and transformation to chlorin-e^-trimethyl ester using for photodvnam ic

- Study on reaction transformation m ethyl pheophorbide a to chlorin-e6-trimethyl

ester from open carboxyl cyclic.

- Study on structure o f m ediation products and chlorin-e6-trimetyl este

e R esults:

• The process o f isolation and transformation chlorophyll a from cya n o b a c teria

to chlorin-e6-trimethyl ester with good pure

• Synthesis o f 2g chlorin-e6-trimethyl ester

• T w o reaserching paper has been submitted.

• The reaserching project has contributed to the graduations o f one bachelor, the researchs o f one junior and one master.

II S U M M A R Y :

MỤC LỤ C

CÁC KÍ HIỆU VIÉT TẮT

D A N H M Ụ C B Ả N G B I Ế U , H Ì N H V Ẽ

MỞ Đ À U 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG Q U A N 3

1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp 3

1.1.] Cấu tạo và tính chất của hệ quane hợp ở thực vật và vi khuẩn 3

1.1.2 C hlorophyll 10

1.2 Giới thiệu về ngành vi khuấn lam ( ngành cyanobacteria) 13

1.2.1 Sơ lược về vi khuẩn lam 13

1.2.2 C ấ u t ạ o tế b à o 15

1.2.3 P h â n l o ạ i 15

1.2.4 Ỷ nghĩa thực tiễ n 16

1.3 Tình hình nghiên cứu về chlorophyll a trong nước và quốc t ế 17

1.4 Các dẫn xuất của chlorophyll a 18

1.5 Sinh tổng hợp chlorophyll a 19

1.5.1 Sinh tổng hợp axit 5-am inolevulinic 19

1.5.2 Sinh tổng họp pyrol (porphobilinogen) 20

1.5.3 Quá trình đóng vòng của 4 vòng pyrol (tetrapyrol) 21

1.5.4 Đưa ion Mg2+ vào hộ thống vòng 22

1.6 Tổng hợp loàn phần chlorophyll a theo W oodw ard 23

CH Ư Ơ N G 2: T H ự C N G H IỆ M 25

2.1 Mục tiêu thực n g h iệ m 25

2.2 Xác định các tính chất vật lý 25

2.2.1 Sắc kí bản m ỏ n g 25

2.2.2 Phổ hồng ngoại (1 R ) 25

2.2.3 Phổ cộng hựởng từ hạt nhân 25

2.2.4 Phổ khối ( M S ) 25

2.2.5 Phổ tử n g o ạ i 25

2.3 N ội dung nghiên cứ u 25

2.3.1 N ội dung 1 25

2.3.2 N ội dung 2 27

2.3.3 N ội dung 3 28

2.4 Xác định cấu trúc các sản phẩm bàng phổ hồng ngoại, tử ngại và khả kiến, phổ cộng huỏng từ hạt nhân và phổ khối 29

2.4.1 Cẩu trúc của pheophytin a 29

2.4.2 Cấu trúc của m etyl pheophobide a 30

2.4.3 C ấu Irúc cua chlorin e<s- trim etylester 30

C H Ư Ơ N G 3 : K Ế T Q U Ả VÀ T H A O L U Ậ N 32

3 1 T á c h c h iết và c h u y ê n hoá c h lo ro p h v ll a thành p h e o p h y tin a 32

3.2 Thực hiện phàn ứng chuvén hoá chloroph\ II a thành metvl pheophobide a 36

3.3 C h u y ề n hoá m etyl p h e o p h o b id e a thành chlorin - e h t r im e ty le s te r 40

C H Ư Ơ N G 4 : K Ẽ T L U Ậ N 45

TAI LIỆU T H A M K H Ả O 46

PH Ụ L Ụ C

B ả ig 1.1:

B a ig 3.1:

B ả ig 3.2:

Bảng 3.3:

H hh 1.1:

1-i'nh 1.2:

lin h 1.3:

Hiih 1.4:

H iih 1.5:

H hh ] 6:

H hh 1.7:

Hình 1.8:

Hình 1.9:

Hình 1.10:

Hình 1.11

I-Inh 1.1 2:

Hình 1.13:

H n h 1.14:

H n h 1.15:

H nil 1.16:

H nh 1.17:

H n h 1.18:

H n h 1.19:

H n h 1.20:

H n h 1.2 1:

H n h 2.]:

H n h 2.2:

H n h 2.3:

H n il 2.4:

*5 -í

D A N H M Ụ C B Ả N G B IÊ U , H ÌN H V Ẻ

Thành phần của các chlorophyll khác n h a u

B ảng dữ liệu phổ 'H -NM R của pheophvtin a

Bảng dừ liệu phổ 'H -NM R của metvl pheophobide a 377

Bảng dữ liệu phổ 'H -NM R của chlorin e6 - trim etylester 422

D A N H M Ụ C H ÌN H V Ẻ N ăng lượng bức xạ trong ton e họp cua các phân từ hữu CO' 3

Các hệ thống quane h ợ p 4

Hệ thống ăng ten của các vi khuân t í a 5

Hấp thụ ánh sáng của hệ thốn2 ăng ten trong thực v ậ t 6

Caroten trong hệ quang hợp 6

Cấu trúc trung tâm phản ứng của vi khuẩn R hodopseudom onas virdis 7 C h u ỗ i e l e t r o n v ậ n c h u y ế n c ủ a m à n g t h y l a k o i d 8

Cố định Cacbon c 6 theo chu trình C alvin -B en son 9

Cố định cacbon theo chu trình c 4 10

C ông thức cấu tạo của chlorophyll a 11

Te bào dị hình (*) ở Tảo A n n a b a en a 15

Các hợp chất chlorophyll phổ biến trong tự n h iê n 177

Các hoạt chất sử dụng để chữa trị ung thư bàng liệu pháp q u a n g 1919

Sinh tổng hợp axit 5-am inolevulinic từ glyxin và s u c x in y l-C o A 2 00 Sinh tông hợp axit 5-am in olevulin ic 200

