ỦY BAN NHÂN DÂN TP HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ SỞ Y TẾ TP HCM BV TRUYỀN MÁU – HUYẾT HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN BCR/ABL GÂY KHÁNG IMATINIB TRÊN BỆNH NHÂN BỆNH BẠCH CẦU MẠN DÒNG TỦY (CML) BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: BSCKII NGUYỄN THỊ HỒNG NGA ĐỒNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS.BS PHAN THỊ XINH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 01/2013 ỦY BAN NHÂN DÂN TP HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN BCR/ABL GÂY KHÁNG IMATINIB TRÊN BỆNH NHÂN BỆNH BẠCH CẦU MẠN DỊNG TỦY (CML) BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 01/2013 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Yếu tố dịch tễ học nguyên nhân bạch cầu mạn dòng tủy Bệnh bạch cầu mạn dòng tủy (BCMDT) chiếm 3% tổng số ung thư giới chiếm 20% bệnh bạch cầu người lớn Tại nước Châu Âu, tỷ lệ mắc bệnh khoảng 1/100.000 dân, nam mắc bệnh nhiều nữ với tỷ lệ nam/nữ 3/2 thường gặp lứa tuổi 40 đến 60 Đa số trường hợp BCMDT khơng tìm nguyên nhân Tuy nhiên, tiếp xúc với chất phóng xạ liều cao làm tăng tỷ lệ bệnh [4] Trong số nghiên cứu nhóm người Nhật tiếp xúc với phóng xạ từ vụ nổ bom nguyên tử thành phố Hiroshima Nagasaki, phụ nữ bị ung thư cổ tử cung điều trị với tia xạ, tần suất mắc bệnh BCMDT cao có ý nghĩa so với nhóm dân số khơng tiếp xúc với tia xạ Sinh bệnh học BCMDT 2.1 Nhiễm sắc thể Philadelphia Thay đổi quan trọng trở thành đặc hiệu cho BCMDT nhiễm sắc thể (NST) Philadelphia (NST Ph), NST 22 có nhánh dài bị ngắn đi, tạo chuyển vị hỗ tương nhánh dài NST nhánh dài NST 22, gọi t(9;22)(q34;q11) (Hình 1.1) NST Ph tìm thấy tất tế bào máu bao gồm tế bào B tế bào T, diện suốt q trình bệnh giai đoạn cấp NST Ph tìm thấy 90% bệnh nhân BCMDT, ngồi cịn gặp khoảng 30% bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) người lớn [25] 3% BCCDL trẻ em [29] 2.2 Các tổ hợp gen BCR/ABL protein BCR/ABL Chuyển vị nhánh dài NST băng q34 nhánh dài NST 22 băng q11 tạo tổ hợp gen BCR/ABL mà exon ABL 9q34 thay exon đầu 5’ BCR (Hình 1.2) [18] Điểm gãy gen BCR 22q11 gồm có vùng minorBCR (breakpoint cluster region), major-BCR micro-BCR mà tùy vào vị trí điểm gãy BCR, tổ hợp gen tạo e1a2, b2a2 b3a2, e19a2 (Hình 1.2) mã hóa dạng tổ hợp protein p190BCR/ABL, p210BCR/ABL p230BCR/ABL tyrosine kinase tương ứng [35] No.9 der(9) No.22 der(22) Ph chromosome BCR gene BCR/ABL gene t(9;22)(q34;q11) 6.0 kbABL gene 7.0 kb 8.5 kb BCR/ABL mRNA ABL/BCR gene ABL/BCR mRNA P145 ABL Họat tính tyrosine kinase (-) P210 BCR/ABL Họat tính tyrosine kinase (+++) 9q34: 22q11: ABL gene BCR gene Hình 1.1: Chuyển vị nhiễm sắc thể t(9;22)(q34;q11) gen liên quan Bệnh nhân BCMDT chủ yếu có điểm gãy vùng major-BCR, nhiên, số trường hợp điểm gãy xảy vùng µ-bcr bệnh cảnh bệnh nhân thường có tăng ưu neutrophil Khoảng 2/3 trường hợp BCCDL, trường hợp BCMDT bạch cầu cấp dịng tủy có điểm gãy BCR vùng minor-BCR Khi đầu 5’ ABL thay gen BCR tổ hợp p210BCR/ABL hoạt tính men tyrosin kinase ABL tăng lên mạnh, làm khởi động nhiều đường truyền tín hiệu bất thường tế bào ras, myc, myb Cent Tel BCR gene (22q11) micro BCR major BCR minor BCR e1 b1 b2 b3 b4 b5 c1 e12 -13 -14 15 16 1b a2 intron Minor BCR/ABL mRNA c4 c5 c6 c7 20 21 22 -23 ## 1a intron c3 # ABL gene (9q34) c2 e17 -18 -19 a1 a3 # splicing exons a2 e1a2 : 198bp b2 a2 b2a2 : 212bp b2 b3 a2 b3a2 : 287bp e1 e1 Major BCR/ABL mRNA e1 e1 b1 b2 e19 a2 b5 e19a2 Hình 1.2: Các vùng điểm gãy tổ hợp gen BCR/ABL 2.2.1 BCR/ABL truyền tín hiệu nội bào Trên bệnh nhân BCMDT hoạt tính tyrosine kinase p210BCR/ABL yếu tố chứng minh gây bệnh Protein p210BCR/ABL tương tác với số yếu tố đường truyền tín hiệu, gắn với phosphoryl hóa 20 protein nội bào có vai trị sinh ung thư Sự tương tác tiểu đơn vị phosphatidylinositol-3’-kinase (PI3K) với p210BCR/ABL cần thiết cho tăng sinh dịng tế bào có BCR/ABL tế bào BCMDT sơ khởi Các mối tương tác thông qua hoạt động BCR/ABL ảnh hưởng nhiều phức tạp đến phân bào protein kinase hoạt hóa [10] Ngồi ra, p210BCR/ABL điều hịa hoạt tính serine-threonine kinase RAF mã hóa Giảm biểu RAF ức chế tăng trưởng tế bào BCMDT phụ thuộc BCR/ABL tăng sinh tế bào gốc tạo máu bình thường phụ thuộc yếu tố