BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI          THÂN THỊ HOA ðÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ENZYME LIPASE VÀ PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG Bacillus VÀ NHÂN DÒNG GEN SINH PROTEASE CỦA CHỦNG DSM13 CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ : 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS. NGUYỄN THÀNH TRUNG GS.TS. NGUYỄN QUANG THẠCH HÀ NỘI - 2013 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc. Học viên Thân Thị Hoa Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN Luận văn này ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Vi sinh và Sinh học phân tử, Khoa Công nghệ Sinh học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. ðể hoàn thành ñược luận văn này tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự ñộng viên, giúp ñỡ của nhiều cá nhân và tập thể. Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới GS.TS Nguyễn Quang Thạch và TS. Nguyễn Thành Trung người ñã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn thày PGS.TS Nguyễn Thị Phương Thảo, TS nguyễn văn Giang ,Th.s Trần Thị ðào, Ks Nguyễn Tràng Hiếu,Ks. Nguyễn Khắc Hải, Ks. ðỗ Hải Quỳnh ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn ñến Ban Giám hiệu, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học, Ban Quản lý ðào tạo sau ñại học, các Thầy Cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, ñã tạo mọi ñiều kiện và giúp ñỡ tôi trong suốt 2 năm học tập và nghiên cứu. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc ñến gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp ñã luôn ñộng viên và khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 12 tháng 11 năm 2013 Học viên Thân Thị Hoa Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC ĐỒ THỊ viii DANH MỤC VIẾT TẮT ix TÓM TẮT 1 MỞ ðẦU 3 1. Đặt vấn đề 3 2. Mục đích, yêu cầu của đề tài 5 2.1. Mục đích của đề tài 5 2.2. Yêu cầu của đề tài 5 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 1.1. Vi khuẩn Bacillus 6 1.1.1. Đặc điểm chung 6 1.1.2. Phân loại khoa học 6 1.1.3. Hệ enzym của Bacillus 11 1.2. Lipase 11 1.2.1. Giới thiệu 11 1.2.2. Cấu trúc lipase 11 1.2.3. Cơ chế phản ứng và tính đặc hiệu của lipase 12 1.2.4. Các nguồn thu nhận enzyme lipase 14 1.2.5. Ứng dụng của lipase 15 1.3. Protease 20 1.3.1. Tính chất, đặc điểm của protease 20 1.3.2 Các nguồn thu nhận enzyme protease 22 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính của enzyme protease [1, 9, 10, 13] 25 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv 1.3.4. Ứng dụng của protease 27 1.3.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease trong sản xuất ở Việt Nam 29 1.4. Tổng quan về công nghệ DNA tái tổ hợp 30 1.4.1. Giới thiệu chung 30 1.4.2. Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất enzyme 30 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 32 2.1.1. Đối tượng và vật liệu 32 2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 36 2.2. Phương pháp nghiên cứu 36 2.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase và protease của các chủng Bacillus 36 2.2.2 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme lipase 37 2.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease 39 2.2.4. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn 42 2.2.5. Xác định các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme 43 2.2.6. Khảo sát hoạt tính của enzyme protease 45 2.2.7 Tách chiết DNA genome từ chủng DSM13 45 2.2.8. Thu gen mục tiêu bằng phản ứng PCR 46 2.2.9. Tạo vector tái tổ hợp mang gen sinh protease 47 2.2.10. Biến nạp vector tái tổ hợp vào E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt 48 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 3.1. Tuyển chọn chủng Bacillus có khả năng sinh enzyme lipase và protease cao 49 3.2. Xác định hoạt độ lipase và protease 51 3.3. Xác định đường cong tăng trưởng: 55 3.4. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme 57 3.4.1. Nguồn cơ chất cảm ứng 57 3.4.2. Nồng độ cơ chất 60 3.4.3. pH của môi trường cảm ứng 61 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v 3.4.4. Thời gian nuôi cấy 62 3.4.5. Nhiệt độ nuôi cấy 63 3.5. Khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme protease của DSM13 65 3.