Quá trình tổng họp vòng p y r o l 211

Sự tạo thành tetrapyrol 211

Quá trình đóng vòng của tetrep yrol 212

Quá trình tạo thành protophvrin I X 222

Quá trình hình thành phân tử chlorophyll a[l0'30'331 233

T ổng họp chlorophyll a theo W oodw ard 244

Chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a 266

C huyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a 277

Chuyển hoá trực tiếp thành metyl pheophobide a từ vi khuẩn la m 28

Chuyển hoá metyl pheophobide a thành chlorin e6- trimetylester 29

lìn h 3 1 : P h ố h ồ n ” n g o ạ i c ủ a p h e o p h v t i n a 3 4 4

linh 3.2: Phổ u v - VIS của Pheophvtin a 344

lình 3.3: Phô khối cùa pheophytin a 355

lình 3.4: Phổ 'H -N M R của pheophvtin a 355

lình 3.5: Phô hồng ngoại của m etvl pheophobide a 38

-lình 3.6: Phổ u v - VIS của m etyl pheophobide a 3838

lình 3.7: Phổ khối của metyl pheophobide a 39

-lình 3.8: Phổ 'H - N M R của pheophobide a 39

lình 3.9: Phổ u v - VIS cùa chlorin e6 - trim etylester 433

-lình 3.10: Phổ hồng ngoại của chlorin e6- trim ety lester 433

lình 3.1 1: Phổ khối cùa chlorin e6 - trim etvlester 44

-linh 3.12: Phồ 'H - N M R của chlorin e6 - trim etylester 444

Từ làu các nhà khoa học rất quan tâm tói việc chiêt tách các sẳc tố từ lá xanh của thực vật bậc cao Cách đâv hon 100 năm các nhà hóa học đã tách được chất màu xanh

lừ lá và liọi ch ú n s là Chlorophyll V ào năm 1913, Richard W illstatter nhà hóa học người Đức đã chi ra rang tất cả các năng lượng sống đều nhờ mặt trời và cây xanh có một cách nào đó để hấp thụ năng lượng này Tới năm 1919 ông đã giải thích được chức năng cua hợp chất hâp thự năng lượng mặt trời chính là Chlorophyll Thực vật bậc cao có lá xanh đã tự mình hấp thụ năng lượng bức xạ và chuvền hóa thành năng lượng dự trữ trong cơ thể.

C hlorophyll giữ vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình quang họp là chất hấp thụ năng lượng ánh sáng trong hệ quang hợp Chlorophyll chuyên năng lượng ánh sáng thành năn2, lượng hóa học trong phân tử ATP trong quá trình này xảy ra các phản ứníỊ chuyên dịch electron (phản ứng oxy hóa khử).

C hlorophyll và các dẫn xuất của chúng là m ột đối tượng nghiên cứu hấp dẫn và trở thành m ột lĩnh vực phát triển rộng lớn và được các nhà khoa học quan tâm bao gồm các nghiên cứu về hệ thơm, khả năng hấp thụ ánh sáng, chuyển dời điện tích, tính chất phổ, sinh tồng hợp và các nghiên cứu y dược.

C hlorophvll và các dan xuất của chúng có nhiều ứng dụng khác nhau trong y học

và côn g nghiệp Trong y học, chlorophyll được dùng như m ột thành phần cơ bản trong khẩu phần ăn k iêng và thuốc chừa bệnh Chẳng hạn, C u-chlorophyllin phòng chống

u n s thư từ thức ăn bị thiu mốc chứa hydrocacbon mạch vòng, atlatoxin Chlorophyll

và các dẫn xuất còn được sử dụng như là chất nhạy sáng đế tiêu diệt các tế bào ung thư

và chống virus, chat chừa vet thươne và khử mùi hôi.

Chlorophyll ức chế phát triển của vi khuẩn, kích thích v iệc phục hồi các mô đã bị

hư hại và ngăn càn tác hại của các chất gây une, thư Chlorophyll còn có lợi cho hệ tiêu hoa và có tác dụng dưỡng da.

M ột số dẫn xuất chlorophyll có hoạt tính sinh học quí giá như tiêu diệt tế bào ung thư tủy, virus leukem ia, u ác tính (m alignant m elanom a) theo cơ chế quang trị liệu Chlorophvll còn có tác dụna giảm viêm khóp (arthritis), chữa trị u xơ giảm mùi hôi giảm đường máu của người bệnh cao tuổi.

1

Chlorophyll là một nhóm các hợp chất đa dạng bao gồm chlorophyll (a, b c.

d , ) trong đó chlorophyll a phô biến nhất trong tự nhiên, đó là chlorophyll trong hệ quang hợp cua thực vật bậc cao táo biển và vi khuẩn quana họp Trona thực vật bậc cao hệ thông quang hợp có cấu tạo rất phức tạp và chứa nhiều loại chlorophyll khác nhau Ọuá trình tách các chlorophyll ra khỏi nhau rất khó khăn và phức tạp Trong các loại vi khuân quan? họp thì vi khuẩn lam có cấu tạo hệ quane hợp đơn giản nên việc

phân lập dễ đàne hơn Vì vậy chúng tôi đã lựa chọn đề tài “ Tách ch iế t c h lo ro p h y ll a

và ch u yến h ỏa th àn h ch lo rin -e (-tr ỉm e ty ỉ este đ ể là m h o ạ t c h ấ t ch ữ a tr ị u n g th ư b ằn g

liệu pháp qu a n g " làm đề tài cho nhóm nehiên cứu của mình, với mục đích góp phân

vào việc nghiên cứu trong lĩnh vự c hóa học về Chlorophyll chúng tôi tiến hành nghiên

cứu tách chiết Chlorophyll a ra khỏi Tảo lam một cách hiệu quà ớ qui m ô phòng thí nghiệm và từ đó chuyển hóa C hlorophyll a thành các dẫn xuất có hoạt tính sinh học

(chlorin-e6-trimetyl este) Chúng tôi hy vọng sẽ sử dụng những kết quả thu được trong quá trình thực hiện đề tài làm tiền đề cho những nghiên cứu sau, phục vụ cho mục đích

chuyển hóa C hlorophyll a thành những hợp chất có thể sử dụng làm thuốc chữa trị ung

thư bằng liệu pháp quang, một phương pháp tiên tiến hiện đang được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

2

C H Ư Ơ N G 1 : T Ò N G Q U A N

1.1 C ấu tạ o và tín h chất của hộ q u a n g họp

1.1.1 C ấu tạ o và tính ch at củ a hệ q u a n g h ọp ở th ự c vật và vi khuẩn

Quang hợp là cơ sở năng lượng cua sự sốn e trên trái đất Chỉorophvll hấp thụ

n ăns ánh sáng mặt trời và chuyển quansi năng thành hóa năng bời trung tâm phan ứng trong hệ quang họp cùa vi khuẩn và thực vật dưới dạng N A D P H và ATP được sử dụng

đề tổng họp cacbohydrat (hình 1.1).

Anoxygenic Reducing power Carbon

ATP

Hình 1.1: Năng lượng bức xạ trong tổng hợp của các phân tử hữu cơ

Các chlorophyll hấp thụ và biến quang năna thành hoá năng với hiệu suất cao

Các hệ thống quang hợp (P S ) (hình 1.2) được phân loại theo cấu trúc của trung tâm

phản ứng chia thành PSI cùa V I khuẩn lam, PSII cùa thực vật bậc cao và PS của vi khuân tía đêu bao gồm bốn thành phần chính là ăng-ten thu sáng, trung tâm phản ứng, trung tâm chuyển điện tử và bộ máy cố định cacbon (3' ' 1

3

Trong PSII gồm protein D I và D 2 có cấu trúc và chức năng tương đồng với các tiêu đơn vị L và M của trung tâm phản ứng ở vi khuẩn N ăng lượng ánh sáng được hấp thụ bởi LHCII và chuyển vào trung tâm phản ứng bởi protein-chlorophyll C P43 và

C P47 Quá trình chuyển dời điện tích thực hiện bởi phức họp của mangan để ôxi hóa nước và giải phóng oxi vào khí quyển.

