ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRƯƠNG THỊ LAN HƯƠNG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN TẢ Ở NGƯỜI ĐẾN XÉT NGHIỆM TẠI BỆNH VIỆN QUÂN Y 103 NĂM 2013 BẰNG KỸ THUẬT PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRƯƠNG THỊ LAN HƯƠNG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN TẢ Ở NGƯỜI ĐẾN XÉT NGHIỆM TẠI BỆNH VIỆN QUÂN Y 103 NĂM 2013 BẰNG KỸ THUẬT PCR Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. KIỀU CHÍ THÀNH PGS.TS. PHẠM VĂN TY Hà Nội – 2014 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Kiều Chí Thành và PGS.TS Phạm Văn Ty những người đã trực tiếp hướng dẫn về khoa học và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi nghiên cứu, hoàn thành đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị cán khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn – Bệnh viên Quân y 103 đã nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo và chia sẻ với tôi trong thời gian thực tập. Nhân dịp này, tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh học, và các thầy giáo, cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học đã động viên, chỉ dẫn, đóng góp ý kiến và tạo những điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. Hà Nội tháng 12-2014. Học viên: Trương Thị Lan Hương Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 1 1.Lí do chọn đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 1 3. Nội dung nghiên cứu 2 Chương 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 3 1.1. Tình hình bệnh tả 3 1.1.1. Tình hình bệnh tả trên thế giới 3 1.2. Vi khuẩn tả 8 1.2.1. Đặc điểm hình thái 9 1.2.2. Phân loại 9 1.2.3. Kháng nguyên và cấu trúc lớp vỏ vi khuẩn 10 1.2.4. Độc tố của vi khuẩn tả 10 1.2.5. Khả năng gây bệnh 12 1.2.6. Diễn biến bệnh 17 1.2.7. Chẩn đoán 17 1.2.7.1. Thời kỳ ủ bệnh 17 1.2.7.2. Thời kỳ khởi phát 17 1.2.7.3. Thời kỳ toàn phát 18 1.2.8. Một số phương pháp chẩn đoán tả 18 1.3. Tổng quan về kĩ thuật PCR 19 1.3.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR 19 1.3.2. Các giai đoạn của một chu kì phản ứng PCR 19 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 21 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 1.3.4. Ứng dụng kĩ thuật PCR trong y học 23 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26 2.2 Vật liệu nghiên cứu 26 2.2.1. Chủng giống vi sinh vật 26 2.2.2. Mồi PCR 26 2.3. Hóa chất và thiêt bị 27 2.3.1. Hóa chất 27 2.3.2. Thiết bị 28 2.3.3. Môi trường nuôi cấy và dung dịch đệm 28 2.4. Phương pháp nghiên cứu 28 2.4.1. Phương pháp mô tả 28 2.4.1.1. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu 29 2.4.1.2. Các kỹ thuật lấy mẫu và vận chuyển bệnh phẩm 29 2.4.2. Phương pháp cấy truyền và giữ giống vi sinh vật 30 2.4.3. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen appA và phyC 31 2.4.4. Tách chiết ADN khuôn mẫu bằng KIT QIAGEN 31 2.4.5. Phương pháp m-PCR dùng để xác định nhanh serogroup O1, O139 và hai biotype của V. cholerae serogroup O1 32 2.4.5.1. Phản ứng m-PCR1 32 2.4.5.1. Phản ứng m-PCR2 33 2.4.6. Điện di sản phẩm PCR 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35 3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 35 3.1.1. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới tính, lứa tuổi 35 3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen mã hóa cholera toxin ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR. 38 3.2.1. Phân tích trình tự gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR 38 3.1.2. Thiết kế mồi nhân gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR từ V. Cholerae 46 3.3. Khuếch đại gen ctxA, rfb từ V. Cholerae bằng phản ứng m-PCR1 47 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 3.4. Khuếch đại gen tcpA, rstR từ V. Cholerae bằng m-PCR2 50 3.5. So sánh phương pháp chẩn đoán tả bằng kĩ PCR với kĩ thuật chẩn đoán tả bằng kĩ thuật nuôi cấy kết hợp sử dụng kháng huyết thanh 63 KẾT LUẬN 54 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1. Phân lập V. cholerae týp cổ điển và týp El Tor 3. Bảng 2.1. Các đoạn mồi dùng trong kỹ thuật m-PCR phát hiện gen đặc hiệu của V. cholerae 27 Bảng 2. 