tăng trưởng [24] Khả chuyển dạng tế bào BCR/ABL liên quan tới tín hiệu tyrosine kinase, mà gọi protein tiếp hợp (adaptor protein), truyền đến RAS Protein p210BCR/ABL hoạt hóa nhiều đường khác RAS PI3K hoạt hóa liên tục BCR/ABL để tạo lipid inositol bị rối loạn điều hòa polyinositol phosphate ức chế khối u bên BCR/ABL PTEN and SHIP1 CRKL protein cầu nối, có tính tương ứng với sản phẩm sinh ung thư v- crk làm trung gian cho tín hiệu sinh ung thư BCR/ABL Protein p210BCR/ABL liên kết tự nhiên với paxillin qua CRKL tạo phức hợp protein truyền tín hiệu Các phức hợp chứa paxillin talin, vốn phân tử protein quan trọng cho tính bám dính tế bào, giải thích số khiếm khuyết dính tế bào BCMDT Các dịng tế bào có biểu p210BCR/ABL có hoạt tính JAKs STATs, thường JAK2 STAT5 Cả ABL BCR phận điều hòa đa chức họ protein gắn GTP Rho protein gắn yếu tố tăng trưởng Grb2, mà protein gắn tyrosin kinase với RAS hình thành phức hợp với BCR/ABL yếu tố biến đổi nucleotide Sos dẫn đến hoạt hóa RAS [17] Ngồi ra, protein p210BCR/ABL hoạt hóa Jun kinase cần tham gia Jun kinase cho chuyển dạng tế bào Bất thường kết dích tế bào BCR/ABL Ức chế chết theo chương trình Tế bào tăng sinh Hình 1.3: BCR/ABL hoạt hóa đường truyền tín hiệu chủ yếu tế bào ( Nguồn: Lichman MA., 2006) 2.2.2 Ảnh hưởng BCR/ABL lên dính tế bào Các tế bào có NST Ph dính với fibronectin chất tủy xương tế bào bình thường khiếm khuyết chức intergrin Protein p210BCR/ABL gắn với actin số protein khung tế bào, tương tác với sợi actin qua vùng gắn với actin làm chuyển động tự nhiên tăng lên, thay đổi màng tế bào, kéo dài sợi actin, tăng tốc độ lồi co lại giả túc bề mặt fibrinonectin Các khiếm khuyết dính (tiếp xúc cố định lại) tế bào nguyên thủy BCMDT tách chúng khỏi tín hiệu kiểm sốt bình thường Các tín hiệu truyền từ tế bào vi môi trường qua cytokine, giữ cân sống chết, tăng sinh biệt hóa tế bào Phosphoryl hóa khơng thích hợp protein khung tế bào yếu tố chủ yếu rối loạn chức integrin tế bào BCMDT [17] 2.2.3 Ảnh hưởng BCR/ABL lên chết theo chương trình Protein p210BCR/ABL ức chế trình chết theo chương trình tế bào cách trì hỗn chuyển qua giai đoạn G2/M chu kỳ tế bào có DNA hư hỏng Tuy nhiên, protein p210BCR/ABL khơng ngăn chết theo chương trình tế bào giết tự nhiên hoạt hóa qua lymphokin chống lại tế bào BCMDT tế bào bình thường Trong giai đoạn tiến triển chuyển cấp, tốc độ chết theo chương trình tế bào chậm G–CSF GM–CSF làm giảm đáng kể tốc độ chết theo chương trình tế bào BCMDT thể bạch cầu đa nhân trung tính [17] Chẩn đoán phân giai đoạn BCMDT Triệu chứng lâm sàng phát triển chậm hầu hết bệnh nhân phát giai đoạn mạn Ngày nay, nhiều trường hợp phát sớm khám sức khỏe định kỳ Lúc đầu, triệu chứng mơ hồ không đặc hiệu Khoảng 70% bệnh nhân có triệu chứng lúc chẩn đoán thường than phiền mệt mỏi, biếng ăn, sụt cân, giảm thể lực, mồ hôi nhiều, bệnh nhân cảm thấy khó chịu, căng tức hạ sườn trái ăn mau no Khám lâm sàng thấy bệnh nhân xanh xao lách to Chẩn đoán BCMDT dựa huyết đồ tủy đồ Trên huyết đồ cho thấy số lượng bạch cầu tăng khoảng từ 20 x 109 /L đến 500 x 109 /L với diện tất giai đoạn q trình biệt hóa bạch cầu hạt từ myeloblast đến segment neutrophil gọi khơng có “khoảng trống bạch cầu”, tiểu cầu bạch cầu ưa kiềm tăng, có thiếu máu đẳng sắc, đẳng bào hồng cầu lưới bình thường đa số trường hợp Tủy đồ cho thấy mật độ tủy giàu với tăng sinh dòng bạch cầu (tỷ lệ tế bào blast < 5%) dòng mẫu tiểu cầu, dòng hồng cầu tăng, bình thường đơi giảm Xác định chẩn đốn BCMDT có diện NST Ph có diện tổ hợp gen BCR/ABL Bệnh tiến triển qua ba giai đoạn: mạn, tiến triển chuyển cấp 3.1 Giai đoạn mạn (Chronic phase) Hầu hết chẩn đoán giai đoạn với triệu chứng điển hình tỷ lệ tế bào blast < 5% Đáp ứng tốt với hóa trị dễ kiểm soát thuốc chống tăng sinh tủy Chất lượng sống không thay đổi nhiều Tử vong giai đoạn hiếm, thường nguyên nhân không liên quan bệnh bạch cầu tác dụng phụ phương pháp điều trị bệnh bạch cầu 3.2 Giai đoạn tiến triển (Accelerated phase): chẩn đốn có nhiều triệu chứng sau đây: + Blast 10 – 19 % máu ngoại vi và/hoặc tủy xương + Bạch cầu đa nhân ưa kiềm 20 % máu ngoại vi + Giảm tiểu cầu kéo dài + Tăng kích thước lách số lượng bạch cầu điều trị + Tiến triển di truyền tế bào