1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ********* ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐÁP ỨNG CỦA TẾ BÀO ĐA NĂNG DÂY CHẰNG NHA CHU ĐỐI VỚI VẬT LIỆU CALCIUM SILICATE CEMENT (BIODENTINE TM ) SO VỚI AMALGAM NGHIÊN CỨU IN VITRO CHUYÊN NGHÀNH: RĂNG HÀM MẶT MÃ SỐ: 60 06 01 Người thực hiện: TRẦN NGỌC NHƯ Ý THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NĂM 2015 2 MỤC LỤC Danh mục bảng Danh mục hình Danh mục từ viết tắt ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CƠ SỞ CỦA SỰ LÀNH THƯƠNG MÔ NHA CHU 4 1.1.1 Cấu tạo mô nha chu 4 1.1.2 Cấu tạo và chức năng của dây chằng nha chu 5 1.1.2.1 Cấu tạo của dây chằng nha chu 5 1.1.2.2 Chức năng của dây chằng nha chu 6 1.1.3 Những nghiên cứu về vai trò của tế bào dây chằng nha chu trong lành thương mô nha chu 6 1.2 TẾ BÀO GỐC 8 1.2.1 Khái niệm tế bào gốc 8 1.2.2 Đặc tính tế bào gốc 8 1.2.3 Phân loại tế bào gốc 8 1.2.4 Tế bào gốc trung mô 9 3 1.2.4.1 Khái niệm tế bào gốc trung mô 9 1.2.4.2 Hình thái tế bào gốc trung mô 9 1.2.4.3 Một số tế bào gốc trung mô 9 1.2.4.4 Tế bào đa tiềm năng dây chằng nha chu người 10 1.3 QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ VẬT LIỆU SINH HỌC 11 1.3.1 Tính tương hợp sinh học 11 1.3.2 Sự gây độc tế bào 12 1.3.3 Các phương pháp thử nghiệm 12 1.3.3.1 Thử nghiệm tiếp xúc trực tiếp 12 1.3.3.2 Thử nghiệm sự khuếch tán qua agar 12 1.3.3.3 Thử nghiệm dịch chiết 13 1.4 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 14 1.4.1 Biodentine (Calcium silicate cement) 14 1.4.1.1 Thành phần cấu tạo 14 1.4.1.2 Tính chất vật liệu 15 1.4.1.3 Những nghiên cứu về độc tính của Biodentine trong nha khoa 16 1.4.2 Amalgam 18 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 20 4 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 21 2.2.2 Phương tiện nghiên cứu 21 2.2.2.1 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 21 2.2.2.2 Hoá chất 21 2.2.3 Các bước tiến hành nghiên cứu 22 2.2.3.1 Cấy chuyển và xác định mật độ tế bào 22 2.2.3.2 Chuẩn bị vật liệu tạo giá thể 25 2.2.3.3 Phương pháp đánh giá độc tính in vitro của vật liệu đối với tế bào dây chằng nha chu 25 2.2.3.4 Phương pháp đánh giá sự tăng sinh tế bào trên bề mặt vật liệu. 27 2.2.3.5 Phương pháp đánh giá hình thái tế bào trên khối vật liệu bằng cách chụp ảnh SEM 28 2.2.4 Biến số nghiên cứu 29 2.2.4.1 Biến số độc lập 29 2.2.4.2 Biến số phụ thuộc 29 2.2.5 Thu thập, xử lý và phân tích số liệu 30 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ DỰ KIẾN 32 LỢI ÍCH CỦA ĐỀ TÀI 34 5 ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các mức độ phản ứng trong thử nghiệm tiếp xúc trực tiếp và khuếch tán qua agar 13 Bảng 1.2. Các mức độ phản ứng trong thử nghiệm dịch chiết 14 Bảng 1.3. Thành phần cấu tạo của Biodentine 15 Bảng 2.4. Một số dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 21 Bảng 3.5. Mức độ độc tính sau 24 giờ theo tiêu chuẩn ISO 10993 32 Bảng 3.6. Giá trị trung bình mật độ quang ở bước sóng 450 nm 32 6 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo mô nha chu 4 Hình 2.2. Buồng đếm tế bào 24 Hình 2.3. Nguyên tắc phương pháp MTT 27 Hình 2.4. Sơ đồ minh hoạ tế bào bám trải trên bề mặt vật liệu 29 Hình 3.5. Tế bào bám trải trên bề mặt vật liệu 33 7 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT PDLSCs Periodontal ligament stem cells DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium FBS Fetal bovine serum DMSO Dimethyl sulfoxide