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt đông của protase 65 3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng PH đến hoạt tính protease 66 3.5.3 Ảnh hưởng của các chất ức chế hoạt động của protease 67 3.5. Tách chiết DNA genome từ chủng DSM13 68 3.6. Nhân đoạn gen sinh protease bằng PCR 68 3.7. Nhân dòng gen mã hóa protease trong vi khuẩn E.coli DH5α 70 3.8. Giải trình tự gen Vpr 70 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 75 1. Kết luận 75 2. Đề nghị 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1. Tóm tắt các loại phản ứng của lipase 13 Bảng 2.1: Các chủng Bacillus 32 Bảng 2.2: Danh mục máy móc sử dụng trong đề tài 33 Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật 34 Bảng 2.4: Môi trường cảm ứng sinh lipase và protease 34 Bảng 2.5. môi trường khảo sát hoạt tính lipase và Protease 35 Bảng 2.6: Bảng hóa chất xác định hoạt độ lipase 38 Bảng 2.7: Nồng độ đường chuẩn tyrosine 40 Bảng 2.8: Tóm tắt các bước thực hiện 41 Bảng 3.1 : Hoạt tính enzyme lipase và protease của các chủng Bacillus 49 Bảng 3.2: Hoạt độ lipase của các chủng Bacillus 52 Bảng 3.3: Hoạt độ protease của các chủng Bacillus 53 Bảng 3.4: Đường cong sinh trưởng của chủng TH6 56 Bảng 3.5: Đường cong sinh trưởng của chủng DSM13 56 Bảng 3.6.Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng đến sự sinh tổng hợp lipase của 2 chủng TH6 và DSM13 58 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng đến sự sinh tổng hợp lipase của 2 chủng TH6 và DSM13 59 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến sự sinh tổng hợp lipase của 2 chủng TH6 và DSM13 60 Bảng 3.9: Ảnh nhưởng của pH đến khả năng sinh lipase và protease của 2 chủng TH6 và DSM13 61 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng sinh enzyme lipase và protease của 2 chủng TH6 và DSM13 63 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme lipase và protease của 2 chủng TH6 và DSM13 64 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt đông của enzyme protease 65 Bảng 3.13 : ảnh hưởng của pH đền hoạt động của protease 66 Bảng 3.14: Ảnh hưởng cảu chất ức chết đến hoạt động của enzyme protease 67 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 : Cấu trúc lipase……………………………………………………….12 Hình 1.2: Cấu trúc 3D của lipase 12 Hình 1.3: Phản ứng thủy phân triacylglycerol của enzyme lipase [23] 12 Hình 3.1: Hoạt tính lipase của các chủng Bacillus 50 Hình 3.2: Hoạt tính protease của các chủng Bacillus 51 Hình 3.3: Chủng TH6 và chủng DSM13 55 Hình 3.4: Genome tổng số của B. licheniformis DSM13 68 Hình 3.5.: Sản phẩm khuếch đại gen sinh protease(Vpr) 69 Hình 3.6: Map vector pJET 69 Hình 3.7: Khuẩn E.coli DH5 α tái tổ hợp 70 Hình 3.8: Vector pJET-Vpr 70 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii DANH MỤC ðỒ THỊ STT Tên ñồ thị Trang Đồ thị 3.1: Hoạt độ lipase của các chủng Bacillus 52 Đồ thị 3.2: Hoạt độ protease của các chủng Bacillus 54 Đồ thị 3.3: Đường cong sinh trưởng của TH6 56 Đồ thị 3.4: Đường cong sinh trưởng của chủng DSM13 57 Đồ thị 3.5.Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng đến sự sinh tổng hợp lipase của 2 chủng TH6 và DSM13 58 Đồ thị 3.6: Ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến khả năng sinh enzyme protease của 2 chủng TH6 và DSM13 59 Đồ thị 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến sự sinh tổng hợp lipase của 2 TH6 và DSM13 60 Đồ thị 3.8: Ảnh hưởng pH đến khả năng sinh lipase và protease của 2 chủng TH6 và DSM13 62 Đồ thị 3.9: Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng sinh enzyme lipase và protease của chủng TH6 và DSM13 63 Đồ thị 3.10Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh lipase và protease của 2 chủng TH6 và DSM13 64 Đồ thị 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt đông của enzyme protease 65 Đồ thị 3.12: ảnh hưởng của pH đền hoạt động của protease 67 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ix DANH MỤC VIẾT TẮT B.subtilis Bacillus subtilis B.mesentericus ruber Bacillus mesentericus ruber B.mesenteruicus niger Bacillus mesenteruicus niger B.mesentericus Bacillus mesentericus B.anthracis Bacillus anthracis B.mycoides Bacillus mycoides B.thurigiensis Bacillus thurigiensis B.cereus Bacillus cereus E.coli Escherichia coli PCR Polymerase Chain Reaction OD Optic density mM Millimolar v/v Thể tích/ thể tích w/v Khối lýợng/ thể tích G Gravity (9,8 m/s 2 ) nm Nanometer H 2 O Nước t 0 Nhiệt ðộ Bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid Kb Kilo base Mb Mega base pair NCBI National Center for Biotechnology Information TE Tris – EDTA buffer [...]