Một số trường hợp chuyển cấp sau vài tháng Một số khác có tiến triển chậm phức tạp Thời gian sống trung bình bệnh nhân khoảng năm 3.3 Giai đoạn chuyển cấp (Blast crisis): chẩn đoán có nhiều triệu chứng sau đây: + Blast 20% máu ngoại biên hay tủy + Có tăng sinh blast tủy + Kết tụ đám lớn tế bào blast tủy Giai đoạn có biểu bệnh bạch cầu cấp Bệnh nhân thường bị nhiễm trùng, nhiễm nấm xuất huyết giảm bạch cầu đa nhân tiểu cầu Thời gian sống trung bình giai đoạn khoảng - tháng Rất trường hợp sống năm Có thể chuyển cấp dịng lympho (30%) dịng tủy (70%) Các phƣơng pháp điều trị theo dõi điều trị: Trong phương pháp điều trị BCMDT kinh điển sử dụng thuốc Busulfan, Hydroxyurea, Aracytine Interferon alpha dị ghép tủy xương có dị ghép tủy xương phương pháp có khả chữa lành bệnh khó tìm người cho phù hợp nhiều biến chứng nặng trình ghép gây tử vong [3] Busulfan Hydroxyurea không tạo lui bệnh Interferon alpha kết hợp với Aracytine liều thấp kéo dài thời gian sống toàn đắt tiền có nhiều tác dụng phụ Những nghiên cứu dựa tảng sinh học phân tử chế sinh bệnh thập niên gần đạt nhiều tiến quan trọng, đời Imatinib (IM) BCMDT mơ hình việc điều trị nhắm trúng đích phân tử IM (biệt dược Glivec Gleevec cơng ty Novartis) chất có trọng lượng phân tử nhỏ, dẫn xuất 2-phenylaminopyrimidine, có khả ức chế đặc hiệu hoạt tính tyrosine kinase protein BCR/ABL cách cạnh tranh với ATP việc gắn vào protein này, dùng điều trị BCMDT [19] Năm 1998, IM đưa vào điều trị BCMDT giai đoạn mạn đề kháng không dung nạp với interferon alpha cho tỷ lệ lui bệnh mặt huyết học 95% đáp ứng cao di truyền tế bào 60% [15], nhóm bệnh nhân điều trị interferon alpha đáp ứng mặt huyết học 70% đáp ứng cao di truyền tế bào sau 12 tháng 21% [11] Tháng năm 2001, IM FDA chấp thuận đưa vào sử dụng phương pháp điều trị khởi đầu chuẩn cho bệnh nhân BCMDT chẩn đoán giai đoạn mạn Các tiêu chuẩn đáp ứng mặt huyết học di truyền đánh giá theo bảng 1.1 Bảng 1.1: Các tiêu chuẩn đánh giá đáp ứng điều trị Phân loại Đáp ứng hoàn toàn huyết học (CHR) Đáp ứng tối thiểu (minimal) di truyền tế bào Đáp ứng thấp (minor) di truyền tế bào Đáp ứng phần (partial) di truyền tế bào Đáp ứng hoàn toàn di truyền tế bào(CCR) Đáp ứng cao (major) di truyền tế bào (MCR) Đáp ứng cao phân tử (MMR) Đáp ứng hoàn toàn phân tử (CMR) Tiêu chuẩn Huyết đồ bình thường 66–95% Ph+ metaphases 36–65% Ph+ metaphases 1–35% Ph+ metaphases 0% Ph+ metaphases 0–35% Ph+ metaphases Giảm ≥3-log BCR-ABL mRNA Âm tính với RT-PCR Theo kết nghiên cứu IRIS (International Randomized Study of Interferon and STI571), với IM liều chuẩn 400 mg ngày cho BCMDT giai đoạn mạn, tỷ lệ đáp ứng hoàn toàn mặt di truyền tế bào 69% sau 12 tháng 87% sau 60 tháng có khoảng 7% bệnh nhân chuyển sang giai đoạn tiến triển chuyển cấp năm theo dõi [7] Trong số nghiên cứu khác, bệnh nhân BCMDT giai đoạn tiến triển chuyển cấp điều trị với IM 600 – 800 mg/ngày cho cho tỷ lệ đáp ứng tốt hóa trị liệu Tỷ lệ đáp ứng mặt huyết học mặt di truyền tế bào 71% 21% BCMDT giai đoạn tiến triển [22], 50% 15% BCMDT giai đoạn chuyển cấp [23] A B Bình thường Đột biến Hình 3.2: Hình ảnh trình tự chuỗi DNA cell line K562 (A) bệnh nhân IR-111 (B) đó, bệnh nhân sang khám bệnh Bệnh viện Singapore bác sỹ cho xét nghiệm tìm đột biến BCR/ABL Kết bệnh nhân mang cho bác sỹ Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM tham khảo đột biến xác định E453K (kết BV Singapore trả có đột biến E453K, khơng có hình ảnh) Gen ABL có 11 exon, exon có biến thể với trình tự chuỗi khác gọi exon 1a exon 1b Trong trình tạo thành tổ hợp gen với BCR, từ exon exon đến exon 11 ABL gắn với gen BCR (Hình 1.2) Trình tự chuỗi mRNA ABL người (homo sapiens) tìm kiếm GenBank có kiểu với accession number tương ứng NM_007313.2 (transcript variant b) NM_005157.4 (transcript variant a), tương ứng với khác exon 1a 1b Đối với trình tự chuỗi từ exon đến exon 11 biến thể giống hoàn toàn Vùng ABL kinase khuếch phân tích đột biến trải dài từ exon đến exon 10 ABL nên việc sử dụng trình tự chuỗi chuẩn để phân tích đột biến biến thể a hay b không ảnh hưởng đến kết nghiên cứu Phần mềm SeqScape sử dụng để so sánh trình tự chuỗi DNA bệnh nhân với trình tự chuẩn ABL Những trường hợp dòng mang đột biến