PBS Phosphate Buffered Saline EDTA Ethylene Diaminetetraacetid Acid MTT 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-YL)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide ml Mililitre mm Milimetre mM Milimol nm Nanometre OD Optical Density SEM Scanning electron microscopy RT- PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction ARN Ribonucleic Acid SHED Stem Cells from Exfoliated Deciduous teeth 8 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thực hành nội nha hàng ngày, các bác sĩ răng hàm mặt thường xuyên phải đối mặt với những ca khó dễ dẫn tới thất bại. Khi đó, vi khuẩn và những sản phẩm phụ của nó còn tồn tại trong hệ thống ống tuỷ sẽ thoát ra ngoài và đến mô nha chu để gây bệnh. Phẫu thuật nội nha được chỉ định để loại bỏ những chất độc từ hệ thống ống tuỷ trong trường hợp phương pháp tiếp cận từ trên xuống không khả thi do sự hiện diện của chốt và vật liệu trám vĩnh viễn khác trong ống tuỷ. Quá trình sửa chữa diễn ra trong các mô quanh chóp sau khi phẫu thuật cắt chóp đã được chứng minh [6, 18]. Sự lành thương xương sau phẫu thuật liên quan đến việc tái cấu trúc của bè xương, tái tạo màng xương chức năng và xương vỏ. Sự thành công cuối cùng của phẫu thuật phụ thuộc vào sự tái cấu trúc của một hệ thống bám dính chức năng, bao gồm cement phủ lên bề mặt chân răng cắt bỏ, dây chằng nha chu (PDL), và xương ổ răng [5]. Phẫu thuật cắt chóp kết hợp với trám ngược bằng một vật liệu không những ngăn chặn lối ra của bất kỳ vi khuẩn còn lại hoặc các sản phẩm phụ của nó, mà còn cho phép sự hình thành của một màng nha chu bình thường trên bề mặt bên ngoài của nó [21]. Trước đây, vật liệu nha khoa truyền thống được sử dụng phổ biến để trám ngược là Almalgam. Tuy nó có thể bị bào mòn, gây ra đổi màu mô mềm bên trên hoặc giải phóng kim loại vào trong mô nhưng cho đến nay vẫn được đánh giá cao về sự dung nhận sinh học, đặc tính cơ học chịu nén tốt, ít thay đổi thể tích, độ khít sát cũng như tính an toàn vật liệu. Nhiều loại vật liệu nha khoa thích hợp khác được sử dụng như là polycarboxylate cement, IRM (Intermediate Restorative Material), Super EBA cement (ethoxybenzoic acid), glass ionomer cement, Gần đây, MTA (Mineral trioxide aggregate) ra đời và được chỉ định sử dụng rộng rãi trong nội nha như trám 9 ngược sau phẫu thuật cắt chóp, điều trị thủng sàn, che tuỷ hay trám bít ống tuỷ [12, 23, 28, 33]. Bên cạnh những ưu điểm như khả năng bám dính vào mô răng cao, tính tương hợp sinh học cao, độc tính thấp và đặc biệt là có thể kích thích tái tạo mô, cho phép mô tiếp xúc trực tiếp với vật liệu, MTA cũng bộc lộ một số nhược điểm như thời gian đông lâu, đặc tính cơ học thấp, khó thao tác, khó lưu trữ và giá thành cao. Do đó, những vật liệu mới ra đời và phát triển với những tính năng tương tự nhưng khắc phục được những nhược điểm của MTA đặc biệt là calcium silicate cement (Biodentine) được báo cáo là một trong những vật liệu có tính tương hợp sinh học trong nha khoa hiện nay tức là khả năng của vật liệu có thể tạo ra sự đáp ứng phù hợp của vật chủ. Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu đánh giá độc tính in vitro của calcium silicate cement (Biodentine) như nghiên cứu của Patrick Laurent và cộng sự (2008) được thực hiện trên gen đối với bốn dòng vi khuẩn Salmonella typhimurium, nguyên bào sợi tuỷ răng người và hiệu quả của calcium silicate cement trên chức năng tế bào đích chuyên biệt bởi hoá mô miễn dịch; hoặc trên tế bào tuỷ răng chuột được làm bất tử (OD-21) của Marjorie Zanini và cộng sự (2012); hoặc nghiên cứu của Camila M. Corral Nũnez và cộng sự (2014) đánh giá sự sống của tế bào và biểu hiện ARN thông tin của IL-1α và IL-6 trong tế bào nguyên bào sợi 3T3 (dòng tế bào nguyên bào sợi phôi chuột) khi tiếp xúc trực tiếp với Biodentine và MTA; hoặc Andriara De Rossi và cộng sự (2014) đánh giá tuỷ răng và mô quanh chóp của 60 chân răng chó sau khi thực hiện lấy tuỷ buồng, che tuỷ với Biodentine và so sánh với MTA bởi phim quanh chóp, phân tích mô học, vi sinh. Tuy các nghiên cứu đều cho rằngvật liệu này có tính tương hợp sinh học và có thể được dùng an toàn trên lâm sàng đặc biệt là phục hồi trám các răng sau, che tuỷ trực tiếp, có tiềm năng thay thế vật liệu truyền thống trong phẫu thuật nôi nha; nhưng cho đến nay, chưa có nghiên cứu về đáp ứng sinh học đặc biệt là sự đáp ứng của tế bào đa năng dây chằng nha chu người - quyết định sự lành thương lý tưởng của mô nha chu sau phẫu thuật cắt chóp kết hợp với trám ngược của loại vật liệu này. 10 Câu hỏi nghiên cứu: Có hay không có sự đáp ứng của tế bào đa năng dây chằng nha chu đối với vật liệu Calcium silicate cement (Biodentine TM ) so với vật liệu truyền thống Amalgam? Mục tiêu tổng quát: Xác định sự đáp ứng của tế bào đa năng dây chằng nha chu đối với vật liệu Calcium silicate cement (Biodentine TM ) và Amalgam. Mục tiêu chuyên biệt: 1. Xác định và so sánh mức độ phản ứng của tế bào đa năng dây chằng nha chu (thế hệ tế bào P4) khi tiếp xúc với dịch chiết của Biodentine và Amalgam nhằm đánh giá mức độ độc tính in vitro. 2. Xác định và so sánh trung bình mật độ quang OD của tế bào đa năng dây chằng nha chu khi tiếp xúc với Biodentine và Amalgam nhằm đánh giá khả năng tăng sinh của tế bào bằng phương pháp MTT. 3. Đánh giá hình thái của tế bào đa năng dây chằng nha chu khi tiếp xúc với Biodentine và Amalgam dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM). [...]... Các khối vật liệu được gửi đi chụp SEM tại Viện công nghệ sinh học Việt Nam nhằm đánh giá hình thái tế bào trên khối vật liệu • Nhóm 1: khối vật liệu Biodentine được cấy tế bào đa năng dây chằng nha chu • sau 3 ngày Nhóm 2: khối vật liệu Amalgam được cấy tế bào đa năng dây chằng nha chu • sau 3 ngày Nhóm đối chứng âm: tế bào đa năng dây chằng nha chu bám trên bề mặt đĩa nuôi sau 3 ngày Tiêu chu n đánh... nhất và đợi vật liệu đông cứng (mô phỏng lâm sàng): 6 phút đối với Biodentine và 4 phút đối với Amalgam 2.2.3.3 Phương pháp đánh giá độc tính in vitro của vật liệu đối với tế bào dây chằng nha chu Chia nhóm nghiên cứu thành 4 nhóm: • Nhóm 1: vật liệu Biodentine • Nhóm 2: vật liệu Amalgam • Nhóm đối chứng dương: DMSO (Dimethyl sulfoxide) • Nhóm đối chứng âm: không có vật liệu 31 Mỗi nhóm nghiên cứu sẽ được... loại vật liệu Biodentine và Amalgam Vật liệu Biodentine Amalgam (Nhóm 1) (Nhóm 2) Tế bào đa năng dây chằng nha chu (P3) (Nguồn có sẵn trong Lab-KHTN) TÓM TẮT (giá thể) Tạo khối PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Cấy chuyền tế bào từ P3P4 Đánh khối vật liệu sau 1, bào 7, 9 bề mặt Đánh giá độc tínhin vitro của ánh giáqua tăng sinh của tế bào trêngiá hình thái của tế 3, 5, trên ngày khối vật liệu sau 3 vật liệu sự... 2.2.3 Các bước tiến hành nghiên cứu 2.2.3.1 Cấy chuyền và xác định số lượng tế bào Nguồn tế bào đa năng dây chằng nha chu người thế hệ tế bào P3 được cấy chuyền đến thế hệ tế bào P4 (các