... n ñ tài “ðánh giá ho t tính enzyme lipase và protse c a m t s ch ng Bacillus và nhân dòng gen protease c a ch ng DSM13 ” s góp ph n tuy n ch n ñư c các ch ng Bacillus sinh lipase và protease m nh ñ b sung vào ch ph m s lý môi trư ng giàu protein và lipit ð tài cũng nghiên c u nhân dòng gen sinh protease có ho t tính cao nh m chu n b cho vi c t o các vi sinh v t tái t h p ch a gen t o protease ph c... d nuôi và d phân l p Tuy nhiên, hi n nay, giá thành protease và lipase cao Do ñó, vi c nghiên c u tìm ra các ch ng Bacillus có kh năng sinh lipase và protease cao là c n thi t Vì v y, ñ tài “ðánh giá kh năng sinh enzyme lipase và protse c a m t s ch ng Bacillus và nhân dòng gen sinh protease c a ch ng DSM13 ñư c th c hi n v i m c ñích ñánh giá kh năng sinh protease và lipase c a các ch ng Bacillus. .. n xu t enzym protease qui mô công nghi p Các n i dung chính sau ñư c th c hi n trong lu n văn này : 1 ðánh giá kh năng sinh protease và lipase c a m t s ch ng Bacillus 2 ðánh giá nh hư ng các ñ u ki n môi trư ng ñ n kh năng sinh enzyme protease và lipase c a ch ng Bacillus sinh protease và lipas cao 3 ðánh giá kh năng ho t ñ ng c a enzyme protease 4 Nhân dòng gen sinh protease c a ch ng DSM13 Trư ng... c ch ng Bacillus có kh năng sinh enzyme lipase và protease ngo i bào cao - Nghiên c u nhân dòng gen sinh protease c a ch ng DSM13 trong E.coli DH5α 2.2 Yêu c u c a ñ tài Xác ñ nh ñư c kh năng sinh enzyme lipase và protease ngo i bào c a m t s ch ng Bacillus, ñánh giá ñư c nh hư ng c a các thành ph n môi trư ng t i kh năng sinh enzyme lipase và protease ngo i bào c a ch ng Bacillus có ho t tính m nh,... cung c p Protease và lipase ñã c i thi n ñáng k hi u qu s n xu t và s n ph m ñư c t o ra nhi u hơn Tuy nhiên giá thành protease và lipase còn khá cao, do ñó cũng h n ch vi c s d ng r ng rãi enzyme trong s n xu t và càng h n ch s d ng enzyme trong x lý môi trư ng [6] Vì v y, vi c ñánh giá ho t tính protease và lipase trong m t s ch ng Bacillus ñ tìm ra ch ng sinh nhi u protease và lipase b sung vào ch... cho th y môi trư ng trung tính hơi ki m (pH 7,0 – 7,5) phù h p cho các ch ng Bacillus Kh o sát kh năng ho t ñ ng c a enzyme protease do DSM13 sinh ra th y protease ho t ñ ng PH ki m (pH =8 )và ho t ñ ng nhi t ñ 600 T ñó, chúng tôi ñã nhân dòng gen sinh rotease trong DSM13 trong E.coli DH5α ð chu n b cho vi c t o ch ng vi khu n tái t h p mang gen sinh protease ph c v cho s n xu t protease qui mô công nghi... y 14 ch ng Bacillus có kh năng sinh lipase và protease ngo i bào, trong ñó ch ng TH6 và DSM13 có kh năng sinh lipase và protease cao Các y u t nh hư ng ñ n kh năng sinh t ng h p lipase và protease ngo i bào bao g m thành ph n môi trư ng nuôi như cơ ch t c m ng,n ng ñ cơ ch t c m ng, pH, nhi t ñ , th i gian nuôi ñã ñư c kh o sát Hi u qu sinh t ng h p lipase và protease ngo i bào ñư c ñánh giá d a trên...TÓM T T Bacillus có kh năng s n xu t các enzyme ngo i bào h u d ng có t m quan tr ng trong công ngh sinh h c Protease và lipase là hai enzyme ñư c s d ng nhi u trong m i lĩnh v c: công nghi p, x lý môi trư ng, y h c, dư c ph m, Hi n nay m t t l l n protease có giá tr thương m i ñư c s n xu t t các ch ng Bacillus Trong các loài vi sinh v t, Bacillus là ch ng có kh năng sinh t ng h p protease và lipase... lipase c a các ch ng Bacillus ñ tìm ra ch ng Bacillus sinh lipase và protease m nh b sung vào ch ph m ñ s lý môi trư ng giàu protein và lipid, cũng như ph c v s n xu t công nghi p các enzym này Lu n văn này t p trung vào nghiên c u kh năng sinh enzyme lipase và protease ngo i bào c a 20 ch ng Bacillus do phòng thí nghi m công ngh vi sinh – khoa Công ngh sinh h c trư ng ñ i h c Nông Nghi p Hà N i cung... Các protease trung tính c a vi khu n ho t ñ ng kho ng pH h p (pH 5-8) và có kh năng ch u nhi t th p Các protease trung tính t o ra d ch th y phân protein th c ph i protease ñ ng v t và tăng giá tr Các protease trung tính có kh năng ái l c cao ñ i v i các amino acid ưa béo và thơm Chúng ñư c sinh ra nhi u b i B subtilis, B mesentericus, B.thermorpoteoliticus và m t s gi ng thu c chi Clostridium Protease . “ðánh giá khả năng sinh enzyme lipase và protse của một số chủng Bacillus và nhân dòng gen sinh protease của chủng DSM13 được thực hiện với mục đích đánh giá khả năng sinh protease và lipase của. sinh protease và lipase của một số chủng Bacillus 2. Đánh giá ảnh hưởng các đều kiện môi trường đến khả năng sinh enzyme protease và lipase của chủng Bacillus sinh protease và lipas cao. 3. Đánh. protease và lipase bổ sung vào chế phẩm là cần thiết . Do đó, việc thực hiện đề tài “ðánh giá hoạt tính enzyme lipase và protse của một số chủng Bacillus và nhân dòng gen protease của chủng DSM13