BỘ NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NƠNG THƠN GIÁO TRÌNH MƠ ĐUN CHUẨN BỊ HỐ CHẤT VÀ MƠI TRƢỜNG VI NHÂN GIỐNG MÃ SỐ: 03 NGHỀ: VI NHÂN GIỐNG CÂY LÂM NGHIỆP Trình độ: Sơ cấp nghề Bắc Giang, tháng 10 năm 2008 TUYÊN BỐ BẢN QUYỀN Tài liệu thuộc loại sách giáo trình nên nguồn thơng tin phép dùng ngun trích dùng cho mục đích đào tạo tham khảo Mọi mục đích khác mang tính lệch lạc sử dụng với mục đích kinh doanh thiếu lành mạnh bị nghiêm cấm MÃ TÀI LIỆU: LỜI GIỚI THIỆU Vi nhân giống lâm nghiệp nghề sản xuất giống lâm nghiệp chất lượng cao đáp ứng nhu cầu trồng rừng kinh doanh Việt Nam, chương trình đào tạo nghề ngắn hạn cho lao động nơng thôn từ đến năm 2020, nhằm trang bị cho học viên số kiến thức kỹ để thực bước công việc nhân giống lâm nghiệp vi nhân giống Giáo trình Vi nhân giống lâm nghiệp xây dựng phát triển theo bước: phân tích nghề, phân tích cơng việc xây dựng chương trình, giáo trình dạy nghề theo mơ đun Giáo trình mơ đun: Chuẩn bị hóa chất môi trường vi nhân giống mô đun thứ mơ đun chương trình dạy nghề: Vi nhân giống lâm nghiệp nhằm trang bị cho học viên kiến thức kỹ xác định, pha chế, bảo quản hóa chất mơi trường dùng nghề Vi nhân giống lâm nghiệp Giáo trình mơ đun gồm bài: Bài 1: Xác định loại hóa chất dùng vi nhân giống; Bài 2: Pha chế bảo quản dung dịch mẹ; Bài 3: Pha chế bảo quản môi trường vi nhân giống Để hồn thành giáo trình chúng tơi nhận giúp đỡ nhà khoa học viện nghiên cứu, cán kỹ thuật sở sản xuất, giảng viên trường đại học, cao đẳng, dạy nghề khoa Lâm nghiệp Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Nhân dịp cho phép gửi lời cảm ơn đến lãnh đạo Bộ Nông nghiệp & PTNT, viện nghiên cứu, trường, nhà khoa học, cán kỹ thuật, thày cô giáo tham gia chương trình đóng góp nhiều ý kiến q báu, tạo điều kiện thuận lợi để chúng tơi hồn thành giáo trình Trong q trình biên soạn giáo trình mơ đun chắn khơng tránh khỏi thiếu sót Chúng tơi mong nhận ý kiến đóng góp quý báu nhà khoa học, nhà quản lý bạn đọc để hiệu chỉnh hồn thiện giáo trình phục vụ nghiệp đào tạo nghề ngắn hạn cho lao động nông thôn nước ta Tham gia biên soạn Chủ biên : TS Nguyễn Văn Vượng TS Nghiêm Xuân Hội ThS Vũ Thị Tâm ThS Nguyễn Thị Thanh Nguyên MỤC LỤC TIÊU ĐỀ TRANG LỜI GIỚI THIỆU MỤC LỤC CÁC THUẬT NGỮ CHUYÊN MÔN, CHỮ VIẾT TẮT MÔ ĐUN CHUẨN BỊ HỐ CHẤT VÀ MƠI TRƯỜNG VI NHÂN GIỐNG Giới thiệu mô đun: BÀI 1: XÁC ĐỊNH CÁC LOẠI HÓA CHẤT DÙNG TRONG VI NHÂN GIỐNG Mục tiêu: A Nội dung: Vai trò, đặc tính lý, hoá học sinh học hoá chất dïng vi nh©n gièng 1.1 Các nguyên tố đa lượng 1.2 Các nguyên tố vi lượng (Fe, B, Cl, Co, Cu, Mn, Mo, Zn ) 10 1.3 Các vitamin 15 1.4 Các chất điều hoà sinh trưởng 17 1.5 Những chất thường dùng khác: 23 Phân loại hóa chất vi nhân giống 23 2.1 Nhóm hóa chất khử trùng 23 2.2 Nhóm hóa chất dùng để pha mơi trường vi nhân giống 25 Danh mục hóa chất dùng vi nhân giống 28 B Câu hỏi tập thực hành 30 Câu hỏi 30 Bài tập thực hành: 30 Xác định loại hóa chất dùng vi nhân giống 30 Nhận biết loại hóa chất dùng vi nhân giống theo nhãn ghi bao bì 30 Nhận biết loại hóa chất dùng vi