Trong PS I, các protein PsaA và PsaB tạo thành một heterodimer giốn g PSII M ồi PsaA và PsaB bao gồm một trung tâm phản ứng tương đương với D I hoặc D 2 và m ột ăng ten tương đương với CP43 hoặc C P47 Đ iện tử được lấy từ plastocyanin (PC ) ờ bên trên lumen và chuyên đến sắt sunfua (F eS ) ở phía trên stroma để khừ N A D P J thành N A D P H [28].

Hệ thống ăng ten ( hình 1.3 và hình 1.4) được tổ chức để thu nhận năng lượng

bằng chuyển electron từ trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích và chuyển tới

4

trung tâm phản ứnẹ là nơi phản ứnơ quane hoá diễn ra c ấ u tạo cua ăng ten LH1 bao gôm một heterodimer cùa chuồi peptit và hai phân tứ chlorophyll a hoặc b LH2 bao gồm một heterodimer của chuồi peplit và ba phân tử chlorophyll a hoặc b Các sấc tố

ãng ten

Hình 1.3 : Hệ thống ăng ten của các vi khuẩn tíaJ2V/

Hệ thống ăng ten tăng hiệu quả hấp thụ photon bằng cách tăng sổ lượng sắc tổ để hấp thụ trong dải sóng từ 400nm-800nm Nếu cường độ của ánh sáng mặt trời thấp, mỗi phân tử chlorophyll chi hấp thụ một vài photon trone một giây Bằng cách kết

n h ấ t j l.4 7 ,1 ,5 2 6 2 7 2 9 ]

5

H ìn h 1 4: H ấ p th ụ á n h sá n g c ủ a h ệ th ố n g ă n g ten tro n g th ự c v ậ t1' 51

Hình 1.5: Caroten trong hệ quang hợp.

Trung tâm phản ứng của hệ quang hợp bao gồm hàng trăm chlorophyll và một

xảy ra để thực hiện phản ứng khư N A D + thành NADPH Phản ứng ở trung tâm phản ứng loại I không có sự tạo thành oxy trong khi ở trung tâm phản ứng loại II oxy được tạo thành

Trung tâm phản ứng của vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis bao gồm bốn tiêu

đơn vị protein {hình 1.6) và các nhóm hoạt động bao gồm chlorophyll dime có tô

c h ứ c đ ặ c b i ệ t , h a i p h â n t ử p h e o p h y t i n , p h â n t ử q u i n o n Q A , p h â n t ừ q u i n o n Q b v à một ion sắt (Fe) Chuỗi chuyển dời điện tích bất đầu từ Chlorophyll monome phía bên trái

6

qua chlorophyll dime sang pheophytin đến Chlorophyll monome phía bên phai rỏi

trái và trơ về Chlorophyll monome ban đâu Năng lượng kích thích của electron đâ dược sư dụne đê tông hợp ATP cao năne từ ADP Đó chính là cơ sở và bản chất của quá trình quang hợp

Hình 1.6: c ấ u trúc trung tâm phản ứng trong hệ quang hợp

của vi khuẩn Rltodopseudomonas virdis J 61

Chuỗi vận chuyển điện tử là những hệ thống của các protein và enzyme thông qua đó các electron di chuyển từ mức năng lượng cao hơn về một mức độ năng lượng

tháp một cách điều hòa để nâne cao hiệu quả sử dụne năng lượng (hình 1.7) Trong

7

chuỗi vận chuyên điện tử cùa màng thvlakoid bao gồm các enzvm khư săt plastoquinon oxiđoreductase và enzvm ATP sỵntase Dò nạ electron tách ra từ phân tư nước tới NADP dưới tác dụna cua PS Chuồi vận chuyển proton thực hiện qua màng thvlakoid và được sử dụntĩ để tổng hợp ATP Khi các electron di chuyên vào chuỗi vận chuyên, các protein luân phiên bị oxi hoá và giải phónạ ra proton đi vào trong màng

trạng thái năng lượng thấp thì sự mất mát năng lượng; xảy ra quá nhanh dẫn đên các tê bào sử dụng năng lượng ánh sáng với hiệu suất quá thấp

Hình 1.7: Chuỗi eletroỉi vận chuyển của màng thyìakoid

Cacbohydrat được tổng họp từ khí cacbonic và nước trong pha tối của bộ máy cô định cacbon bằng cách sử dụng xúc tác enzyme và năng lượng từ ATP hoặc NADPH

8

Hình 1.8: c ổ định Cacbon c 6 theo chu trình Calvirt-Benson

lục lạp gồm 3 chuỗi phản ứng khác nhau Pha đầu là phàn ứng của dẫn xuất đường 5

là phàn img của ribulose-5-photphat với ATP tạo thành ribulose-1.5-bisphotphat Quá

dổi của chúng Trong tất cả các sinh vật C 03 là chất nền ưu tiên, nếu nồng độ C 02 trở nên thấp hơn nhiều so với nồng độ oxy thỉ sự hô hấp xảy ra ơ mức độ đáng kê

Hình 1.9: c ố địnlì cacbon theo chu trình c 4

Ờ một số loại thực vật, cơ chất cho quá trình cố định C O2 là phosphoenolpyruvate (PEP) theo chu trình C4 Tỷ ]ệ sử dụng ATP cho cố định C O2 trong thực vật theo chu Irình c 4 cao hơn so với chu trình c 6.

1.1.2 Chlorophyll

1.1.2.1 Cấu tạo và tính chất cùa chlorophyll

a Cau tao

Có 5 loại chlorophyll bao gồm chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c,

chlorophyll d chlorophyll e 0 thực vật bậc cao chỉ có 2 loại chlorophvll a v à b; còn chlorophyll c d e có ơ vi sinh vật, rong tảo vi khuân

Vê công thức câu tạo phân tứ chlorophyll a chia ra hai phân: nhân chlorophyll và

đuôi phân tử chlorophyll

o p h y tv l 1

c h l o r o p h y l l a

p h y t y I =

Hình 1.10: Công thức cấu tạo của chlorophyll a

Chlorophyll c l Chlorophyll c2 Chlorophyll d

Bảng 1.1: Thành phần của các chlorophyll khác nhau

N h â n c h l o r o p h y l l là phần quan trọng nhất trong phân tử diệp lục gồm 1 nguyên

tử Mg ở trung tâm liên kết với 4 nguyên tử N của 4 vòng pyrol trong đó có 2 liên kết phôi trí Phần nhân chlorophyll bao gồm 4 vòng pyrol liên kết với nhau qua liên kết metylen, do có mạch liên hợp dài, phân tử chlorophyll có khả năng hấp thụ ánh sáng rất mạnh