tế bào đạt độ đồng nhất về hình dạng) để chu n bị thử nghiệm đánh giá độc tính của vật liệu lên tế bào và tăng sinh của tế bào trên vật liệu Theo dõi sự tăng sinh của các tế bào đến khi chúng trải thành một lớp đơn phủ... thể nha chu của bề mặt chân răng bị cắt rời Để hiểu rõ vai trò của các tế bào trong quá trình tái tạo mô nha chu, Somermanvà cộng sự (1988) đã tiến hành nghiên cứu so sánh các tế bào dây chằng nha chu và các nguyên bào sợi nướu người trong ống nghiệm Kết quả là sự sản xuất protein và collagen trong các tế bào dây chằng nha chu lớn hơn đáng kể so với các nguyên bào sợi nướu Ngoài ra, các tế bào dây chằng. .. thương mô nha chu Melcher và cộng sự (1970) đã đề xuất rằng các tế bào của dây chằng nha chu và tế bào "con cháu" của nó thể hiện khả năng ức chế tạo xương, một quan điểm được hỗ trợ bởi Line, Polson và Zander (1974) và đã tiếp tục đề nghị (Melcher 1976) rằng các tế bào dây chằng nha chu và các tế bào xương có thể ngăn chặn lẫn nhau xâm nhập vào các khu vực tương ứng của chúng Nghiên cứu của Andreasen... xương ổ Sự phân phối của mô sợi và khoáng hoá của mô nha chu khác nhau do cấu tạo protein, các phần tử tế bào, sự khoáng hoá, chuyển hoá và do chức năng của chúng Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo mô nha chu 12 1.1.2 Cấu tạo và chức năng của dây chằng nha chu 1.1.2.1 Cấu tạo của dây chằng nha chu Dây chằng nha chu (màng nha chu) là một mô liên kết chặt chẽ, có nhiều tế bào, nhiều sợi, nằm giữa bề mặt chân răng và... đặc tính đa tiềm năng để biệt hoá thành những loại tế bào khác như nguyên bào xương, tế bào tạo mỡ, tế bào tạo sụn, tế bào tạo thần kinh in vitro Thêm vào đó, PDLSCs có khả năng đặc biệt hình thành xê măng và mô tương tự dây chằng nha chu in vivo Các dữ liệu cho thấy rằng PDLSCs có đủ hai đặc tính của tế bào gốc sinh dưỡng (tế bào gốc trưởng thành có thể tự làm mới và biệt hóa thành các tế bào chuyên... nhóm vật liệu có mức độ độc tính ≤ 2: • Nhóm 1: Bỏ khối vật liệu Biodentinevào đĩa 4 giếng có phủ agar xung quanh khối vật liệu trong giếng Đưa tế bào lên bề mặt khối vật liệu với mật độ 5 x 104 tế bào/ khối 33 • Nhóm 2: Bỏ khối vật liệuAmalgamvào đĩa 4 giếng có phủ agar xung quanh khối vật liệu trong giếng.Đưa tế bào lên bề mặt khối vật liệu với mật độ 5 x 10 4 • tế bào/ khối Nhóm đối chứng âm: Tế bào. .. tính đa tiềm năngcó thể biệt hoá thành những loại tế bào khác nhau như nguyên bào xương và tế bào tạo mỡ in vitro Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng tế bào dây chằng nha chu đa tiềm năng ở người có nguồn gốc từ phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn sinh lý học và công nghệ sinh học động vật thuộc trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh 1.3 QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ VẬT LIỆU SINH . Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ********* ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐÁP ỨNG CỦA TẾ BÀO ĐA NĂNG DÂY CHẰNG NHA CHU ĐỐI VỚI VẬT LIỆU CALCIUM SILICATE CEMENT (BIODENTINE TM ) SO VỚI AMALGAM. Calcium silicate cement (Biodentine TM ) so với vật liệu truyền thống Amalgam? Mục tiêu tổng quát: Xác định sự đáp ứng của tế bào đa năng dây chằng nha chu đối với vật liệu Calcium silicate cement. của mô nha chu sau phẫu thuật cắt chóp kết hợp với trám ngược của loại vật liệu này. 10 Câu hỏi nghiên cứu: Có hay không có sự đáp ứng của tế bào đa năng dây chằng nha chu đối với vật liệu Calcium