chiếm ưu (major clone), sóng alen đột biến thường biểu rõ ràng dễ dàng phần mềm nhận diện có khác biệt so với chuỗi DNA chuẩn trường hợp IR18 048 có sóng A thay hồn tồn sóng G axit amin 250 (Hình 3.3A) trường hợp IR-100 có sóng C thay hồn tồn sóng G axit amin 453 (Hình 3.3B) Hình 3.3: Hình ảnh trình tự chuỗi DNA bệnh nhân IR-048 (A) bệnh nhân IR-100 (B) Tuy nhiên, với trường hợp dòng mang đột biến chiếm tỷ lệ nhỏ (minor clone), sóng alen đột biến thấp nhiều so với sóng alen bình thường nên khơng phần mềm SeqScape phát Vì vậy, để tránh bỏ sót chúng tơi B A Bình thường Đột biến Hình 3.4: Hình ảnh trình tự chuỗi DNA bệnh nhân IR-029 (A) bệnh nhân IR-035 (B) 19 kiểm tra lại mắt thường cho vị trí nucleotide tất 103 trường hợp, phát có sóng alen đột biến thấp nhiều so với sóng alen bình thường xuất đồng thời ≥ chuỗi DNA vị trí nucleotide chân sóng vùng xung quanh đẹp khơng bị nhiễu kết luận có đột biến trường hợp IR-029 (Hình 4A) IR-035 (Hình 4B) Trong tất trường hợp, kết phân tích độc lập người tham gia nghiên cứu 3.2 Nội dung 2: Xác định tần suất mô tả kiểu đột biến vùng ATPbinding domain gen BCR/ABL 3.2.1 Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu Trong thời gian từ tháng 08/2010 – 09/2012, chúng tơi tiến hành phân tích đột biến gen BCR/ABL cho 103 trường hợp, bao gồm 61 bệnh nhân nam 42 nữ, tỷ lệ nam/nữ 1,45 Tuổi trung bình bệnh nhân 45 tuổi (khoảng tuổi 14 - 73), có 37,9% bệnh nhân ≥ 50 tuổi Đa số bệnh nhân chẩn đoán kháng IM dựa tỉ lệ tế bào mang NST Ph với kỹ thuật FISH để xác định tình trạng kháng thuốc di truyền tế bào tỉ lệ tế bào blast >20% tủy xương trường hợp chuyển cấp (Phụ lục 3), có 20 trường hợp xác định đáp ứng mặt huyết học dựa vào huyết đồ (Phụ lục 3) Hiện có kỹ thuật để đánh giá tình trạng kháng thuốc mặt di truyền tế bào NST đồ FISH Tuy nhiên, độ nhạy NST đồ không cao phân tích khoảng 20 – 30 tế bào, nên phòng xét nghiệm sử dụng kỹ thuật FISH khảo sát khoảng 200 – 500 tế bào để tính số tế bào mang NST Ph Dựa tỉ lệ tế bào mang NST Ph xác định đáp ứng mặt di truyền tế bào theo bảng 1.1 Trong 103 trường hợp, 80 (77,7%) bệnh nhân có đáp ứng ban đầu biểu kháng thuốc thứ phát sau đó, cịn lại 23 (22,3%) bệnh nhân có biểu kháng thuốc nguyên phát 20 3.2.2 Đột biến gen BCR/ABL Các nghiên cứu trước cho thấy có khoảng 136 loại đột biến BCR/ABL nằm vùng ATP-binding ABL phát Tuy nhiên, có báo cáo số trường hợp đột biến nằm ngồi vùng ATP-binding [33,30] Để phát nhiều kiểu đột biến khác kỹ thuật giải trình tự DNA ưu tiên lựa chọn Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng kỹ thuật giải trình tự DNA để phân tích đột biến vùng ATP-binding BCR/ABL Đến nay, thu thập mẫu tủy mẫu máu 103 bệnh nhân BCMDT kháng với điều trị IM Bệnh viện TMHH, tách chiết RNA, tổng hợp cDNA khuếch đại thành công sản phẩm PCR Việc khảo sát đột biến vùng ATP-binding BCR/ABL thực tất mẫu bệnh nhân thu thập Kết phân tích đột biến 103 trường hợp cho thấy 48 bệnh nhân có đột biến, chiếm tỷ lệ 46,6% Tỷ lệ tương đồng với số liệu nghiên cứu Hàn Quốc Ý [16,34], có phần thấp số liệu từ Trung Quốc Ấn Độ [27,2] Các nghiên cứu giới báo cáo nhóm bệnh nhân BCMDT kháng IM thứ phát có tỉ lệ đột biến cao nhóm kháng nguyên phát, đặc biệt cao nhóm bệnh tiến triển chuyển cấp [34] Trong 80 bệnh nhân chẩn đoán kháng thuốc thứ phát nghiên cứu có 39 bệnh nhân mang đột biến BCR/ABL, chiếm tỉ lệ 48,8% cao nhóm kháng nguyên phát có bệnh nhân mang đột biến chiếm tỉ lệ 39,1% Sự khác biệt lý giải nhóm kháng thuốc thứ phát, đặc biệt nhóm bệnh tiến triển chuyển cấp có thời gian dài điều trị nên tăng tính khơng ổn định di truyền (genetic instability) tế bào BCMDT [34] Phân tích đặc điểm đột biến 48 bệnh nhân cho thấy đột biến xảy 20 vị trí axit amin với 25 kiểu khác Mỗi bệnh nhân mang hoặc kiểu đột biến Kết cho thấy đột biến M351T chiếm tỷ lệ cao (11/48 trường hợp, 22,9%), H396R chiếm tỷ lệ 14,6% (7/48 trường hợp), sau M244V, G250E Y253H, F317L (mỗi loại đột biến gặp 5/48 trường hợp, chiếm 10,4%) (Hình 3.5) Đột biến T315I kháng mạnh với IM thuốc ức chế tyrosine kinase hệ sau 21 gặp trường hợp, chiếm tỷ lệ 8,3% Nghiên cứu Hàn Quốc, Trung Quốc Ấn Độ bệnh nhân BCMDT kháng IM cho thấy kiểu đột biến chiếm tỷ lệ cao T315I [16,2] M244V [2,27], khác biệt so với kết nghiên cứu Đột biến M351I H396R đơn độc kháng tương IM nên đáp ứng tăng liều IM, đồng thời bệnh nhân mang đột biến nhạy với thuốc TKI hệ sau nilotinib, dasatinib, 11 10 Số bệnh nhân Kiểu đột biến Hình 3.5: Phân bố kiểu đột biến BCR/ABL Mỗi chấm tròn đen biểu thị đột biến điểm Đột biến quai P gồm M244I, M244V, K245R, K247R, G250E, Y253F, Y253H, E255V E255K gặp 26/48 bệnh nhân (54,2%), có bệnh nhân IR-014 mang kiểu đột biến quai P Y253H E255K, bệnh nhân IR-096 mang đồng thời kiểu đột biến quai P M244V, K245R, K247R (Bảng 3.1) Trong nhóm đột biến kháng IM nhóm mang đột biến quai P T315I có tiên lượng xấu nhóm lại [12] Đột biến Y253H E255K đơn độc kháng mạnh với IM (Hình 1.5) nên bệnh nhân IR-014 mang lúc đột biến có tiên lượng xấu Điều hoàn 22 Bảng 3.1: Những bệnh nhân mang từ kiểu đột biến trở lên STT Mã số BN Giới tính Tuổi Loại mẫu IR-003 Nam 44 Tủy IR-010 Nam 63 IR-011 Nam 41 IR-014 Nam 41 IR-023 Nam 64 IR-028 Nữ 55 IR-029 Nam 19 IR-035 Nam 54 IR-036 Nữ 38 10 IR-045 Nam 30 11 IR-055 Nam 30 12 IR-061 Nữ 29 13 IR-068 Nam 21 14 IR-077 Nam 66 15 IR-082 Nam 42 16 IR-091 Nữ 38 17 IR-095 Nam 46 18 IR-096 Nữ 42 Tủy Tủy Tủy Tủy Tủy Tủy Tủy Tủy Tủy Tủy Tủy Tủy Tủy Tủy Tủy Tủy Máu Đột biến Y253F F317L F359I Y253H M351T F317L H396R Y253H E255K F359I E450A M351T H396R E279K E292A T315I F359I T315I E355G E255K T315I E255K F317L E255V F317L M351T Y253F M351T Y253H L387M Y320H F359V M351T H396R M244V H396R M244V K245R K247R H396R 23 Tình trạng lâm sàng Chuyển cấp Mất đáp ứng huyết học Đang dùng liều viên Chuyển cấp, tử vong Đang dùng liều viên Chuyển cấp, tử vong Chuyển cấp, tử vong Chuyển cấp Chuyển cấp, tử vong Chuyển cấp, tử vong Mất đáp ứng huyết học Mất đáp ứng huyết học Mất đáp ứng huyết học Mất đáp ứng huyết học Mất đáp ứng huyết học Đang dùng liều viên Đang dùng liều viên Chuyển cấp toàn phù hợp với diễn tiến lâm sàng bệnh nhân: bệnh nhân kháng IM nguyên phát chuyển cấp sau điều trị tháng với IM liều chuẩn (400 mg/ngày), đồng thời không đáp ứng với tăng liều IM gấp đôi tái phát sau tháng dị ghép tủy từ người cho anh em ruột phù hợp HLA Trong 48 bệnh nhân mang đột biến, có 18 (37,5%) bệnh nhân có từ loại đột biến trở lên (Bảng 3.1) Bệnh nhân IR-003 IR-061 có loại đột biến, Y253F E255V kháng mạnh với IM, riêng bệnh nhân IR-096 mang lúc loại đột biến Trong 18 bệnh nhân này, có bệnh nhân mang đột biến T315I 10 bệnh nhân mang đột biến quai P Y253F, Y253H, E255K , đặc biệt bệnh nhân IR-045 mang đột biến T315I E255K (Bảng 3.1) Nhóm bệnh nhân mang từ loại đột biến trở lên kháng mạnh với IM [16] Bệnh nhân IR-096 mang kiểu đột biến có đột biến quai P nên tiên lượng xấu phù hợp với diễn tiến lâm sàng: bệnh nhân kháng IM nguyên phát, không đáp ứng dù tăng liều IM lên viên/ngày bệnh chuyển cấp, kháng với phác đồ hóa trị liệu bạch cầu cấp Ba bệnh nhân IR-035, IR-036 IR-045 mang đột biến có T315I chuyển cấp bệnh nhân IR-036 IR-045 tử vong Ngoài ra, hầu hết bệnh nhân có mang từ kiểu đột biến trở lên không đáp ứng với tăng liều IM, diễn tiến đáp ứng mặt huyết học, chuyển cấp tử vong (Bảng 3.1) Các nghiên cứu giới báo cáo rằng, bệnh nhân có đột biến T315I, nhóm quai P đa đột biến có thời gian sống tồn thời gian sống khơng bệnh ngắn so với nhóm mang đột biến khác Bệnh nhân IR-093 có đột biến T315I đơn độc không đáp ứng với tăng liều IM lên viên/ngày chuyển cấp Trong 10 bệnh nhân mang kiểu đột biến kháng mạnh với IM có bệnh nhân chuyển cấp, đáp ứng huyết học, không đáp ứng mặt di truyền tế bào dù dùng viên/ngày, có bệnh nhân (10%) dùng liều viên/ngày (Bảng 3.2) tiếp tục theo dõi diễn tiến bệnh nhân Như diễn tiến lâm sàng bệnh nhân phù hợp với kiểu đột biến phát Ngoài 18 trường hợp mang từ loại đột biến, có 10 bệnh nhân mang đột biến đơn độc kháng mạnh với IM (Bảng 3.2), tổng số bệnh nhân có mang đột biến 24 kháng mạnh với IM 28/48 trường hợp, chiếm tỷ lệ 58,3% Tính tổng số 103 bệnh nhân khảo sát, 28/103 trường hợp (27,2%) đáp ứng tăng liều IM Bảng 3.2: Những bệnh nhân mang kiểu đột biến kháng mạnh với IM Mã số BN STT Giới tính Loại Tuổi mẫu Đột biến IR-040 Nữ 56 Tủy G250E IR-041 IR-048 IR-054 Nữ Nữ Nữ 50 42 34 Tủy Máu Tủy E255K G250E G250E IR-060 IR-093 IR-094 IR-099 IR-102 Nam Nam