Đuôi phân tử chlorophyll là gốc rượu phytol có 20 nguyên tử cacbon Đuôi chlorophyll có tính ưa lipit nên có vai trò định vị phân tử chlorophyll trên màng quang họp thilakoit có tính lipit

/> rinh chắr của chlorophyll

♦í* Bản chất hoá học của chloroph) II

Chlorophyll khôno, tan trong nước, chỉ tan trong các dung môi hữu cơ Khi muốn chiêt xuât chlorophyll ra khói lá xanh phải dùng các dung môi như este axeton rượu, benzen

Chlorophyll là este cua axit chlorophvllic với hai rượu là phytol và metanol nên chun ạ có các phản ứng đặc trưng của một este là phàn ứng xà phòng hoá khi tác dụng với kiềm đê tạo nên muối chlorophylat vẫn có màu xanh

Cl 1,011

c20h39oh

Chlorophyll aChlorophyll tác dụng với axit để tạo nên hợp chất pheophytin có kết tủa m àu nâu,

diệp lục Điều đó chứng tỏ nguyên tử M g có vai trò rất quan trọng quyết định tính chất qua n g hóa của diệp lục

M g : ~

C h lo r o p h y ll a Pheophytin a

Pheophytin có thê tác dụng với một kim loại khác và kim loại này sẽ đây 2H đê thav thê vào vị trí của Mg tronạ phân tử chlorophyll tạo nên hợp chât có màu xanh rât bền Trong môi trường axit mạnh, đun nóng, pheophytin có thể bị thủy phân liên kêt este với rượu phytol tạo thành hợp chất pheophorbide

12

Sư mất màu cua diệp lục: Chlorophyll ờ tronc tế bào khó bị mất màu vì năm t:ong phức hệ với protein và lipit Trong dung dịch, có ánh sáng và ( X chlorophyll sẽ

n a t màu do phản ứng quang oxi hoá

1.1.2.2 Vai trò cua chlorophyll trong hệ quang hợp

Hấp thu năng lượng ánh sán li mặt trời: nhờ cấu trúc đặc trưng của phân từ

V ận chuyên nănc, lượng vào trung tâm phản ứng: từ phân tử chlorophyll hấp thu ánh sáng cho đến trunu tâm phản ứng của quang hợp phải qua một hệ thông cấu trúc trong m àng thilakoid gồm rất nhiều phân tử chlorophyll khác nhau Năng lượng ánh sáng phải truyền qua các phân tử chlorophyll đề đến được trung tâm phản ứng

Tham gia biến đổi năng lượng ánh sáng thành năng lượng hoá học tại trung tâm phản ứng

1.2 G iới th iệu về n g à n h vi k h u ẩ n la m (n g à n h cyanobacteria)

6 9 ° c

Vi khuẩn lam thuộc loại ưa nhiệt, có tính bền vững với nhiệt độ Nhiều loài có thè phát triển ở nhiệt độ cao, cả trong các suối nước nóng (70 - 80°C) Tảo lam có thể chịu được nhiệt độ cao như vậy là nhờ trạng thái keo đặc biệt của chât nguyên sinh Mặt khác, một số vi khuẩn lam cũng có khả năng tồn tại ở nhiệt độ thấp (những vi kluiân sổng trong băna, tuyết, hay ở N am cực nhiệt độ tới - 8 3 ° c vẫn tìm thấy một

13

Vi khuẩn phát triển mạnh ờ nhiệt độ cao (vào các tháng nóna trons năm) Với các \i khuân nước nyọt nhiệt độ phát triển thích hợp là 30°c

Khi sinh trướng phát triẽn mạnh, vi khuẩn gâv nên hiện tượng "nước nơ hoa" Tuy ihiên một số loài thuộc chi Osciỉìatoria lại gây “ nước nở hoa” trên băng ở nhiệt tíộ cản 0 ° c Khi có hiện tượng “nước nở hoa’' do vi khuẩn lam gây ra thì nước không

sử dune được vì khi đó sinh khối cùa tảo đạt tới mức khá lớn (tối đa tới 4 5 0 - 5 0 0 g /n r )

mà trong đó rất ít loài có thể dùng làm thức ăn cho các sinh vật khác, sau đó chúng chết hàng loạt và phân hủy Các chất do vi khuẩn tiết ra và các sản phẩm phân hủy cua chúng khi chết đều gây hại

Trong số các cơ thể tự dưỡng được thì vi khuẩn lam được xem là nhóm nguyên thủy nhất Di tích hóa thạch của các vi khuân lam dạng sợi phát hiện được cách nay khoảne, 3.5 tỷ năm Mặc dầu tế bào không có cấu trúc phúc tạp so với các vi khuân

khác nhưng nó vẫn là đại diện có vai trò quan trọng ở các hệ sinh thái Vi khuân lam là sinh vật quang họp đầu tiên tổng hợp chất hữu cơ và cũng là tế bào đầu tiên có hai hệ thống tiếp nhận ánh sáng (hệ thống quang loại ĩ và II) và giải phóng Oi Nhiều loài vi khuẩn lam có khả năng cố định đạm, chuyển N itơ trong khí quyển từ thể tự do sang,

Vi khuẩn lam chưa có nhân điển hình, không có m àng nhân, vật chất di truyền

được tập trung trong chất nhân (nucleoid), kh ôn e có lưới nội sinh chất, ty thể, thể golgi lạp thể và không m ang roi, chỉ chứa chlorophyll, sắc tố liên kết với protein

thường làm cho chúng có màu lam (có khả năng tự dưỡng) Chúng cũng chưa có sự sinh dục hữu phái

phần Ị ớn dưới dạng tập đoàn hay đa bào hình sợi, hình chuỗi hạt đơn hay phân nhánh.Đại đa số tế bào vi khuẩn lam dạng sợi - chuỗi hạt thường có tế bào dị hình (dị bào) Dị bào là những tế bào dặc biệt, lớn hơn các tế bào bình thường khác, có m àng đôi dày trong suốt, không có oxy và lthông có hệ thống quang II do đó không sản xuất ra oxy trong quá trình quang hợp DỊ bào có 1 hoặc 2 lồ (ở đầu tiếp xúc với tế bào dinh dưỡng) tùy theo vị trí ờ đầu hay ờ giữa sợi (đặc biệt trong phân loại) qua đó lưu

ảnh hưởng của các yếu tố môi trường Dưói kính hiển vi quang học chât tế bào trông

14

đồng nhát nhưno dưới kính hiển vi điện tử nó có một hệ thống m àns thườnơ có màu xanh vànu do có chlorophyll a và caroten nlurnu thiếu phycoxyanin.