2. Hỗn hợp phản ứng cho m-PCR1 đa mồi bằng Master-Mix (promega) 32 Bảng 2. 3. Hỗn hợp phản ứng cho m-PCR2 đa mồi bằng Master-Mix (promega) 33 Bảng 3.1. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, tuổi 35 Bảng 3.2. Tỷ lệ bệnh nhân theo tuổi 36 Bảng 3.3. Phân bố bệnh nhân dương tính V. cholerae theo giới tính 37 Bảng 3.4. Danh sách các chủng V. Cholerae đã được nghiên cứu để thiết kế mồi 38 Bảng 3.5. Danh sách các chủng V. cholera O1 đã được sử dụng để thiết kế mồi 40 Bảng 3.6. Danh sách các chủng V. cholera O139 đã được sử dụng để thiết kế mồi 41 Bảng 3.7. Danh sách các chủng V. cholera O1 El Tor đã được sử dụng để thiết kế mồi 42 Bảng 3.8. Danh sách các chủng V. cholera O1 đã được nghiên cứu để thiết kế mồi nhân gen rstR 44 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của các thông số trong chu kỳ nhiệt đến phản ứng PCR khuếch đại gen ctxA, rfb 48 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của các thông số trong chu kỳ nhiệt đến phản ứng PCR khuếch đại gen tcpA, rstR từ V. Cholerae bằng m-PCR2 51 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Tình hình bệnh tả tại Việt Nam từ năm 2002 – 2011 7 Hình 1.2. Phân bố ca bệnh tả tại Việt Nam, 2007 – 2011 8 Hình 1.3. Hình thái ngoài vi khuẩn tả V. cholerae 8 Hình 1.4. Biểu đồ khu trú của vi khuẩn trong ruột 13 Hình 1.5. Cơ chế gây bệnh của Vibrio bên trong cơ thể người 14 Hình 1. 6. Các bước thực hiện phản ứng PCR một chu kỳ 20 Hình 3.1. Biểu đồ phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới tính 35 Hình 3.2. Biểu đồ đánh giá độ tuổi trong thu thập mẫu 37 Hình 3.3 Kết quả so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ và 3’) của 4 gen mã hóa cholera toxin có nguồn gốc từ V. cholerae 39 Hình 3.4 Trình tự gen ctxA mã hóa cholera toxin từ V. cholerae được sử dụng để thiết kế mồi . 39 Hình 3.5 Kết quả so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ và 3’) của 2 gen rfbQ có nguồn gốc từ V. cholerae O1 40 Hình 3.6. Trình tự gen rfbQ từ V. cholerae O1 được sử dụng để thiết kế mồi. 41 Hình 3.7. Kết quả so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ và 3’) của gen IS1358 từ 3 chủng V. cholera O139 41 Hình 3.8. Trình tự gen IS1358 từ V. cholerae O139 được sử dụng để thiết kế mồi 42 Hình 3.9. Kết quả so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ và 3’) của gen tcpA từ 6 chủng V. cholera O1 biotype El Tor 43 Hình 3.10. Trình tự gen tcpA từ V. cholerae O1 được sử dụng để thiết kế mồi. 44 Hình 3.11. Kết quả so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ và 3’) của 6 gen mã hóa toxin coregulated pilus có nguồn gốc từ V. cholera O1 biotype Classical. 45 Hình 3.12. Trình tự gen rstR từ V. cholerae O1 được sử dụng để thiết kế mồi]…………46 Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm m-PCR1 nhân gen ctxA, gen rfb O1 và rfb O139………….