Nam Nữ Nam 27 46 45 37 47 Tủy Tủy Tủy Máu Tủy G250E T315I Y253H Y253H G250E 10 IR-110 Nam 51 Tủy E279K Tình trạng lâm sàng Đang dùng liều viên, không đáp ứng di truyền tế bào Đang dùng liều viên, không đáp ứng di truyền tế bào Đang dùng liều viên Mất đáp ứng huyết học Đang dùng liều viên, không đáp ứng di truyền tế bào Chuyển cấp Chuyển cấp Mất đáp ứng huyết học Mất đáp ứng huyết học Đang dùng liều viên, không đáp ứng di truyền tế bào Đột biến vùng quai hoạt hóa gặp 9/48 trường hợp (18,6%) gồm L387M, Y393C H396R có trường hợp xuất đơn độc (Bảng 3.3), trường hợp lại kèm với đột biến khác (Bảng 3.1) Các đột biến xuất đơn độc kháng tương đối nên đáp ứng với tăng liều IM (Bảng 3.3) Trong 20 bệnh nhân có mang đột biến kháng IM tương đối có trường hợp chuyển cấp tử vong, bệnh nhân bỏ điều trị nên không theo dõi được, bệnh nhân đáp ứng huyết học (45%) bệnh nhân đáp ứng với tăng liều IM Kết cho thấy nhóm bệnh nhân có mang đột biến kháng tương IM có tỉ lệ đáp ứng với tăng liều IM cao nhóm mang đột biến kháng mạnh nhóm có đa đột biến Bảng 3.3: Những bệnh nhân mang kiểu đột biến kháng tương IM STT Mã số BN IR-015 IR-016 IR-019 Giới tính Nữ Nam Nữ Tuổi 50 36 38 Loại mẫu Tủy Tủy Tủy Đột biến M244V F486S M351T 25 Tình trạng lâm sàng Mất đáp ứng huyết học Đã tử vong Đang dùng liều viên 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 IR-024 IR-030 IR-058 IR-066 IR-076 IR-081 IR-086 IR-090 IR-092 IR-100 IR-101 IR-104 IR-105 IR-106 IR-109 IR-111 IR-122 Nữ Nữ Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nữ Nữ Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam 50 48 45 43 43 31 45 73 25 50 47 60 43 44 67 54 64 Tủy Tủy Máu Máu Tủy Tủy Tủy Máu Tủy Tủy Tủy Máu Máu Tủy Tủy Máu Tủy M351T E355G M351T H396R M244I M351T M244V M351T F317L E453Q M244V M351T Y393C E355G H396R E453K M244I Mất đáp ứng huyết học Mất đáp ứng huyết học Bỏ điều trị Bỏ điều trị Đang dùng liều viên Mất đáp ứng huyết học Đang dùng liều viên Mất đáp ứng huyết học Đang dùng liều viên Đang dùng liều viên Đang dùng liều viên Đang uống viên Bỏ điều trị Bỏ điều trị Đang dùng liều viên Mất đáp ứng huyết học Đang dùng liều viên Kỹ thuật giải trình tự DNA địi hỏi phải có 20% số tế bào mang NST Ph phát đột biến [33] Những bệnh nhân BCMDT nghiên cứu chẩn đoán kháng IM dựa vào kết FISH chuyển cấp nên hầu hết bệnh nhân có tỷ lệ tế bào mang NST Ph cao 50% tỉ lệ tế bào blast >20% nên việc phát dòng tế bào mang đột biến kháng IM dễ dàng Kết nghiên cứu cho thấy có nhiều loại đột biến, phân bố trải rộng tồn vùng ATP-binding BCR/ABL (Hình 3.5 Phụ lục 2) nên để phát tất kiểu đột biến dân số nghiên cứu kỹ thuật giải trình tự DNA phù hợp Bằng kỹ thuật giải trình tự DNA, phổ đột biến bệnh nhân BCMDT kháng IM BV.TMHH bước đầu thiết lập, đột biến kháng mạnh với IM thường gặp gồm có G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, E279K, T315I (23/103 trường hợp, chiếm 22,3%) (Hình 3.5) Nếu phát bệnh nhân mang đột biến kháng mạnh dù có kèm đột biến khác hay khơng bác sĩ nên định ngưng IM chuyển sang phương pháp điều trị khác hầu hết bệnh nhân Bảng 3.1 Bảng 3.2 không đáp ứng với tăng liều IM, số bệnh nhân chuyển cấp tử vong Một số kỹ thuật ASO-PCR (allele specific 26 oligonucleotide) ARMS-PCR (amplification refractory mutation system) nhạy hơn, qui trình đơn giản cần máy luân nhiệt phát đột biến biết trước, nên dễ dàng chuyển giao cho bệnh viện sở khác Với kết phổ đột biến nghiên cứu này, chúng tơi triển khai chuẩn hóa điều kiện kỹ thuật ASO-PCR khảo sát kiểu đột biến G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, E279K, T315I nhằm phát nhanh đột biến kháng mạnh với IM Việc khảo sát đột biến kháng IM giúp bác sĩ lâm sàng định hướng điều trị phù hợp tiết kiệm chi phí tăng liều IM mù trường hợp có đột biến kháng mạnh với IM 27 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN Qua năm thực nghiên cứu khảo sát đột biến gen BCR/ABL 103 bệnh nhân BCMDT kháng IM, chúng tơi hồn thành nội dung sau: Xây dựng hoàn chỉnh quy trình xác định đột biến gen BCR/ABL kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA từ mẫu tủy xương máu ngoại biên bệnh bạch cầu mạn dòng tủy kháng IM Bệnh viện Truyền máu Huyết học Đại học Y Dược TP.HCM (Phụ lục 