Dị bào có vai trò trong việc cố định đạm tronẹ điều kiện hiếu khí

Trong sự phát triển của sợi, sợi có thể bị tách ra ờ hên cạnh các dị bào này và tạo thành một nhánh mới đi ra từ sợi chính Đó là sự phân nhánh giả cua sợi phân biệt với

sự phân nhánh thật được bắt đầu từ một tế bào sinh dưỡng nào đó của sợi phân chia đọc và sau đó tế bào non mới hình thành tiếp tục phân chia tạo nhánh bên

1.2.2 C ấ u tạo tế hào

M àng tế bào vi khuân lam khá dầy gồm 4 lớp, bên ngoài thường hóa nhầy, có khi tạo thành bao chuyên hóa bao xung quanh tế bào hoặc nhóm tế bào hay toàn bộ

Chất nguyên sinh ở vi khuẩn lam được phân biệt thành 2 phần:

- Phần ngoài tập trung các phiến mỏng quang hợp (lamen), thể ri bô và các thể hạt (hạt chât tê bào) khác

- Phần trong chứa chất nhân (nucleoprotein) Ở giữa ranh giới giữa 2 phần không

rõ ràng chỉ nhận ra khi dùng phẩm Feulgen nhuộm trung bào chất chứa chất nhân

Các chất màu (sắc tố) phân bố trên các lamen ở phần ngoài nên phân này có màu

(xanh đen hoặc xanh lục)

( ’hất màu gôm có: chlorophyll a (có màu lục); phycoxyanin màu lam và

phycoerythrin màu hồng và các dẫn xuất của caroten oxycaroten

Chất dự trữ cua tế bào là glycogen, volutin, không có tinh bột

ngành này thành 3 lớp với nhiều bộ, có người lại chia thành 1 lóp với 4 bộ:

Bộ Chroococcales: Vi khuẩn đơn bào đơn độc hay tập đoàn Tế bào tròn khôngphàn biệt gốc và đỉnh, khônụ có nội và ngoại bào tử

Chroococcaceae) thường gặp như: Chroococcus, Microcvstis

Bộ Dermocarpales: đơn bào

Bộ Pleurocapsales: Vi khuân đa bào dạns sợi đơn, có phân nhánh hoặc không,

sinh sản cách phân chia tế bào hoặc nội bào tư

Các chi điên hình: Cyanocystis, Pleurocapsa

Bộ Hormogonales: đa bào dạng sợi lông, hoặc phân nhánh, thường có tê bào dị

hình, có khi sợi lại tập hợp thành tập đoàn

Các chi điển hình: Nostoc, Anabaena Aphanizomenon,

Tác giả khác lại chia thành 2 bộ: Chroococcales với những dạne đơn bàn hay tập đoàn và H onnogonales với những dạng đa bào

1.2.4 Ý nghĩa th ự c tiễn

Trong thực tiễn, vi khuẩn lam có vai trò tích cực và tiêu cực

Trong nông nghiệp, vai trò quan trọng của vi khuẩn lam là làm tăng độ phì cho

đất nhờ khả năng cố định đạm Hiện nay người ta đã tìm thấy khoảng 50 loài, phần lớn thuộc họ vi khuẩn chuồi (N ostocaceae) có khả năng này Đặc biệt đáng chú ý là loài

Anahaena azollae cộng sinh trong bèo hoa dâu một loại cây dùng làm phân xanh và

l à m t h ứ c ă n g i a s ú c c ó V n g h ĩ a k i n h t ế r ấ t l ớ n ở n ư ớ c t a

T h e o nhiều nghiên cứu c h o thấy, nhờ sự phát triển của vi khuẩn lam trong ruộng

lúa mà hằng năm mỗi hécta đất trồng lúa có thể lấy được thêm từ không khí khoảng 15

- 50 kg nitơ trung bình là 20 - 25 kg đôi khi thu được đến 80 kg hay nhiều hơn nữa

maxima, s platens is được nuôi trồng với quy mô công nghiệp để thu sinh khối nhằm bô suns nguồn protein cần thiết cho chăn nuôi và cho con người

Vi khuẩn lam tích lũv ờ đáy thủy vực, tham gia vào việc hình thành bùn sapropen

được dùng lảm phân bón thức ăn gia súc giàu vitamin, chế biến làm than côc khí hơi

và dùng chữa bệnh

16

Xostoc pnm iform e Đà\ là một loại thực phàm neon và quí đôi với người Truns Ọuôc

giàu protein và vitamin

N uoài ra cùn g với vi khuẩn và các động vật nguyên sinh, vi khuân lam còn dược d ù n g làm sạch sinh học các nguồn nước thai ra từ san xuất côn g nghiệp

V i k h u ẩ n l a m c ũ n e c ó n h ữ n g t á c d ụ n g t i ê u c ự c : k h i p h á t t r i ê n m ạ n h c h ú n g g â y

hiện tượng "nước nở hoa' làm giảm phâm chất của nước, ảnh hưởng tới động vật đáy

và biến đôi hệ sinh thái thủy vực

V i k h u ẩ n l a m í t c ó V n g h ĩ a d i n h d ư ỡ n g đ ố i v ớ i đ ộ n g v ậ t p h ù d u d o c h ú n g c ó c â u

trúc màng nhầy, động vật thường không sừ dụng được và chúnạ thưòng sinh ra độc tô Chỉ có một sổ ít cá sử dụng một số vi khuẩn lam để ăn

1.3 Tình hình nghiên cứu về chlorophyll a trong nuóc và quốc tế

nguồn tự nhiên rất khó khăn do các phản ứng phân hủy như: đề kim loại hóa, đề phytyl hóa, oxi hóa quang hóa, solvat hóa, allomerization và đề metoxycacbonyỉ hóa

thự ánh sáng và biến đồi quang năng thành hoá năng với hiệu xuất cao, quá trình này xảy ra trong hệ quang hợp của thực vật bậc cao, tảo biển và vi khuẩn quang

hợ p.[li.'^.31.32)

o phytvl 1 o phvtyl 2 o phytyl 3

phytvl =

Hình 1.12: Các hợp chất chlorophyll phổ biến trong tự nhiên

Chlorophyll và các dẫn xuất cùa nó là một đổi tượng rất hấp dẫn cho các nghiêncứu lý thuyết hóa hữu cơ như cấu trúc điện từ tính thơm, quá trình chuyển dời điện tử,

cũng dạt dược những thành tựu to lớn l|U8 |Q-32!

17

C Á c ế C r ' " i T 7

T r o n ơ n u ó c : Hoá học chloroph\ 11 là một lĩnh vực rất rộng lớn và lâu đời trên thế giới do n h ữ n a tính chât hóa học và ứnụ dụntỉ đặc biệt của nhóm hợp chất này Tuy nhiên vàn đê này còn rất mới mẻ ỏ' Việt nam Chlorophyll và các dần xuất cua chú ne được sử đụn« rất rộ nu rãi trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, mỹ phẩm, công nghệ

nano và điều trị unsỉ thư *2-4-5' Vi vậy việc đặt nền móng cho Hoá học Chlorophyll là

V ấn đề cấp thiết, nó có V nghĩa lớn về mặt khoa học cũng như ứng dụng thực tiễn rất

p h o n g phú và rất gần gũi với cuộc sống

Q uang trị liệu các bệnh uns, thư là một ứng dụng quan trọng của các dẫn xuât

c hlorophyll dựa trên sự khu trú có chọn lọc trên khối u và sân sinh ra oxy ở trạng thái

singlet đê phá hủv các tế bào ung thư Chlorophyll và các dẫn xuất của nó hấp thụ ánh s.áng có bướ c sóng khoảng 650 nm nên ánh sáng dễ dàng xuyên qua các tế bào mô

K hi được chiếu xạ, các dẫn xuất chất này chuyển lên trạng thái kích thích triplet (N ăng

1 ượno kích thích với chlorophyll ữ E = 29 kcal/mol) sau đó năng lượng này được

c h u yển sa n g cho oxy để sản xuất oxy ờ trạng thái kích thích singlet (E = 22.5 kcal/ moi) O xv ở trạng thái singlet là một chất oxy hoá hiệu quá dẫn đến sự hình thành các

th àn h tổ rất hoạt động như anion gốc, gốc hydroxyl và hvdroperoxide các gôc hoạt

độno này sẽ đi vào phản ứng trực tiếp với các phân tử hữu cơ cùa các tê bào ung thư

C ác iỉốc tự do phản ứng dây chuyền để phân huỷ màng lipit cùa các tế bào dẫn đên phá

h u y các tế bào ung thư Một sổ chlorin rất quan trọng được sử dụng cho quang trị liệu

p h á p quang đã được sử dụng để điều trị các khối u ác tính của da tuyến vú màng nhây

c ủ a các khoang miệng, lưỡi, môi dưới, thanh quản, dạ dày, phổi, ruột non bàng quang

> * + ' [1 1 1 3 1 4 1 6 17.22.23.24.25,34]

v à t r ự c t r à n g J

18

6 0 6 7 2

metyl pheophobide a chlorin e 6 - trimethylester

c35H36N4o5592.69 pheophobide a

Hình 1.13: Các hoạt chất sử dụng để chữa trị ung thư bằng liệu pháp quang

1.5 Sinh tổng họp chlorophyll a

Quá trình sinh tống lụyp chlorophyll trải qua 4 giai đoạn:

Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic

Sinh tổng hợp vòng pyrol từ axit 5-aminolevulinic

Tone hợp hệ 4 vòng tetrapyrol

Quá trình đưa M g 2+ vào hệ thống vòng

1.5.1 Sinh tống họp axit 5-aminolevulinic

<♦ Sinh tổng họp axit 5-aminolevulinic từ glyxin và succinyl-CoA

Sử dụng phản ứng của glyxin với succinyl-CoA dưới tác dụng của enzim axit 5-aminolevulinic xảy ra trong động vật, nấm men và một số vi khuẩn

19

Hình 1.14: Sin It tông hợp axit 5-aminolevulinic từ glycine và succinyl-CoA

*1* Sinh tổng họp axit 5-aminoỉevuIinic từ axit glutamic.

Cơ chat của quá trình sinh tổng họp là glutamic xảy ra trong thực vật bậc cao, rêu, khuân lam và nhiêu vi khuân khác

Đầu tiên, axit glutamic được hoạt hóa bằng cách gắn với A R N t0lu tạo thành glutam yl-A RN | với sự có m ặt của A TP và M g2+ Sau đó glutamyl-ARN, bị đehiđro dưới tác dụng của N A D P tạo thành glutam at-l-anđehit Cuối cùng là quá trình đeamin hóa tạo thành axit 5-aminolevulinic

t-5 -a m in o ­ levulinic axit

Hình 1.15: Sinh tông hợp axit 5-aminolevuỉinic

1.5.2 Sinh tổng họp pyrol (porphobilinogen)

Sinh tổng hợp chlorophyll từ axit 5-aminolevulinic đến uroporphyrinogen III tớiprotoporphyrin IX tương lự như sinh tổng hợp hemoglobin ờ người và chuột

Liên kết C-C và C-N trong vòng pyrol được hình thành dưới tác dụng của enzim

axit 5-aminolevulinic bị đehiđrat tạo ra liên kết không đối xứng và ngưng tụ với nhau

20

Hình 1.16: Sinh tổng hợp vòng pvrol

Sau đó porpobilinogen bị đeamin hỏa và 4 vòng pyrol kết hợp với nhau tạo

h y d ro x y m e th y lb ila n e

Hình 1.17: Sụ' tạo tlíành íeírapyroỉ

1.5.3 Q u á tr ìn h đ ó n g v ò n g của 4 vòng pyrol (te tra p y ro l)

Hình ì 18 mô tả quá trình đóng vòng của tetrapyrol Nhóm metylen của vòng pyrol I ngưng tụ với vị trí a của vòng pyrol IX và tạo thành uroporphyrinogen III

Hình 1.18: Đóng vòng tetrapyroỉ

21

Hình 1.19 cho ta thấy uroporphvrinoíien III bị đecacboxvl hoá tạo thành coproporphyrinogen III Phán tư mới tạo thành tiêp tục bị đecacboxyl: chuvên nhóm propionyl thành nhóm vinyl để tạo thành phân từ protoporphyrinogen IX Phản từ này

lụi tiẻp tục bị oxi hoá tạo thành nối đôi liên hợp trong vòng protoporphvrin IX và kêt thúc quá trình đóng vòng của tetrapvrol.122' 1

e o p r o p o r p h v n n o y e n III

Hình 1.19: Quả trình tạo thành protophyrin IX

1.5.4 Đ ư a ion M g 2+ vào hệ t h ố n g vò n g

Quá trình hình thành chlorophyll bằng việc đưa ion M g2+ vào vòng

ìmonometyleste hóa bên nhóm propionic của vòng III đế chuẩn bị cho phản ứng tạo

vò nu V Kết thúc quá trình là sự tạo vòng cacboxyclic V dưới tác dụng của enzym

■cyclase sau đó là quá trình devinyl hóa khử hóa chọn lọc và phytyl este hóa tạo thành

chlorophyll a

22

_ i • vr M e p ro to p o rp h y rin o a e n IX

p ro to p o rp h y rin IX M o p ro to p o rp h v rin o g e n IX m o n o m e tln ie stc r"

c h lo ro p h y llid c a c h lo ro p h y ll a

Hình 1.20: Quả trình hình lliànlĩ chlorophyll a1'0' ™ ' 3*1

1.6 Tổng họp toàn phần chlorophyll a theo Woodward

W oodward tông hợp chlorophyll vào năm 1960 là một sự đóng góp vô giá trong lĩnh vực tổng hợp hữu cơ Q uá trình này chỉ được áp dụng cho chlorophyll a mà không phải là phương pháp chung cho tổng họp các hợp chất tương tự vì vậy bài toán tông hợp toàn phần chlorophyll a vẫn còn là một trong những bài toàn khó khăn nhất cùa Hóa hữu cơ

di vinyl p ro to c h lo ro p h y ll ide a m o n o v in v l p ro to c h lo ro p h v llid e a

Chlorin e6- trimetylester được tạo thành bởi 46 bước từ các pyrol khác nhau Con đường tổng họp đặc thù từ liên kết giữa hai nửa của bicyclic pyrol AD 14 và BC

cho sự hình thành chlorin trone quá trình tổng hợp đó là quá trình đông phân hóa giữa porphyrin thành chlorin duy nhất được quan sát cho đến ngày nay

lần đầu tiên được tiến hành nghiên cứu bời H Fisher và đã được cải thiện bởi

K M Smith, p Hynninen và F.-P Montforts

Cuối cùng là đưa ion M g2+ vào hệ thống vòng được tìm ra bởi Eschemoser

24

CHU ONG 2: T H ự C N G H I Ệ M

2 1 M ụ c tiê u t h ự c n g h iệ m

X â) d ự n g q u y trình tá c h chiết chlorophyll a từ vi k h u ẩ n lam , c h u y ể n h o á th à n h

c á c dán x u â t của chlo ro p h y ll a làm c h ất tru 11? s ia n và cuối c ù n g c h u y ể n h ó a th ả n h

Phô lions; n a o ạ i c ủ a các c h ất ở d ạ n g ép viên vói K B r trê n m á y Im p a c t 4 1 0 -

N icolet ho ặ c đ ư ợ c đo trên m á y GX - P e rk in E lm e r - U S A tại các đ ơ n vị: V iệ n H o á h ọ c

- thuộc V iệ n H à n lâm K h o a họ c và c ô n g ng hệ V iệt N a m , k h o a H o á h ọ c tr ư ờ n g đại học

k hoa học tự' n h iê n - Đ ại h ọ c qu ốc g ia H à Nội

c\ Phổ cộn g h ư ở n g từ h ạ t nhân

Phố c ọ n ? h ư ở n g từ hạt nhân 'l l - N M R đ u ợ c đo trên m á y B ru k e r U ltra s h ie ld T M

5 00 tại phòníi thí n g h iệ m p h â n tích tru n g tâm , trư ờ n g đại h ọc k h o a h ọ c tự n h iê n T P

I ÍC M D u n g môi là C D C I3, c h ất ch u ẩn nội là T M S

(if Phô k h ố i (M S)

Phổ khối c ủ a các h ọ p c h ất d ư ợ c đo trên m á y L C - M S ( O B B I T R A P - X L - U S A )

lạ i khoa H ó a học Irường, đại học k h o a h ọ c tự n hiên - Đại h ọ c q u ố c g ia H à N ộ i v à tại

V iệ n I làn lâm K h o a học và c ô n g n g h ệ V iệt N am

L" Phô từ n goại

Phố tử ngoại của các hợ p c h ất đ ư ợ c đo trên m á y U V -2 4 5 0 c ủ a N h ậ t với d u n g

m ô i T H F (te tra h v d ro fu ra n ), tại khoa H o ả họ c trư ờ n g đại h ọ c k h o a h ọ c tự n h iê n - Đại

lliọc quốc £>ia Mà N ộ i

b: H 2S 0 4

H ình 2.1: Chuyên ỉioá ch loroph yll a thành p h eo p h ytỉn a

a X ây d ự n g (Ịui trình ch iết tách ch loroph yll n từ' vi khuẩn lam

C h o lOOg vi kh u ẩ n lam v à o bình cầu 1 lit, sau đó th ê m vào h ỗ n h ợ p 4 0 0 m l a x eto n

rỏi dem đun hồi lưu 2h tro n g bó no tối Hỗn họ p sau p h ả n ứ n g đ ư ợ c lọc lấy d ịc h b ằ n g

giấv lọc b ă n g xanh , rử a b ằ n g axeton D ịch lọc có ch ứ a ch lo ro p h y ll a đ ư ợ c cô q u a y để

loại bỏ dune; môi Khi đó phần cận thu d ư ợ c bao g ồ m c h lo ro p h y ll a, caro ten ,

tiling môi C H2C l2/A x e to n = 10:0,4

H ỗ n h ợ p sau k h u ấ y đ ư ợ c đổ vào 30 0m l n ư ớ c, ch iết b à n g 2 0 0 m l C H2C12 Cô

q u a y dịch c h iết để loại bỏ d u n g môi L à m k h ô p h ầ n rắn thu đ ư ợ c v à tá ch b ằ n g sắc kí

CỘI (S ilic ag e n , C H ọ C V A x e to n = 10:0,4) Sản p h ẩ m đ ư ợ c k ế t tinh b ằ n g C H2C l2/n- peiilan

26

2.3.1.2 P h a n m i g d m y v n hon chlor ophyl l ( / t h à n h metvl p h e o p h o b k l e ơ ( M P P )

a: Axeton reufux 2h b: Cl l30 H / H 2S 0 4 5%

Jlinh 2.2; C huyển lioá ch loroph yll a thank in e ty lp h e o p h o b id e a

♦> Q uy trình I

T h ự c hiện quá trình n h ư 2.3.] 1 để Ihu đ u ợ c hỗn h ọ p cặn c h ứ a chlorophyll a L à m

Dem khuây hỗn h ợ p tro n g b ó ng lối 20h Sau đó h ỗ n hợp sau p h ả n ứ ng dượ c th ê m 2 0 0m l

c n c i2 , 3 00 m l n ư ớ c, 60ml N a H C 03 10% Sau đó chiết với C H2CI2 Dịch ch iết đ ư ợ c rửa lại b a n s H 20 (3 X 200m l), sau dó đượ c cô quay để loại bỏ d u n g môi, làm khô cặn

tlirợc melyl pheophobiclea Sản p h ẩ m đ ư ợ c kết ti nil b a n g C H2CI2/ C H3OH

2.3.2 NíỊÌtiẽn cứu (ỊIIá trình ch iết tách ch lo ro p h yll a từ vi khuẩn lam và ch uyên hóa h ire liếp Ihànli tncíyi p h eo p h o rb id e a bằng p h ư ơ n g p h á p ch iết và ch u yển vị estc m ột ÍỊÌÍÙ đoạn.

27

metyl pheophobide a

W illi 2.3: C h uyên liotí trự c (iếj> thành m etylph eoph obide a tù' vi khuẩn lam

*** Q uy trình 2

C ho lOOg vi k h u ẩ n lam v ào bin h cầu d u n g lích 500 ml T h ê m v à o đó 300m]

C l l ; 0 l l , 15mỉ Il->SO,| dặc, k h u ấ y h ỗ n h ọ p tro n g b ó n g tối 3-5h Sau dó đ e m lọc hồn

hop b a n g giấy lọc b ă n g x a n h , rửa hỗn h ọ p bằne; C H2CI2 D ịch lọc th u đ ư ợ c đ ư ợ c thêm

200ml C H2CI2, 5 0 0 m l H2O, 180nil N a H C 0 3 Sau đó dem ch iết v ó i C H 2C12 D ịc h chiết

tlirọc rửa lại b ả n g H->0 (3x 3 0 0 m l), rồi dem cô quay dể loại bỏ d u n g m ôi và làm khô

Hình 2.4: Chuyên hoủ m etylpheophobide a thành chiorin e6- trim etyỉester

Lấy 151.6 m g M etylpheophobide hoà tan trong 10ml THF Sau đó thêm 100ml

lối trong vòng 3h trong quá trình khuấy kiếm tra bằng sắc kí bản mòng (C H2C l2/EtO Ac = 7 :l)

Sau đó, th ê m 400 m l H20 , chiết với 200ml C H2C12, rồi rửa lại dịch c h iế t bằn g

H 20 ( 4 x 200m l) Dịch chiết đượ c cô quay để loại bỏ dung môi và làm khô

Sản phẩm được tinh chế bàng sắc kí cột (C H iC h/E tO A c = 7:1) và kết tinh bàng

2.4 X ác đ ịn h c ấ u t r ú c các sản p h ẩ m b ằ n g p h ổ h ồ n g ngoại, t ử ngại và k h ả kiến,

'H - N M R (500 M Hz, C D C I3): ô 132R [132S] = - 1.61 ppm [- 1.43] (s, br 1H

N H ), 0.57 (s br 1H N H ), 0.78 - 0.88 (br, 12H 4C H 3, chuỗi p h y t y l ), 1.20 - 1.30 (br, 21H, CH, C H 2 chuỗi phytyl), 1.69 (s, 3H, C H3-CH= chuỗi phytyl), 1.72 (t, 3J = 7.50

29

Hz 3H C H 3, 8-), 1.81 (d 3J = 7.50 Hz 3H C H 3, 181), 2.10 - 2.60 (m 4H 2C H 2, 17'

và 172) 3.26 (s 3H CH., 7 1), [3.38] 3.41 (s 3H C H 3 2 1) [3.68] 3.71 (s, 3H CH;„ 12') 3.70 (q 'J = 7.50 Hz 2H C I K 81) 3.90 (s 3H C H 3 132) 4.20 - 4.25 (m, 1H

CH 17) 4.4 - 4.49 (ill, 3H, CH C H k C H2-C H =C -C H 3 chuỗi phytyl và 18) 5.14 (t -J

= 6.00 Hz 1H CH C H2-C H = C -C H 3, chuỗi phytyl), 6.20 (d 3J = 11.50 Hz CIS - vinyl,1H = C H 2, 32 ), 6.28 (s 1H CH, 132), 6.31 (d, 3J = 17.50 Hz, tram - vinyl 1H = C H 2, 32) 8.00 (dd ’J = 11.50 Hz, CIS - vinyl, 3J - 17.50 Hz tram - vinyl 1H, =CH , 3 1).18.48] 8.55 (s 1H, meso proton), [9.35] 9.41 (s, 1H meso proton), [9.49] 9.53 (s 1H meso proton) -

M S : M +=871

2.4.2 Cẩu trúc của metyl pheophobide a

R f : 0.57

c = 0 este) 1790.92 (s, c = 0 este), 1618.52 (m, c = c , vòng thorn) 1437.52 (w),

1214.76 (s C-O-C, este), 1164.63 ( s, br, C-O-C, este), 980.85 (w), 897.31 (w) 746.95

(w).-UV/ VIS (THF): X m JexlO 3) = 410 (106.05), 610.0 (7.87), 667.5 (48.86).-

'H - N M R (500 MHz, CDC13): 5 132R [132S] = - 1.61 ppm f- 1.431 (s, br, 1H NH), 0.54 [0.86] (s, br, 1H NH), 1.8 (t, 3J = 7.50 Hz, 3H, C H 3, 82), 1.82 (d 3J = 7.50

Hz, 3H, C H 3, 181), 2.10 - 2.70 (m, 4H, 2C H 2, 171 và 172), [3.20] 3.25(s, 3H C H 3, 7 1),

3.39 (s, 3H, CH3, 2 1), 3.59 (s, 3H, C H 3, 12 1), 3.66 (q, 3J = 6.50 Hz, 2H, C H 2, 81), 3.70 (s 3H C H 3, 174) [3.84] 3.89 (s 3H, C H 3, 153), 4.21 (m, 1H CH 17), 4.46 (q, 3J = 5.5

Hz 1H CH 18) 6.20-6.28 (d 3J = 11.50 Hz, cis - vinyl = C H 2 32) 6.28 (s 1H CH 132) 6.30 (d 3J = 17.50 Hz tram - vinyl, 1H =C H 2 32), 7.98 (dd, 3J = 11.50 Hz CIS -

vinyl, 3J = 17.50 Hz, Irons - vinyl, 1H, =CH, 3 1), [8.52] 8.59 (s 1H, meso proton), [9.35J 9.41 (s 1H meso proton), [9.49] 9.54 (s 1H, meso proton).-

(s hr c = o este) 1595.96 (m C - C vòng thơm) 1437.98 (m) 1236.12 (m br C - 0 - C) 1 165.90 (m) 1063.51 (m) 893.82 (w) 845 (w).729.99(vv).-

'ỉ l - N M R (500 MHz CDC13): Ỏ = - 1.47 ppm (s br 1H NH) -1.29(s br 1H

N il) 1.71 (t -J = 7.50 Hz 3H C H 3 82), 1.77 (d, 3J = 7.30 Hz, 3H C H 3 181) 2.18 - 2.22 (m 4H 2 C'H2 17' và 172) 3.29 (s 3H, C H 3 7') 3.46 (s 3H C H 3 2 1) 3.57 (s :>H C H 3 121), 3.63 (s 3H C H 3 174), 3.78 (q 3J = 7.50 Hz 2H C H 2 81) 4.26 (s 3H CM;, 15'), 4.44 (q, 3J = 7.00 Hz, 1H CH 18) 5.25 (d, 1H 2J = 19.00 Hz C H 2 151)

5.33 (d 1H, 2J = 19.00 Hz, C H 2, 151), 6.15 (d, 3J = 11.50 Hz, cis - vinyl, 1H =C H 2 32 ), 6.36 (d 3J = 18.00 Hz, tram - vinyl, ỊH , = C H 2, 32), 8.08 (dd, 3J = 11.50 Hz CIS -

vinyl 3J = 17.50 Hz, tram - vinvl, 1H, =CH, 3 1), 8.74 (s, 1H, meso proton) 9.56 (s IlH meso proton) 9.87 (s, 1H meso proton), 9.69(s, 1H meso proton)

M S: M += 638

31