nhân giống theo dạng thương phẩm (Dạng kết tinh, dạng lỏng, mầu sắc ) 30 C Ghi nhớ 32 BÀI 2: PHA CHẾ HÓA CHẤT VÀ BẢO QUẢN DUNG DỊCH MẸ 33 I Mục tiêu bài: 33 A Nội dung 33 Cách pha hóa chất bảo quản hóa chất 33 1.1 Cách pha hoá chất 33 1.2 Cách pha bảo quản loại hóa chất cụ thể 34 Cách pha chế dung dịch mẹ cách bảo quản dung dịch mẹ 36 2.1 Cách pha dung dịch mẹ 36 2.2 Cách pha chế bảo quản chất điều hoà sinh trưởng 37 2.3 Cách pha chế bảo quản chất vi lượng, đa lượng dung dịch mẹ 38 2.4 Cách pha chế bảo quản Vitamin 39 B Câu hỏi tập thực hành 40 Câu hỏi 40 Bài tập thực hành 40 C Ghi nhớ 46 BÀI 3: PHA CHẾ VÀ BẢO QUẢN MÔI TRƯỜNG VI NHÂN GIỐNG 47 I Mục tiêu: 47 A Nội dung bài: 47 Danh mục hóa chất dùng pha chế số môi trường phổ biến: 47 Công thức cách pha chế môi trường vi nhân giống 48 2.1 Công thức cách pha chế môi trường nuôi cấy khởi đầu 53 2.2 Công thức cách pha chế môi trường nhân nhanh chồi 54 2.3 Công thức cách pha chế mơi trường tạo hồn chỉnh 55 Khử trùng môi trường vi nhân giống: 56 Các phương pháp bảo quản môi trường vi nhân giống 56 B Câu hỏi tập thực hành 56 Câu hỏi: 56 Bài tập thực hành: 57 Bài 1: Pha chế môi trường nuôi cấy khởi đầu 57 C Ghi nhớ 59 Bài 2: Pha chế môi trường nhân nhanh chồi 59 C Ghi nhớ 61 Bài 3: Pha chế mơi trường tạo hồn chỉnh 61 C Ghi nhớ 63 HƯỚNG DẪN GIẢNG DẠY MÔ ĐUN 64 I Vị trí, tính chất mơ đun 64 II Mục tiêu 64 III Nội dung mơ đun 64 IV Hướng dẫn thực tập thực hành 65 Bài 1: Xác định loại hóa chất dùng vi nhân giống 65 Bài 2: Pha chế hóa chất bảo quản dung dịch mẹ 65 Bài 3: Pha chế bảo quản môi trường vi nhân giống 66 V Yêu cầu đánh giá kết học tập 66 5.1 Bài 66 5.2 Bài 66 5.3 Bài 67 VI Tài liệu tham khảo 68 CÁC THUẬT NGỮ CHUN MƠN, CHỮ VIẾT TẮT MĐ: Mơ đun LT: lý thuyết TH: thực hành KT: kiểm tra MÔ ĐUN CHUẨN BỊ HỐ CHẤT VÀ MƠI TRƢỜNG VI NHÂN GIỐNG Mã số mô đun: MĐ 03 Giới thiệu mô đun: Mô đun nhằm trang bị cho người học kiến thức, kỹ lựa chọn loại hóa chất dùng vi nhân giống, cách pha chế dung dịch gốc (hay gọi duung dịch mẹ) Cách pha chế môi trường nuôi cấy khởi đầu, môi trường nhân nhanh chồi, môi trường rễ Nội dung mơ đun bố trí tích hợp dạy lý thuyết lớp, thực hành phịng thí nghiệm Thời lượng mô đun 92 giờ; lý thuyết 16; thực hành 68; kiểm tra Bài 1: XÁC ĐỊNH CÁC LOẠI HÓA CHẤT DÙNG TRONG VI NHÂN GIỐNG Mục tiêu: Sau học xong học viên có khả năng: - Trình bày vai trị, đặc tính lý, hóa học sinh học loại hóa chất dùng vi nhân giống - Nhận biết hóa chất phân hóa chất theo nhóm sử dụng - Xác định loại hóa chất cần dùng vi nhân giống A Nội dung: Vai trò, đặc tính lý, hoá học sinh học hoá chất dùng vi nhân giống Thc vt có nhu cầu sử dụng nguyên tố đa lượng lớn nhiều so với nguyên tố vi lượng Nguyên tố đa lượng có nồng độ cao môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Nhìn chung phần anion cation nguyên tố đa lượng quan trọng tế bào thực vật Ví dụ + KNO3, K NO3 cần thiết 1.1 Các nguyên tố đa lượng Ni tơ (N): Thành phần hầu hết môi trường nitơ vô dạng + nitrat (NO3 ) amonium (NH4 ) Các muối dùng phổ biến kali nitrat (KNO3), nitrat amon (NH4NO3) canxi nitrat (Ca(NO3)2.4H2O) Những hợp chất cung cấp nitơ vô cho thực vật để tổng hợp phân tử chất hữu phức tạp Mô, tế bào thực vật ni cấy sử dụng nitrogen khoáng aminonium nitrate, đồng thời sử dụng dạng nitrogen hữu amino acid Tỉ lệ amonium nitrate thay đổi tùy theo loài trạng thái phát triển mô Nitrate cung cấp dạng muối Ca(NO 3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 NH4NO3 Amonium cung cấp dạng (NH4)2SO4 NH4NO3 Trong số trường hợp cung cấp dạng urea Tổng nồng độ NO3+ NH4+ môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng ni cấy mục đích nghiên cứu Amonium chủ yếu dự trữ rễ nguồn nitơ hữu Nitrat vận chuyển theo mạch xylem đến phận cây, tham gia vào q trình đồng hố nitơ Nitrat dự trữ không bào thực chức quan trọng việc điều chỉnh thẩm thấu cân ion trồng Phốt pho: (P) Phốt nguyên tố quan trọng đời sống thực vật, tham gia vào việc vận chuyển lượng, sinh tổng hợp protein, acid nuclêic tham gia cấu trúc màng Trong môi trường nuôi cấy, Phốt cung cấp dạng mono hay dihydrogenphosphate potasium hay sodium Ion photphate hóa trị chuyển đổi lẫn tùy theo pH Ion H2PO4- chiếm ưu pH nhỏ 7, đặc tính hầu hết mơi trường ni cấy mơ tế bào thực vật ion dễ thực vật hấp thụ Phốt thường cung cấp dạng photphate hòa tan hạn chế Nồng độ photphate hòa tan cao môi trường làm giảm tăng trưởng mơ, calcium số nguyên tố vi lượng bị kết tủa môi trường bị giảm hấp thu vào mô Nồng độ ion photphate cho vào môi trường cao 18,9 mM, trung bình 1,7 mM, hầu hết mơi trường chứa photphate khoảng 1.3 mM 2- Phốt dạng HPO4 hấp thụ nhờ hệ thống rễ thực vật ngược lại với nitrat, sunfat, khơng bị khử Nó có mặt thực vật dạng P vô dạng hợp chất este (R-O-P) Năng lượng thu giải phóng nguyên tử P khỏi liên kết (cao lượng) quan trọng trình trao đổi chất tế bào Kali (K): K+ cation chủ yếu cây, giúp cho cân anion vô hữu Ion K+ chuyển qua màng tế bào dễ dàng có vai trị điều hịa pH áp suất thẩm thấu môi trường nội bào Sự thiếu hụt K + môi trường nuôi cấy mô thực vật dẫn đến tình trạng thiếu nước K+ cung cấp dạng muối KNO3, KCl 6H2O, KH2PO4 + Trong thực vật, K cation có tính linh động cao, mức độ tế bào trình vận chuyển qua khoảng cách dài mạch xylem mạch libe Trong tất nguyên tố, kali nguyên tố có mặt với nồng độ cao nhất, tế bào chất từ 100 – 200 mM, lục lạp từ 20 – 200 mM Muối kali có vai trị quan trọng việc điều chỉnh tính thấm tế bào Đối với giãn tế bào trình khác điều chỉnh nhờ + sức trương tế bào, K có vai trị ion trung hồ ion vơ hữu hồ tan dung dịch, đồng thời trì pH khoảng – pH thích hợp cho hoạt động hầu hết enzym + Bên cạnh vai trò hoạt động nhiều enzym, K điều chỉnh + cân ion pH lục lạp quang hợp K ion trung hồ quan + trọng cho đưa dịng H qua màng thylakoid Ion có mặt tạo thành gradien pH màng tế bào cần thiết cho trình tổng hợp ATP Sự + tăng nồng độ K dẫn đến tăng cường trình quang hợp, hô hấp hoạt động enzym ribuloza biphosphat cacboxylaza Sự giãn tế bào: Sự tăng kích thước không bào trung tâm tế bào trình quan trọng giãn tế bào Để hình thành khơng bào, tăng kích thước đủ lớn thành tế bào, khả + thẩm thấu không bào tăng lên Điều đạt nhờ tích tụ K + gây tăng mạnh thể tích khơng bào tính thấm GA3 K dường có tác dụng hỗ trợ vai trò làm tăng chiều cao + Sự cân ion: K có vai trị quan trọng cho việc trì cân ion Nó trung hồ anion linh động tế bào chất nhiều anion linh động mạch xylem, libe không bào + Trong trình trao đổi nitrat, K có chức chủ yếu vận chuyển ion NO3 qua khoảng cách dài mạch xylem dự trữ + không bào Sau trình khử nitrat cây, lượng K lại sử dụng + để tổng hợp axit hữu trung hoà ion K Các muối kali axit hữu + kali malat vận chuyển tới rễ, sau K nhận ion nitrat tế bào rễ vận chuyển chúng qua mạch xylem Canxi (Ca): Calcium cation chủ yếu giúp cân anion cách thức không giống K+ Mg+ Ca2+ khơng phải ion linh động Calciun liên kết phân tử sinh học lại với góp phần vào cấu trúc hoạt động sinh lí màng tế bào phiến thành tế bào Sự hoạt động nhiều enzim khác thực vật phụ thuộc vào Ca2+ calcium đồng yếu tố với enzim phân giải ATP Trong nuôi cấy tế bào, Ca2+ có vai trị phát sinh hình thái đồng thời với cảm ứng chất điều hòa sinh trưởng đặc biệt auxin cytokinin Ca2+ thành phần quan trọng thành tế bào màng tế bào Số 2+ lượng lớn Ca gắn thành tế bào đóng vai trị chủ yếu củng cố độ vững cho thành tế bào điều hoà cấu trúc màng tế bào 2+ Ion Ca tự có mặt tế bào nồng độ thấp, khoảng 1µM có 2+ tác dụng ngăn chặn kết tủa P vô Do hàm lượng ion Ca tế bào thấp 2+ nên khơng có cạnh tranh với ion Mg vị trí gắn cation tránh làm bất 2+ hoạt enzym Ion Ca di chuyển qua màng tế bào theo chiều 2+ (Ca ngồi tế bào khơng vào được), đảm bảo 2+ nồng độ ion Ca nội bào thấp Đặc biệt tế bào lá, có lượng lớn canxi liên kết với không bào Canxi cần thiết cho thiết lập cân ion nhờ trung hoà anion hữu vô Hầu canxi dạng liên kết tạo muối ocxalat Mặc dù 2+ hợp chất khó tan có vai trị trì nồng độ ion Ca thấp lục lạp tế bào chất Muối canxiocxalat cịn có chức điều chỉnh thẩm thấu tế bào Canxi có vai trị quan trọng q trình nhân lên tế bào rễ Ngồi phát triển ống phấn phụ thuộc vào canxi, trình định hướng nhờ canxi ngoại bào IAA tham gia vào trình vận chuyển 2+ canxi Chất ức chế auxin TIBA ức chế phân phối Ca thực vật làm xuất thiếu hụt canxi Vai trò Ca thành tế bào: Pectin thành phần quan trọng màng liên kết bế bào với phân huỷ nhờ enzym polygalacturonase Tuy nhiên, Ca ức chế mạnh hoạt động polygalacturonaza Hoạt động mạnh enzym ghi nhận thiếu Ca Nếu nồng độ Ca có đủ hầu hết pectin tồn dạng muối canxipectat Nhờ vậy, thành tế bào có khả chống chịu tốt hoạt 2+ động phá huỷ enzym polygalacturonaza Sự có mặt ion Ca có vai trị quan trọng việc ngăn chặn xâm nhiễm nấm 10 Cụ thể: Muốn pha lít mơi trường tạo hoàn chỉnh cần thực thao tác sau: Dùng pipet lấy 28 ml dung dịch A; 20 ml B; ml C; ml D; 5ml E; ml F, thêm chất ta có lít mơi trường ni cấy * Cách pha chế - Pha chất điều hòa sinh trưởng (xem 2) - Đong lượng nước cất khoảng ¼ số lượng môi trường cần pha Đổ vào nồi nấu môi trường, đặt lên bếp đun sôi - Cân đường thạch với khối lượng cần dùng (20 - 30 g đường; 4,5 - gam thạch) cho thêm nước cất khuấy cho thạch đường tan hết