… … 49 Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm m-PCR2 nhân gen tcpA, rstR từ V. Cholerae 52 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tên đầy đủ AOX Alcohol Oxidase bp Base pair CS Cộng sự TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose ( Môi trường chọn lọc nuôi cấy vi khuẩn tả ) V.cholerae Vibriocholerae (Vi khuẩn tả ) Kb Kilo base KDa Kilo Dalton IU International Unit PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium Dodecyl Sulfate VSV Vi sinh vật CT Cholerae Toxin ( Độc tố tả ) N.A.G Non Aglutinable Vibrios NCBI National Center for Biomedical Informatics m- PCR Multiplex Polymerase Chain Reaction Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 1 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Vibrio cholerae là tác nhân quan trọng nhất gây bệnh dịch tả trên người, đặc biệt hai serogroup O1, O139 [49], gây chết hàng triệu người mỗi năm trên thế giới [60]. Dịch tiêu chảy cấp đang có chiều hướng gia tăng ở các địa phương ở nhiều địa phương. Khống chế dịch tả là mục tiêu lớn trong chương trình quốc gia phòng chống bệnh tiêu chảy của Việt Nam. Với những thành tựu và kinh nghiệm phòng chống dịch tả trong nhiều năm qua, ngày nay bệnh tả không còn là nỗi khiếp đảm của mỗi người dân, của các tổ chức chính quyền và xã hội. Các điều kiện chuẩn mực về kiểm soát môi trường ở nước ta còn lạc hậu. Các vấn đề cung cấp nước, vệ sinh thực phẩm, dinh dưỡng an toàn và vấn đề xử lý vệ sinh chất thải chưa làm được bao nhiêu, nhiều nơi còn bị buông lỏng hoặc quên lãng. Bệnh nhân mắc bệnh tả nếu không được phát hiện sớm và điều trị kịp thời sẽ bị mất nước và chất điện giải dẫn đến tử vong [53]. Bệnh tả lây truyền rất nhanh qua đường tiêu hoá và môi trường (nước, chất nôn, phân, rác) do vậy việc phát hiện sàng lọc mẫu âm tính nhanh có ý nghĩa hết sức quan trọng, không những giúp đỡ bệnh nhân có ngay phác đồ điều trị mà còn giúp các nhà dịch tễ có hướng xử lý khoanh vùng, chủ động trong phòng chống dịch, không để dịch lây lan rộng trong cộng đồng. Trong đó phương pháp nuôi cấy và phân lập được thực hiện phổ biến để định danh loài vi khuẩn này và được xem như tiêu chuẩn vàng. Tuy nhiên chi phí cao, tốn nhiều thời gian và nhân công đồng thời cũng không thể phân biệt một cách chính xác giữa V. cholerae chủng sinh độc tố và không sinh độc tố [15]. Vấn đề phát hiện nhanh và chính xác V. cholerae là việc làm cần thiết. Cho nên m- PCR được xem là công cụ hữu hiệu để giúp xác định nhanh Vibrio gây bệnh, nhất là xác định nhanh các serogroup và biotype của V. cholerae [38]. Đáp ứng với tình hình thực tiễn kể trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: "Chẩn đoán vi khuẩn tả ở người đến xét nghiệm tại bệnh viện Quân y 103 năm 2013 bằng kỹ thuật PCR". 2. Mục đích nghiên cứu  Xác định tỷ lệ bệnh nhân dương tính với Vibrio cholerae (V. cholerae) trong giai đoạn từ tháng 3 năm 2013 đến tháng 7 năm 2013. [...]... từ tháng 3 năm 2013 đến tháng 7 năm 2013  Thu thập mẫu nghiên cứu từ những bệnh nhân mắc bệnh tiêu ch y cấp nghi ngờ mắc tả tại khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn tại bệnh vi n Quân y 103 Chẩn đoán xác định V cholerae và thực hiện kỹ thuật PCR tại khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn tại bệnh vi n Quân y 103 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Chủng giống vi sinh vật  Gồm các chủng V Cholerae phân lập được từ bệnh nhân trong... g y bệnh tả là V cholerae lần đầu tiên được Pacini người Ý mô tả năm 1854 khi ông tìm th y rất nhiều vi khuẩn hình cong trong ruột của bệnh nhân bị tả Năm 1883 Robert Koch cũng tìm th y tác nhân có hình thể tương tự khi ông nghiên cứu bệnh tả ở Ai Cập, ông mô tả vi khuẩn có hình dấu ph y và Koch đặt tên là Vibrio comma, tên n y được dùng m y chục năm trước khi người ta đổi tên là V cholerae, để tưởng... hoành" của vi khuẩn tả đã được "khoanh vùng" và cho đến những năm gần đ y chủ y u bệnh xuất hiện ở Đông nam Á Năm 1961 týp "El Tor" g y dịch tại Philippin và tạo "làn sóng thứ b y" Từ đó trở đi typ vi khuẩn n y tiếp tục g y những vụ dịch tại châu Á, vùng