1) Tỉ lệ bệnh nhân nam/nữ = 1,45, 77,7% kháng IM thứ phát - Tỷ lệ đột biến BCR/ABL 46,6% xảy 20 vi trí axit amin với 25 kiểu khác Trong đó, nhóm kháng IM nguyên phát có tỉ lệ đột biến 39,1% so với 48,8% nhóm kháng IM thứ phát - Đột biến thường gặp M351I, H396R - 18 bệnh nhân (18/48 = 37,5%) mang từ loại đột biến - 10 bệnh nhân (10/48 = 20,8%) mang đột biến kháng mạnh với IM - Đột biến T315I gặp trường hợp tất bệnh nhân chuyển cấp, bệnh nhân tử vong 28 KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu, xác định kiểu đột biến thường gặp kiểu đột biến kháng mạnh với IM, giúp định chỉnh liều IM chuyển sang thuốc ức chế ABL hệ Các bác sĩ nên định ngưng IM, chuyển sang phương pháp điều trị khác bệnh nhân có mang đột biến kháng hồn tồn với IM, tránh lãng phí thuốc tăng liều mù Triển khai khảo sát đột biến kháng IM mạnh thường gặp BCMDT gồm G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, E279K, T315I kỹ thuật ASO-PCR Chuyển giao quy trình chẩn đốn đột biến gen BCR/ABL cho bệnh viện chuyên ngành Huyết học nước có nhu cầu Phân tích số liệu có để đăng kết tập san khoa học quốc tế 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Apperley JF Part I: mechanisms of resistance to IM in chronic myeloid leukaemia Lancet Oncol 2007;8:1018-29 Bagadi S, Saikia T, Pany A, et al Analysis of ABL kinase domain mutations conferring resistance to tyrosine kinase inhibitors in chronic myeloid leukemia cases from India Clin Lab 2011;57(7-8):619-23 Barrett J Allogeneic stem cell transplantation for chronic myeloid leukemia Semin Hematol 2003;40:59-71 Boice JD Jr, Day NE, Andersen A, et al Second cancers following radiation treatment for cervical cancer An international collaboration among cancer registries J Natl Cancer Inst 1985 May;74(5):955-75 Cortes J, Jabbour E, Kantarjian H, et al Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors Blood 2007;110:4005-11 Cortes J, KIM DW, Raffoux E, et al Efficacy and safety of dasatinib in IM-resistant or intolerant patients with chronic myeloid leukemia in blast phase Leukemia 2008;22:2176-83 Druker BJ, Guilhot F, O'Brien SG, et al Five-year follow-up of patients receiving IM for chronic myeloid leukemia N Engl J Med 2006;355:2408-17 Goldman JM, Melo JV Targeting the BCR-ABL tyrosine kinase in chronic myeloid leukemia N Engl J Med 2001;344:1084-6 Gorre ME, Mohammed M, Ellwood K, et al Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification Science 2001;293:876-80 10 Gotoh A, Broxmeyer HE The function of BCR/ABL and related proto-oncogenes Curr Opin Hematol 1997 Jan;4(1):3-11 11 Guilhot F, Chastang C, Michallet M, et al Interferon alfa-2b combined with cytarabine versus interferon alone in chronic myelogenous leukemia French Chronic Myeloid Leukemia Study Group N Engl J Med 1997;337:223-9 12 Jabbour E, Kantarjian H, Jones D, et al Characteristics and outcomes of patients with chronic myeloid leukemia and T315I mutation following failure of IM mesylate therapy Blood 2008;112(1):53-5 13 Jabbour E, Kantarjian H, Jones D, et al Frequency and clinical significance of BCR-ABL mutations in patients with chronic myeloid leukemia treated with IM mesylate Leukemia 2006;20:1767-73 14 Kantarjian H, Giles F, Wunderle L, et al Nilotinib in IM-resistant CML and Philadelphia chromosome-positive ALL N Engl J Med 2006;354:2542-51 15 Kantarjian H, Sawyers C, Hochhaus A, et al Hematologic and cytogenetic responses to IM mesylate in chronic myelogenous leukemia N Engl J Med 2002;346:645-52 16 KIM SH, KIM D, KIM DW, et al Analysis of Bcr-Abl kinase domain mutations in Korean chronic myeloid leukaemia patients: poor clinical outcome of P-loop and T315I mutation is disease phase dependent Hematol Oncol 2009;27(4):190-7 17 Melo JV, Deininger MW Biology of chronic myelogenous leukemia signaling pathways of initiation and transformation Hematol Oncol Clin North Am 2004;18(3):545-68 18 Melo JV The diversity of BCR-ABL fusion proteins and their relationship to leukemia phenotype Blood 1996;88:2375-84 30 19 Moen MD, McKeage K, Plosker GL, et al IM: a review of its use in chronic myeloid leukaemia Drugs 2007;67:299-320 20 Nguyễn Hà Thanh n Điều trị Lơxêmi kinh dòng bạch cầu hạt có số lượng bạch cầu cao Hydrea phối hợp Cytarabin Tạp chí Y học Việt Nam 2008;344:423-9 21 Nguyễn Thị Mỹ Hòa NTB Sử dụng thuốc ức chế BCR-ABL tyrosine kinase điều trị bệnh bạch cầu mạn dòng tủy BV TMHH TPHCM Tạp chí Y học Việt Nam 2009;344:236 - 44 22 Palandri F, Castagnetti F, AlIMena G, et al The long term durability of cytogenetic responses in patients with accelerated phase chronic myeloid leukemia treated with IM 600 mg Haematologica 2009;94:205-12 23 Palandri F, Castagnetti F, Testoni N, et al Chronic myeloid leukemia in blast crisis treated with IM 600 mg: outcome of the patients alive after a 6-year follow-up Haematologica 2008;93:1792-94 24 Pasternak G, Hochhaus A, Schultheis B, et al Chronic myelogenous leukemia: molecular and cellular aspects J Cancer Res Clin Oncol 1998;124(12):643-60 25 PrIMo D, Tabernero MD, Rasillo A, et al Patterns of BCR/ABL gene rearrangements by interphase fluorescence in situ hybridization (FISH) in BCR/ABL+ leukemias: incidence and underlying genetic abnormalities Leukemia 2003;17:1124-9 26 Phan TX, Hoang AV, Huynh VM, et al Unique secondary chromosomal abnormalities are frequently found in the chronic phase of chronic myeloid leukemia in southern Vietnam Cancer Genet Cytogenet 2006;168:59-68 27 Qin Y, Chen S, Jiang B, et al Characteristics of BCR-ABL kinase domain point mutations in Chinese IM-resistant chronic myeloid leukemia patients Ann Hematol 2011;90(1):47-52 28 Quintás-Cardama A, Gibbons DL, Kantarjian H, et al Sequencing of subcloned PCR products facilitates earlier detection of BCR-ABL1(T315I) and other mutants compared to direct sequencing of the ABL1 kinase domain Leukemia 2008;22(4):885-8 29 Ribeiro RC, Abromowitch M, RaIMondi SC, et al Clinical and biologic hallmarks of the Philadelphia chromosome in childhood acute lymphoblastic leukemia Blood 1987;70:948-53 30 Sherbenou DW, Hantschel O, Kaupe I, et al BCR-ABL SH3-SH2 domain mutations in chronic myeloid leukemia patients on IM Blood 2010;116(17):3278-85 31 Soverini S, Colarossi S, Gnani A, et al Contribution of ABL kinase domain mutations to IM resistance in different subsets of Philadelphia-positive patients: by the GIMEMA Working Party on Chronic Myeloid Leukemia Clin Cancer Res 2006;12:7374-9 32 Soverini S, Colarossi S, Gnani A, et al Resistance to dasatinib in Philadelphia-positive leukemia patients and the presence or the selection of mutations at residues 315 and 317 in the BCR-ABL kinase domain Haematologica 2007;92(3):401-4 33 Soverini S, Hochhaus A, Nicolini FE, et al BCR-ABL kinase domain mutation analysis in chronic myeloid leukemia patients treated with tyrosine kinase inhibitors: recommendations from an expert panel on behalf of European LeukemiaNet Blood 2011;118(5):1208-15 34 Soverini S, Martinelli G, Rosti G, et al ABL mutations in late chronic phase chronic myeloid leukemia patients with up-front cytogenetic resistance to IM are associated with a greater likelihood of progression to blast crisis and shorter survival: a study by the 31 GIMEMA Working Party on Chronic Myeloid Leukemia J Clin Oncol 2005;23(18):4100-9 35 Tuszynski A, Dhut S, Young BD, et al Detection and significance of bcr-abl mRNA transcripts and fusion proteins in Philadelphia-positive adult acute lymphoblastic leukemia Leukemia 1993;7:1504-8 36 Trần Quốc Tuấn Điều trị bệnh bạch cầu mạn dòng tủy Hydrea Trung tâm Truyền máu Huyết học TP.HCM Tạp chí Y học Việt Nam 2002;5:20 - 37 Wu J, Meng F, Lu H, et al Lyn regulates BCR-ABL and Gab2 tyrosine phosphorylation and c-Cbl protein stability in IM-resistant chronic myelogenous leukemia cells Blood 2008;111:3821-9 32 ... cứu khảo sát đột biến gen BCR/ABL 103 bệnh nhân BCMDT kháng IM, chúng tơi hồn thành nội dung sau: Xây dựng hồn chỉnh quy trình xác định đột biến gen BCR/ABL kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA từ... dân số nghiên cứu kỹ thuật giải trình tự DNA phù hợp Bằng kỹ thuật giải trình tự DNA, phổ đột biến bệnh nhân BCMDT kháng IM BV.TMHH bước đầu thiết lập, đột biến kháng mạnh với IM thường gặp gồm... BAN NHÂN DÂN TP HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN BCR/ABL GÂY KHÁNG IMATINIB TRÊN BỆNH NHÂN BỆNH BẠCH CẦU MẠN DÒNG