Đổ vào nồi nấu, khuấy sôi - Đổ tất hóa chất vừa lấy từ dung dịch mẹ dựa số lượng chuẩn bị rót vào nồi, khuấy đều, thêm nước cất cho đủ số lượng môi trường cần chuẩn bị - Điều chỉnh pH môi trường (HCl 0,1N NaOH 0,1N) có pH = - Rót mơi trường vào bình cấy - Khử trùng mơi trường nồi hấp vô trùng Khử trùng môi trƣờng vi nhân giống:  Sau pha chế môi trường vi nhân giống, chia vào bình thủy tinh hình trụ, bình tam giác  Xếp bình đựng mơi trường vào sọt cho vào nồi hấp, tiến hành hấp khoảng thời gian khoảng 25 - 30phút, ý nhiệt độ nồi hấp phải đạt 1210C, 1atm Các phƣơng pháp bảo quản môi trƣờng vi nhân giống Bảo quản môi trường vi nhân giống đơn giản Sau lấy từ nồi hấp cần chuyển nhanh vào phịng vơ trùng, xếp ngắn lên giá Bảo quản nhiệt độ thường B Câu hỏi tập thực hành Câu hỏi: - Phân biệt khác môi trường nhân nhanh chồi môi trường rễ? - Tai pha chế môi trường cần phải tuân thủ thứ tự bước đổ hóa chất? 58 Bài tập thực hành: Bài tập 1: Pha chế môi trƣờng nuôi cấy khởi đầu Bƣớc 1: Chuẩn bị vật liệu thiết bị - Các dụng cụ vơ trùng - Bình định mức Erlemery (100, 250, 500, 1000ml) - Cốc đong loại: 50, 100, 250, 500, 1000ml - Ống đong 50, 100, 250, 500 1000ml - Pipét loại - Nước cất - Xoong để nấu môi trường Bƣớc 2: Lấy chất theo số ml dung dịch mẹ Nồng độ (g/l) Số ml dung dịch mẹ cho 1lit dung dịch nuôi cấy Na2 EDTA 0,80 28 FeSO4 7H2O 0,38 NH4NO3 82,50 KNO3 95,00 H3PO3 1,24 KH2PO4 34,00 KI 0,166 Na2MO42H2O 0,050 CoCl2 6H2O 0,005 MgSO4.7H2O Dung dịch 74,00 MnSO4.4H2O 4,46 ZnSO4.7 H2O 1,72 Hoá chất A 20 B C D 5 59 CuSO4.5 H2O CaCl2.2 H2O 88,00 Thiamin 0,02 Axit nicotinic 0,10 Pyridoxin 0,10 Glyxin E 0,005 0,40 F Tiến hành lấy số ml dung dịch mẹ theo dẫn bảng, thêm chất sau ta có lít mơi trường nuôi cấy Moy - inostol 100mg/l Sucrose 20-30 g/l Agar 4,5-7 g/l 6BA 0,1-3 mg/l NAA 0,1-3 mg/l Kinetin 0.4-1 mg/l Bƣớc 3: Cách pha - Pha chất điều hòa sinh trưởng (xem 2) - Đong lượng nước cất khoảng ¼ số lượng mơi trường cần pha Đổ vào nồi nấu môi trường, đặt lên bếp đun sôi - Cân đường thạch với khối lượng cần dùng (20 - 30g đường; 4,5 - gam Thạch) cho thêm nước cất khuấy cho thạch đường tan hết Đổ vào nồi nấu, khuấy sơi - Đổ tất hóa chất vừa lấy từ dung dịch mẹ dựa số lượng chuẩn bị rót vào nồi, Cân 100mg Myo - Inositol hịa tan vào hỗn hợp mơi trường trên, khuấy đều, thêm nước cất cho đủ số lượng môi trường cần chuẩn bị - Điều chỉnh pH môi trường (HCl 0,1N NaOH 0,1N) pH = - Rót mơi trường vào bình cấy 60 - Khử trùng môi trường nồi hấp vô trùng C Ghi nhớ - Chuẩn bị vật liệu thiết bị - Lấy chất theo số ml dung dịch mẹ - Pha chế theo trình tự loại hóa chất Bài tập 2: Pha chế môi trƣờng nhân nhanh chồi Bƣớc 1: Chuẩn bị vật liệu thiết bị, dụng cụ - Các dụng cụ vơ trùng - Bình định mức Erlemery (100, 250, 500, 1000ml) - Cốc đong loại: 50, 100, 250, 500, 1000ml - Ống đong 50, 100, 250, 500 1000ml - Pipét loại - Bình thủy tinh tam giác - Nước cất - Xoong để nấu mơi trường Bƣớc 2: Lấy hóa chất theo số ml dung dịch mẹ Dung dịch A Hoá chất Nồng độ (g/l) 0,38 NH4NO3 82,50 KNO3 C 0,80 Fe2SO4 7H2O B Na2 EDTA 95,00 H3PO3 1,24 KH2PO4 34,00 KI Số ml dung dịch mẹ cho 1lit dung dịch nuôi cấy 28 0,166 20 61 Na2MO42H2O 0,050 CoCl2 6H2O 0,005 MgSO4.7H2O 74,00 MnSO4.4H2O 4,46 ZnSO4.7 H2O 1,72 CuSO4.5 H2O 0,005 E CaCl2.2 H2O 88,00 F Thiamin 0,02 Axit nicotinic 0,10 Pyridoxin 0,10 Glyxin 0,40 D Ta tiến hành lấy số ml dung dịch mẹ theo dẫn bảng trên, thêm chất sau ta có lít mơi trường ni cấy Moy inostol 100mg/l Sucrose 20→30 g/l Agar 4,5→7 g/l 6+ BA 0,1→3 mg/l Kinetin 0.4→1 mg/l Bƣớc 3: Cách pha - Pha chất điều hòa sinh trưởng (xem 2) - Đong lượng nước cất khoảng ¼ số lượng môi trường cần pha Đổ vào nồi nấu môi trường, đặt lên bếp đun sôi - Cân đường thạch với khối lượng cần dùng (20→ 30 g đường; 4,5→ gam Thạch) cho thêm nước cất khuấy cho thạch đường tan hết Đổ vào nồi nấu, khuấy sôi - Đổ tất hóa chất vừa lấy từ dung dịch mẹ dựa số lượng chuẩn bị rót vào nồi, Cân 100mg Myo Inositol hòa tan vào hỗn 62 hợp môi trường trên, khuấy đều, thêm nước cất cho đủ số lượng môi trường cần chuẩn bị - Điều chỉnh pH môi trường (HCl 0,1N NaOH 0,1N) pH = - Rót mơi trường vào bình cấy - Khử trùng mơi trường nồi hấp vô trùng C Ghi nhớ - Chuẩn bị vật liệu thiết bị - Lấy chất theo số ml dung dịch mẹ - Pha chế theo trình tự loại hóa chất Bài tập 3: Pha chế mơi trƣờng tạo hồn chỉnh Pha chế mơi trường tạo hồn chỉnh từ mơi trường mẹ có sẵn (mơi trường MS đậm đặc) + chất điều hòa sinh trưởng (IBA) + đường (20-30gam) + Thạch Bƣớc 1: Chuẩn bị vật liệu thiết bị, dụng cụ - Các dụng cụ vô trùng - Bình định mức Erlemery (100, 250, 500, 1000ml) - Cốc đong loại: 50, 100, 250, 500, 1000ml - Ống đong 50, 100, 250, 500 1000ml - Pipét loại - Bình thủy tinh (bình trụ có nắp nhựa chịu nhiệt) - Nước cất Bƣớc 2: Lấy hóa chất theo số ml dung dịch mẹ Nồng độ (g/l) Số ml dung dịch mẹ cho 1lit dung dịch nuôi cấy Na2 EDTA 0,80 28 Fe2SO4 7H2O 0,38 NH4NO3 82,50 Dung dịch Hoá chất A B 20 63 KNO3 95,00 H3PO3 1,24 KH2PO4 34,00 KI 0,166 Na2MO42H2O 0,050 CoCl2 6H2O 0,005 MgSO4.7H2O 74,00 MnSO4.4H2O 4,46 ZnSO4.7 H2O 1,72 CuSO4.5 H2O 0,005 E CaCl2.2 H2O 88,00 F Thiamin 0,02 Axit nicotinic 0,10 Pyridoxin 0,10 Glyxin 0,40 C D 5 Tiến hành lấy số ml dung dịch mẹ theo dẫn bảng thêm chất sau ta có lít mơi trường ni cấy Moy inostol 100mg/l Sucrose 20-30 g/l Agar 4,5-7 g/l IBA 1-30 mg/l Bƣớc 3: Cách pha - Pha chất điều hòa sinh trưởng (xem 2) 64 - Đong lượng nước cất khoảng ¼ số lượng mơi trường cần pha Đổ vào nồi nấu môi trường, đặt lên bếp đun sôi - Cân đường thạch với khối lượng cần dùng (20-30 g đường; 4,5-6 gam Thạch) cho thêm nước cất khuấy cho thạch đường tan hết Đổ vào nồi nấu, khuấy sơi - Đổ tất hóa chất vừa lấy từ dung dịch mẹ dựa số lượng chuẩn bị rót vào nồi, Cân 100mg Myo Inositol hịa tan vào hỗn hợp mơi trường trên, khuấy đều, thêm nước cất cho đủ số lượng môi trường cần chuẩn bị - Điều chỉnh pH môi trường (HCl 0,1N NaOH 0,1N) pH = - Rót mơi trường vào bình cấy - Khử trùng môi trường nồi hấp vô trùng (121 oC, 1.0 atm, 20 phút) - Sau khử trùng xong, chuyển ống nghiệm vào phịng vơ trùng C Ghi nhớ - Chuẩn bị vật liệu thiết bị, dụng cụ - Lấy hóa chất theo số ml dung dịch mẹ - Pha chế hóa chất theo trình tự quy định 65 HƢỚNG DẪN GIẢNG DẠY MƠ ĐUN I Vị trí, tính chất mơ đun - Vị trí: Mơ đun chuẩn bị hóa chất mơi trường vi nhân giống mơ đun chun mơn nghề chương trình dạy nghề trình độ sơ cấp nghề Vi nhân giống lâm nghiệp; giảng dạy sau mô đun 02 trước mơ đun 04 - Tính chất: Mơ đun thực lớp phịng thí nghiệm nhằm trang bị cho học viên kiến thức kỹ xác định, pha chế, bảo quản hóa chất môi trường dùng nghề Vi nhân giống lâm nghiệp II Mục tiêu Về kiến thức: - Trình bày phương pháp pha chế, bảo quản hóa chất môi trường vi nhân giống tế bào - Xác định loại hóa chất dùng vi nhân giống - Nắm cách pha chế, bảo quản hóa chất mơi trường ni cấy theo quy trình Về kỹ năng: - Pha chế, bảo quản hóa chất mơi trường ni cấy theo quy trình Về thái độ: - Tham gia đầy đủ buổi học tập lý thuyết thực hành - Chấp hành nghiêm chỉnh quy định học tập giáo viên - Chấp hành nghiêm chỉnh quy định an toàn lao động III Nội dung mơ đun Mã Tên Xác định loại MĐ 03-01 hóa chất dùng vi nhân giống 66 Thời gian Loại dạy Địa điểm Tích hợp Lớphọc/phịng thí nghiệm Tổng Lý Thực số thuyết hành 12 Kiểm tra* Thời gian Loại dạy Địa điểm Pha chế hóa chất MĐ03-02 bảo quản dung dịch mẹ Tích hợp Lớphọc/phịng thí nghiệm 36 29 Pha chế bảo quản MĐ02-03 mơi trường vi nhân giốngvi nhân giống Tích hợp Lớphọc/phịng thí nghiệm 40 32 Mã Tên Tổng Lý Thực số thuyết hành Kiểm tra hết mô đun Cộng 92 Kiểm tra* 16 68 * Ghi chú: Thời gian kiểm tra tính vào thực hành IV Hướng dẫn thực tập thực hành Bài 1: Xác định loại hóa chất dùng vi nhân giống Nguồn lực cần thiết: - Vật liệu: Các loại hố chất mơi trường cần thiết vi nhân giống - Dụng cụ trang thiết bị: + Phòng pha chế bảo quản hóa chất + Cân phân tích (chính xác từ 10-2 – 10-4 gam), Thiết bị cất nước, tủ lạnh, nồi hấp cao áp, máy sấy, máy khuấy từ, bình tam giác, bình trụ, bếp điện (ga), xoong nấu mơi trường, dụng cụ đo lường, chai lọ Cách tổ chức thực Chia lớp làm nhóm Thời gian: Tiêu chuẩn sản phẩm: Nhận dạng, chuẩn bị đầy dủ dụng cụ, danh mục hóa chất dùng ni cấy mơ tế bào Bài 2: Pha chế hóa chất bảo quản dung dịch mẹ Nguồn lực cần thiết: 67 - Dụng cụ: Cốc chứa (cốc đong) có vạch chia, Bình trụ có chia mm, Đũa thủy tinh, Pipettes - Vật liệu: Cồn, Các chất đa lượng, vi lượng, vitamin, chất điều hoà sinh trưởng, HCL, NaOH Cách tổ chức thực Chia lớp làm nhóm Thời gian: 30 Tiêu chuẩn sản phẩm: Pha chế hóa chất gốc chuẩn nồng độ Bài 3: Pha chế bảo quản môi trƣờng vi nhân giống Nguồn lực cần thiết: Dụng cụ: Cốc chứa (cốc đong) có vạch chia, Bình trụ có chia mm, Đũa thủy tinh, Pipettes - Vật liệu: Cồn, Các chất đa lượng, vi lượng, vitamin, chất điều hoà sinh trưởng, HCL, NaOH dung dịch gốc Cách tổ chức thực Chia lớp làm nhóm Thời gian: 34 Tiêu chuẩn sản phẩm: Pha chế hóa chất dùng cho ni cấy khởi đầu, dùng cho nhân nhanh chồi, dùng cho tạo rễ hoàn chỉnh V Yêu cầu đánh giá kết học tập 5.1 Bài Tiêu chí đánh giá Cách thức đánh giá Điểm - Trình bày vai trị, đặc tính lý, hóa học sinh học loại hóa chất dùng vi nhân giống Vấn đáp Lý thuyết: Kỹ năng: - Nhận biết, liệt kê hóa chất phân hóa chất theo nhóm sử dụng 68 Kiểm tra thao tác thực 5.2 Bài Tiêu chí đánh giá Cách thức đánh giá Điểm - Trình bày cách pha chế bảo quản dung dịch mẹ Vấn đáp Lý thuyết: Kỹ năng: - Các bước pha chế dung dịch mẹ Bước 1: Sắp xếp vật liệu thiết bị dụng cụ Bước 2: Cách pha chế dung dịch mẹ (Bảng liệt kê dung dịch mẹ cho môi trường MS pha nồng độ gấp 50 - 100 lần) Kiểm tra thao tác thực - Tiêu chuẩn hình thái - Tiêu chuẩn nồng độ 5.3 Bài Tiêu chí đánh giá Cách thức đánh giá Điểm Vấn đáp Lý thuyết: - Liệt kê danh mục hóa chất dùng pha chế số mơi trường phổ biến vi nhân giống (tên hóa chất, nồng độ liều lượng) - Trình bày cơng thức, cách pha chế, khử trùng bảo quản loại môi trường vi nhân giống - Pha chế loại môi trường vi nhân giống - Khử trùng bảo quản loại môi trường dùng vi nhân giống theo quy trình Kỹ năng: - Cách pha chế môi trường nuôi cấy khởi đầu Kiểm tra thao tác - Cách pha chế môi trường nhân nhanh chồi thực - Cách pha chế môi trường tạo hoàn 69 chỉnh 70 VI Tài liệu tham khảo Trung tâm nghiên cứu nguyên liệu giấy - Tổng công ty giấy Việt Nam (2003), Giáo trình cơng nghệ ni cấy mơ tế bào Viện di truyền nơng nghiệp (1995), Giáo trình hướng dẫn thực tập công nghệ nuôi cấy mô tế bào 71 DANH SÁCH BAN CHỦ NHIỆM CHỈNH SỬA CHƢƠNG TRÌNH DẠY NGHỀ TRÌNH ĐỘ SƠ CẤP (Kèm theo Quyết định số 2949 /BNN-TCCB ngày 03 tháng 11 năm 2010 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn) Chủ nhiệm: Ông Nghiêm Xuân Hội - Hiệu trưởng Trường Cao đẳng Nơng Lâm Thƣ ký: Ơng Nguyễn Văn Vượng - Trưởng khoa Trường Cao đẳng Nông Lâm Các ủy viên: - Ơng Triệu Văn Khơi, Giảng viên Trường Cao đẳng Nơng Lâm - Ơng Trần Minh Cảnh, Giảng viên Trường Cao đẳng Nơng Lâm - Ơng Đặng Văn Tặng, Kỹ sư Trung tâm Cây lâm nghiệp, ăn Bắc Giang./ DANH SÁCH HỘI ĐỒNG NGHIỆM THU CHƢƠNG TRÌNH, GIÁO TRÌNH DẠY NGHỀ TRÌNH ĐỘ SƠ CẤP (Theo Quyết định số 3495 /QĐ-BNN-TCCB ngày 29 tháng 12 năm 2010 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn) Chủ tịch: Ơng Trần Văn Dư - Phó hiệu trưởng Trường Cao đẳng Nơng nghiệp Phát triển nông thôn Bắc Bộ Thƣ ký: Bà Đào Thị Hương Lan - Phó trưởng phịng Vụ Tổ chức cán bộ, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn Các ủy viên: - Bà Kiều Thị Thuyên - Trưởng môn Trường Cao đẳng Nông nghiệp Phát triển nơng thơn Bắc Bộ - Ơng Phạm Xn Mạnh - Trưởng khoa Nông Lâm Trường Cao đẳng nghề Cơ điện - Xây dựng Nông Lâm Trung Bộ - Ơng Nguyễn Viết Khoa - Phó trưởng phịng Trung tâm Khuyến nông Quốc gia./ 72 ... chương trình, giáo trình dạy nghề theo mơ đun Giáo trình mơ đun: Chuẩn bị hóa chất mơi trường vi nhân giống mô đun thứ mơ đun chương trình dạy nghề: Vi nhân giống lâm nghiệp nhằm trang bị cho học vi? ?n...  Trình bày công thức, cách pha chế, khử trùng bảo quản loại môi trường vi nhân giống  Pha chế loại môi trường vi nhân giống  Khử trùng bảo quản loại môi trường dùng vi nhân giống theo quy trình. .. THUẬT NGỮ CHUYÊN MÔN, CHỮ VI? ??T TẮT MÔ ĐUN CHUẨN BỊ HỐ CHẤT VÀ MƠI TRƯỜNG VI NHÂN GIỐNG Giới thiệu mô đun: BÀI 1: XÁC ĐỊNH CÁC LOẠI HÓA CHẤT DÙNG TRONG VI NHÂN GIỐNG