Trung Đông, châu Phi và một phần châu Âu [2, 5, 10, 57] Năm 1883, Robert Koch (nhà vi sinh vật người Đức) phân lập thành công vi khuẩn từ phân của bệnh. .. đó 821 người tử vong Từ đó đến nay, ở miền Trung và miền Nam bệnh tả x y ra dưới dạng lưu hành, hàng năm có hàng trăm bệnh nhân bị bệnh tả được thông báo Năm 1994 sau hàng chục năm vắng bóng, bệnh tả xuất hiện lại ở khu vực T y Nguyên Chuyên ngành Vi sinh vật học 6 Khóa 2011 -2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương (các tỉnh Đắc Lắc, Lâm Đồng, Gia Lai) với 1.459 bệnh nhân mắc bệnh tả được... Dịch tả hiện nay vẫn là gánh nặng đối với ngành y tế và toàn xã hội Năm 1993 dịch x y ra ở 21 tỉnh với 3.460 người mắc bệnh Năm 1994 dịch xuất hiện ở cả miền Bắc, Trung, Nam và T y Nguyên với 4.123 trường hợp bị bệnh Năm 1995 có 29 tỉnh, thành phố báo cáo có bệnh nhân mắc tả với 6.088 trường hợp mắc bệnh tả Năm 1996, cả nước có 630 trường hợp mắc bệnh tả El Tor ở 19 tỉnh, thành phố Vài năm gần đ y từ... định vi khuẩn tả xuất phát từ thực phẩm Hình 1.1 Tình hình bệnh tả tại Vi t Nam từ năm 2002 – 2011 [427] Chuyên ngành Vi sinh vật học 7 Khóa 2011 -2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương Miền Bắc: 3.477 ca 95,3% Miền Trung: 1 ca 0,02% T y Nguyên: 0 ca 0% Miền Nam: 170 ca 4,7% Hình 1.2 Phân bố ca bệnh tả tại Vi t Nam, 2007 – 2011 [4] 1.2 Vi khuẩn tả Hình 1.3 Hình thái ngoài vi khuẩn tả V... bình thường Vài dữ kiện cho th y có sự giảm khả năng sản xuất acid dạ d y trên bệnh nhân tả Điều n y có thể do ph y khuẩn tả có khuynh hướng chọn lựa những bệnh nhân ít khả năng sản xuất dịch vị để g y bệnh hoặc do bệnh tả đã ảnh hưởng đến sự điều hoà tiết acid dịch vị Vì v y, mặc dù bệnh cảnh chính y u của sự mất nước trong dịch tả đã được hiểu rõ, người ta nghĩ rằng h y còn nhiều vấn đề cần được tìm... tiêu ch y mất nhiều nước là do độc tố ruột g y ra được gọi Chuyên ngành Vi sinh vật học 10 Khóa 2011 -2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương là độc tố tả cholerae toxin (CT) Những nghiên cứu trên người tình nguyện cho th y CT là nguyên nhân chủ y u g y bệnh tả, tuy nhiên các chủng tả nếu loại bỏ gen mã hoá CT vẫn có thể x y ra tiêu ch y nhẹ hoặc vừa ở nhiều cá thể Điều n y có thể suy ra còn... thuốc của vi khuẩn Từ trước đến nay, tính kháng thuốc của vi khuẩn g y bệnh được xác định bằng các kỹ thuật dựa trên nuôi c y như kháng sinh đồ theo Kirby Bauer (khuếch tán trên thạch) và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC - Minimal Inhibitory Concentration) Các kỹ thuật n y chiếm nhiều thời gian nên khó cho phép có định hướng điều trị kịp thời trong các bệnh nhiễm khuẩn cấp Ngoài ra, các kỹ thuật. .. cả các bệnh vi n tư nhân ở Recife cho kết quả trong 1.435 mẫu chỉ có 1 mẫu dương tính với V cholerae El-Tor Inaba (0.07%), 17 mẫu dương tính (1.2%) gồm V cholerae non O1, V fluvialis, V fumissii, V parahaemolyticus, V spp và rất ít gặp ở những người có điều kiện xã hội khá, ngay cả khi dịch đang x y ra [49] 1.1.2.Tình hình bệnh tả ở Vi t Nam Bệnh tả là nguyên nhân quan trọng g y tiêu ch y cấp ở Vi t . CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN TẢ Ở NGƯỜI ĐẾN XÉT NGHIỆM TẠI BỆNH VI N QUÂN Y 103 NĂM 2013 BẰNG KỸ THUẬT PCR Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI. tài: " ;Chẩn đoán vi khuẩn tả ở người đến xét nghiệm tại bệnh vi n Quân y 103 năm 2013 bằng kỹ thuật PCR& quot;. 2. Mục đích nghiên cứu  Xác định tỷ lệ bệnh nhân dương tính với Vibrio cholerae. HỌC TỰ NHIÊN TRƯƠNG THỊ LAN HƯƠNG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN TẢ Ở NGƯỜI ĐẾN XÉT NGHIỆM TẠI BỆNH VI N QUÂN Y 103 NĂM 2013 BẰNG KỸ THUẬT PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC