Khoá luận tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU Việc nghiên cứu, sử dụng các hợp chất thiên nhiên làm thuốc để chữa trị các bệnh của con người đang là hướng thu hút sự tập trung của các nhà khoa học, đặc biệt là các nhà hoá học hữu cơ và các nhà hoá học các hợp chất thiên nhiên. Nhờ những nghiên cứu này mà một loạt các thuốc có nguồn gốc từ thảo dược đã và đang được sử dụng rộng rãi trong y dược. Điểm thuận lợi của các hợp chất này là Ýt độc, dễ hoà hợp với người và nguồn cung cấp chúng thường rất phong phú với việc gây trồng có thể thực hiện được dễ dàng. Artemisinin, mét sesquiterpen có trong cây Artemisia annua hay còn gọi là thanh hao hoa vàng có hoạt tính kháng sốt rét rất mạnh, hợp chất này đã được các nhà nghiên cứu Trung Quốc phân lập từ những năm 70. Gần đây, các nhà khoa học Mỹ còn nhận thấy, hợp chất này có khả năng tiêu diệt các tế bào ung thư vú và bạch cầu. Do vậy, việc phân lập, xác định cấu trúc và nghiên cứu hoạt tính chống sốt rét và chống ung thư của hợp chất này góp phần làm sáng tỏ phần động của hoá học các hợp chất thiên nhiên đó là môi tương quan giữa hoạt tính sinh học và cấu trúc của hợp chất hữu cơ. NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001 Khoá luận tốt nghiệp PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ TERPEN. 1.1.1. Định nghĩa terpen và sự phân bố trong tự nhiên. Khái niệm terpen được dùng để chỉ một lớp hợp chất thiên nhiên mà cấu trúc có thể phân chia ra thành các đơn vị isopren [1]. Theo qui tắc isopren mà người ta phân biệt ra các monoterpen C 10 , sesquiterpen C 15 , diterpen C 20 ,sesterterpen C 25 , triterpen C 30 , tetraterpen C 40 , và polyterpen. Các terpen này có thể có cấu tạo mạch hở, hoặc một, hai, ba, bốn, năm vòng; các vòng có thể có từ ba đến mười bốn mắt vòng. Thông thường ở các mono-, sesqui-, di- và sesterterpen, các đơn vị isopren nối với nhau theo cách đầu nối với đuôi. Các triterpen và nhiều tetraterpen (các carotenoid) thì hợp bởi hai mảnh C 15 hoặc C 20 nối với nhau ở giữa theo cách đầu nối với đầu. Tính đồng nhất về mặt cấu trúc đó được thể hiện trong các thí dụ sau: CH 2 OH O OH Monoterpen Farnesol (Sesquiterpen) OH O HO H CH 2 OH Quinon-methin (Diterpen) Ceroplastol-1 (Sesterterpen) NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001 Khoá luận tốt nghiệp HO Lanosterol (Triterpen) Hình 1: Sự đồng nhất về cấu trúc của các terpen. Bên cạnh thuật ngữ “terpen” ta còn dùng khái niệm “terpenoid” [2] để bao hàm rộng rãi cả các sản phẩm thoái biến tự nhiên, thí dụ các ionon, và các dẫn xuất tự nhiên cũng như tổng hợp của các terpen, thí dụ như các terpen- ancol, -andehit, -xeton, -axit, -este, -epoxit, v.v Tuy nhiên trong khi sử dụng thường không có sự phân ranh giới thật rõ rệt giữa các khái niệm “terpen” và “terpenoid” như vừa nêu. Thuật ngữ “terpen” nhiều khi được dùng để bao hàm cả các terpen-hidrocacbon lẫn các dẫn xuất của chúng. Các terpen phân bố rộng rãi trong tự nhiên, xuất hiện trong tất cả các loài sinh vật nhất là trong giới thực vật bậc cao. Mỗi loài cây riêng biệt thường có chứa những thành phần terpen đặc trưng vì vậy việc xác định thành phần các terpen trong cây có thể góp phần vào phân loại thực vật (Chemotaxonomie). Các mono- và sesquiterpen xuất hiện chủ yếu trong các tinh dầu; sesqui-, di- và triterpen có trong các dầu nhựa và nhựa; tetraterpen trong các chất màu thực vật (các carotenoid) và các polyterpen có trong nhựa mủ cây. 1.1.2. Cấu trúc của terpen Các terpen được cấu tạo từ các đơn phân là isopren CH 2 = C – CH = CH 2  CH 3 Các terpen được phân chia ra làm nhiều loại, song chúng tôi chỉ giới thiệu monoterpen và đi sâu vào nghiên cứu các sesquiterpen. NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001 Khoá luận tốt nghiệp 1.1.2.1. Monoterpen Phần lớn các monoterpen xuất hiện trong thiên nhiên, nhất là các hợp chất chứa oxi, có mùi dễ chịu, và vì vậy ngoài việc lấy ra từ nguồn thiên nhiên chúng còn được tổng hợp với lượng lớn để dùng trong công nghiệp hương liệu [3]. Trong số các monoterpen không vòng gồm ocimen, myrcen và alloocimen thì myrcen tồn tại dưới hai đồng phân, còn mỗi hydrocacbon kia thì đều tồn tại dưới bốn đồng phân. α-myrcen β-myrcen cis-α-ocimen trans-α-ocimen cis-β-ocimen trans-β-ocimen Ngoài ra các monoterpen còn chứa các nhóm chức ancol, aldehit, với các bộ khung khác nhau. H H 3 C CH 3 CH 3 CH 2 OH CH=O H 3 C CH 3 CH 3 H CH=O H 3 C CH 3 CH 3 Geraniol Neral Citronellal Trong khoảng ba chục năm trở lại đây người ta tìm thấy trong các cây thuộc họ Compositae một sè monoterpen có khung cacbon được cấu tạo không tuân theo qui tắc isopren [4]. Đó là các monoterpen mạch không vòng thuộc các kiểu khung artemisyl, santolinyl, lavandulyl cùng với một vài monoterpen đơn vòng thuộc khung chrysanthemyl. Về mặt nguồn gốc sinh học, người ta cho rằng các monoterpen không vòng có cấu tạo bất bình NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001 Khoá luận tốt nghiệp thường đó được hình thành từ một tiền chất, tiền chất này được giả định là chrysanthemyl pyrophosphat thông qua sự chuyển vị của ion cyclopropylcarbinyl. Các kiểu khung: artemisyl santolinyl lavandulyl chrysanthemyl Ngoài ra, đáng chú ý là các monoterpen một vòng [3]. Phần lớn các monoterpen một vòng có khung 1-metyl-4-isopropyl-xiclohexan, còn được gọi là khung “p-menthan”. Về phương diện cấu dạng ta có thể coi các monoterpen một vòng này là các dẫn xuất thế hai lần của xiclohexan, ở đó nhóm isopropyl, do chiếm khoảng không gian lớn hơn nhóm metyl, nên chiếm vị trí equatorial. Các nguyên tử cacbon của khung p-menthan được đánh số theo qui tắc chung của danh pháp hoá học. 1 2 3 4 5 6 7 Các nhóm chức tiêu biểu thường xuất hiện trong monoterpen một vòng Nhóm alcohol: ví dô α-terpineol, menthol, piperitol và carveol Nhóm aldehit: ví dô perillaldehit, phellandral Nhóm xeton: ví dô menthon, pulegon, piperiton, carvon. Nhóm oxit: ví dô 1,8-cineole, ascaridole. NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001 Khoá luận tốt nghiệp CH 3 H 3 C CH 3 OH CH 3 H 3 C CH 3 OH CH=O H 3 C CH 2 CH=O H 3 C CH 3 α-Terpineol Menthol Perillaldehit Phellandral CH 3 H 3 C CH 3 O CH 3 H 3 C CH 3 O CH 3 H 3 C CH 3 O CH 3 H 3 C CH 3 O Menthon Pulegon 1,8-Cineole Ascaridole Trong công nghiệp hương liệu, chất α-terpineol được sử dụng khá nhiều cùng với este của nó - chất terpinylaxetat.terpineol có trong một số tinh dầu như tinh dầu từ gỗ của một số loại thông. Ngoài ra, các monoterpen có thể chứa 2 vòng, các monoterpen 2 vòng tiêu biểu: CH 3 8 7 6 5 4 3 2 1 9 CH 3 (+)-cis-thujan (+)-trans-thujan β 1.1.2.2. Sesquiterpen Các sesquiterpen thường xuất hiện trong các thực vật thượng đẳng, một số Ýt cũng gặp trong giới thực vật hạ đẳng và trong giới động vật (như sâu bọ). Đa số các sesquiterpen là các hidrocacbon không no (còn có cả một số ankyl), còn lại là các alcohol, xeton,aldehit, axit cacboxylic. Ngoài ra, chúng còn có thể có thêm vòng este từ ba đến bảy cạnh cũng như vòng furan. Ta cũng cần kể đến các sesquiterpen được thế bởi clo hoặc brom và các hợp chất NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001 Khoá luận tốt nghiệp nitơ có 15 nguyên tử C (các sesquiterpenancaloid). Từ một số các sesquiterpen đã hình thành một số hợp chất với 12 hoặc 14 nguyên tử C (các nor-sesquiterpen). Gần đây người ta chó ý nhiều đến việc nghiên cứu các sesquiterpenlacton, là chất phổ biến xuÊt hiện trong các cây thuộc họ cóc (Compositae), tuy nhiên cũng có nhiều trong họ cây khác. Hợp chất đầu tiên thuộc nhóm này được phân lập dưới dạng tinh thể là α-santonin (1930). Đến nay, ta đã biết đến hàng trăm sesquiterpenlacton, phân ra thành các germacranolid, guaianolid, pseudoguaianolid, Đa số các hợp chất này là các γ-lacton no hoặc không no α, β. Bên cạnh đó cũng có một Ýt δ-lacton, và một vài β-lacton (như anisatin, neoanisatin). Ngoài khoảng trên hai chục dilacton, ta cũng biết đến một trilacton là chất bilabolid. Theo Ruzicka cũng như Hendrickson thì về mặt phát sinh sinh vật học, chất tiền thân của hầu hết các sesquiterpen là chất 2-cis-6-trans- farnesylpyrophosphat hoặc các hợp chất 2-trans-6-trans tương ứng, hình thành từ coenzyme A đi qua axit mevalonic, iso pentenylpyrophosphat và geranylpyrophosphat. Đối với một số Ýt sesquiterpen, do các nguyên nhân về hoá lập thể mà chất tiền thân có lẽ là một cấu trúc 2-trans-6-cis-farnesyl hoặc nerolidyl. Do tách đi nhóm pyrophosphat ra khái 2-cis-6-trans- farnesylpyrophosphat hoặc 2-trans-6-trans-farnesylpyrophosphat mà hình thành các cacbocation, việc biểu diễn các ion này dưới dạng các cation không kinh điển cho phép ta hình dung được sự đóng vòng để từ mỗi cation này hình thành được hai cation dạng vòng. Từ các cation này thông qua các chuyển dịch hidrua 1,2 hoặc 1,3 ; các phản ứng đóng vòng tiết chế bởi các hiệu ứng điện tử và lập thể thực hiện với hai nối đôi còn lại (đóng vòng tuân theo hoặc không tuân theo qui tắc Maccopnhicop), các chuyển vị Wagner-Meerwein và các chuyển dịch 1,2 của các nhóm metyl mà sinh ra đa số các sesquiterpen.Ở đây, sự tạo thành các đồng phân đối quang và các đồng phân quang học không đối quang theo con đường phát sinh sinh học có một ý nghĩa quan NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001 Khoá luận tốt nghiệp trọng. ở đây cũng cần nói thêm rằng nhiều giả thuyết về sự phát sinh sinh học của các sesquiterpen còn cần được chứng minh trong cơ thể sống. Dưới đây là một số khung sesquiterpen và một số sesquiterpen tiêu biểu. HO H 3 C CH 3 CH 3 CH 3 H 3 C CH 3 CH 3 CH 3 Nerolidol Zingiberen Bisabolen Ngoài ra còn có rất nhiều sesquiterpen một vòng khác tiêu biểu là Zingiberen và Bisabolan, xuất hiện khá đông đảo và phổ biến trong thiên nhiên. H HOH 2 C HO O O H H H H H H Iresin ε-bulgaren γ-amorphen α-muurolen Ta cũng cần kể đến một nhóm riêng các hợp chất khung cadinan có quan hệ với nhóm trên theo kiểu đối quang, nhóm chất này xuất hiện chủ yếu trong tinh dầu Hương lau của miền Bắc Ên độ. Đại diện cho nhóm chất này là (-)-γ 2 -cadinen và chất norsesquiterpenoid khusiton H H O H H γ 2 -cadinen khusiton NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001 Khoá luận tốt nghiệp Nhóm này có rất nhiều trong những tinh dầu có màu xanh hoặc tím hoặc tạo nên những màu như thế sau khi khử hidro với sulfur, selenium hoặc palladium. Cấu trúc của α- và β-vetivon được xem như là các hydroazulenon. Dưới đây là một số chất tiêu biểu cho nhóm. 7 2 6 4 3 5 8 1 O H 3 C H 3 C H 3 C H H O H 3 C H 3 C H 3 C H 3 C Azulen Hydroazulenon β-vetivon Ngoài ra còn một số sesquiterpen có cấu trúc lớn và phức tạp như caryophyllen. H 3 C CH 3 H CH 3 H Caryophyllen Trong nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc của các hợp chất theo sự định hướng hoạt tính sinh học, lớp sesquiterpen thường có hoạt tính cao, đặc biệt là các hoạt tính kháng nấm, khuẩn, hoạt tính kháng viêm, chống oxi hoá và chống ung thư. Việc nghiên cứu các sesquiterpen trong thực vật giúp chúng ta hiểu rõ mối tương quan giữa hoạt tính và cấu trúc cũng như sự định hướng nghiên cứu được rõ ràng hơn. 1.2. HOẠT TÍNH CHỐNG SỐT RÉT CỦA CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN Các thử nghiệm in vitro [6] trở thành phương pháp có thể dùng được trong những năm gần đây. Xa hơn nữa, từ những năm 1947, 600 thực vật từ 126 loài đã được chiết và dịch chiết đã được thử nghiệm hoạt tính in vitro NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001 Khoá luận tốt nghiệp chống lại bệnh sốt rét của loài chim. Một số cây từ hơn 30 loại đã được tìm thấy có một số hoạt tính này, nhưng sự ngoại suy với hoạt tính kháng sốt rét đối với các kÝ sinh trùng sốt rét của người thì vẫn không chắc chắn. Sự tiếp tục nuôi cấy in vitro các ký sinh trùng sốt rét người Plasmodium falciparum đã dẫn đến một kĩ thuật cho việc đánh giá định tính về hoạt tính kháng các kÝ sinh trùng này. Sự tiếp tục phát triển của kĩ thuật này rất tin cậy dựa vào việc đo khả năng ức chế sự hợp nhất của 3 H-hypoxanthin vào trong trùng sốt rét. Kĩ thuật này được ứng dụng dễ đánh giá hoạt tính của các dịch thô (etanol) của Artermisia annua và A.vulgaris (cây ngải cứu). Thử nghiệm in vitro này tách bạch giữa hai loại dịch chiết với giá trị IC 50 lần lượt là 3.9 µl/ml và 250 µl/ml. Artermisia annua được sử dụng trong việc điều trị bệnh sốt rét truyền thống của Trung Quốc và chất thể hiện hoạt tính là artemisinin (1) mà chất này không có trong A.vulgaris. Điều đáng chú ý rằng hoạt tính chống sốt rét in vitro không song song với việc thể hiện độc tính chống lại các tế bào KB (human epidernoid carcinomax of the mouth). Bởi vậy một chất có hoạt tính gấp nhiều lần chất kia trong việc thử nghiệm chống sốt rét nhưng lại có thể độc gấp 10 lần đối với các tế bào KB. 1.2.1. Các phương pháp thử hoạt tính sinh học được dùng cho sự phát hiện thuốc có khả năng chống sốt rét. 1.2.1.1. Sàng lọc in vitro Thông thường hai dòng P.falciparum được dùng để nghiên cứu, một dòng nhạy đối với chloroquin như 3D7 và một dòng chống lại chloroquin như Dd2. Các hồng cầu ngoại biên của máu người được sử dụng trong các nghiên cứu sàng lọc in vitro. Các kÝ sinh trùng được thêm vào hồng cầu và nuôi cấy ở 37 o C trong khí quyển bao gồm 2% O 2 , 5%CO 2 và 93% N 2 [7]. Ảnh hưởng của dịch chiết thực vật hoặc các phân đoạn dịch chiết lên sự phát triển của P.falciparum được thử bằng việc thêm 50 µl dung dịch mẫu thử vào 50 µl hồng cầu đã được thêm kÝ sinh (5*10 8 tế bào/ml với một lượng trung bình NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001 [...]... gõy nhim vi 10 7 hng cu ó nhim kí sinh trựng vi dũng kí sinh trựng P.berghei c s dng Mt khỏc, cỏc thc nghim c tin hnh nh ó mụ t phn trờn i vi chut nht iu khụng thun li cỏc mụ hỡnh chut Cỏc chuyn hoỏ thuc trong cỏc ng vt ny khỏc vi ngi v trong chỳng cú hot tớnh huyt thanh gii c cao Sinh hc ca cỏc loi kí sinh trựng c th trong cỏc mụ hỡnh ny l khỏc vi sinh hc ca loi kí sinh trựng ngi , vớ d khụng cú... thuc chng li cỏc kí sinh trựng ca ngi P.vivax Khi lng kí sinh trựng t ti 1%, cỏc con kh ó gõy nhim c iu tr vi hp cht th cú th bng ng tiờm ven hoc ng ung Lng kí sinh trựng c xỏc nh hng ngy bi cỏc m dy v bt kỡ khi no nu thy cn thit thỡ xỏc nh bng PCR nhn dng DNA ca cỏc kí sinh trựng Cỏc hp cht s c th ti cỏc im cú hm lng kí sinh trựng cao nu nh chỳng th hin tỏc dng tt ti thi im hm lng kí sinh trựng 1% 1.3... nghip artemisinin Tuy võy, cỏc sn phm hoc enzym sau fanesyl pyrophosphat v trc axit atermisinic, arteannuin B v artemisinin vn cha c phõn lp PPO PPO PPO Geranyl pyrophosphat trans-FPP cis-FPP COOH Axit artermisinic O O O O O O COOH Axit dihidroartemisinic O O Artemisinin Arteannuin B Hỡnh 2: Cỏc con ng sinh tng hp artemisinin Nguyễn Thanh Huyền Lớp KSCNSH - 0001 Khoỏ lun tt nghip Nh vy con ng sinh tng... trin ca kí sinh trựng l vic m cỏc kí sinh trựng bng kớnh hin vi Cỏc m bn mng ca nuụi cy kí sinh trựng nhn c sau khi ấm vi cỏc nng dch cht khỏc nhau hoc cỏc mu th khỏc nhau c nhum mu vi Giemsa v kí sinh trựng c xỏc nh nh l phn trm ca hng cu b nhim th hot tớnh ca cỏc mu th trờn cỏc giai on khỏc nhau ca hng cu, s nuụi cy xy ra ng thi i vi giai on mi to vũng do phõn gii sorbitol Cỏc hng cu cú kí sinh trựng... nay, chúng ta ó chn c ging cõy ny cho nng sut artemisinin cao (t 3,5-5 kg/tn) v cú th trng c nhiu ni trờn t nc 1.3.1 Artemisinin v hot tớnh khỏng st rột Artemisinin l hot cht chớnh ca cõy ngi hoa vng [13] Vo thp k 70, cỏc nh khoa hc Trung Quc l nhng ngi u tiờn ó chit sut thnh cụng artemisinin trong cõy ny lm thuc chng st rột, mt cn bnh cp i hng triu sinh mng mi nm, ch yu cỏc nc nghốo Chõu , Chõu... vỳ, sau khi dựng artemisinin 8 gi thỡ 75% t bo ung th b tiờu dit m khụng cú bt kỡ di chng no i vi cỏc t bo bỡnh thng Tng t vy, cỏc th nghim vi bnh bch cu cng ó ch ra rng, artemisinin ch tiờu dit cỏc t bo b bnh 1.3.2 C ch tỏc dng ca artemisinin i vi cỏc kí sinh trựng (KST) st rột th vụ tớnh trong hng cu õy l giai on KST st rột hu dit hng cu rt nhanh, gõy phn ng rột run ngi bnh Khi cú mt artemisinin, cu... cu, s dng artemisinin v cỏc dn xut ca nú iu tr ung th ngoi vic cha tr cỏc bnh st rột iu ny thnh cụng s m ra kh nng tim tng v vic s dng cỏc cht cú ngun gc thiờn nhiờn, c bit l cỏc cõy thuc bn a ca Vit Nam cha tr cỏc bnh nan y vi c tớnh u vit sn cú, r tin hn nhiu so vi cỏc loi hoỏ tr liu cha ung th hin dựng 1.3.3 Sinh tng hp artemisinin trong Artemisia annua Mc dự con ng sinh tng hp hon ton artemisinin. .. cha c thit lp hon ton [14,15], tuy vy mt vi bc bin i sinh hc cng ó c minh chng dng in vitro v in vivo (Hỡnh 2) Akhila v cỏc cng s ó ngh mt con ng sinh tng hp hon ton artemisinin t axit mevalonic v izopentenyl pyrophosphat Th t sinh tng hp do nhúm ny a ra nh sau Farnesylpyrophosphat khung germacrane dihidrocostunolide cadinanolid arteanuin B artemisinin Tuy nhiờn khi nghiờn cu thnh phn hoỏ hc... trao i ó ỏnh du phúng x ó c mang trờn cỏc kí sinh trựng, ta tin hnh m chỳng Mt s hp th nh hn trong cỏc kí sinh trựng ó ấm vi cỏc mu th c quan sỏt cựng vi cỏc mu so sỏnh a ra mt s o v kh nng c ch s phỏt trin ca cỏc kí sinh trựng [8] Phng phỏp khỏc cú th dựng ỏnh giỏ kh nng c ch s phỏt trin ca cỏc kí sinh trựng l o ph hot tớnh dehidro hoỏ lactat ca cỏc kí sinh trựng Phộp th ny s dng s chuyn hoỏ cỏc... tớn hiu cng hng cựng mt v trớ Ph 1H-NMR ca artemisinin [hỡnh 10, ph lc 3]c ghi ti 500 MHz cho thy cỏc tớn hiu cng hng ca cỏc proton khỏc nhau trong phõn t artemisinin Nguyễn Thanh Huyền Lớp KSCNSH - 0001 Khoỏ lun tt nghip Hỡnh 10: Ph 1H-NMR ca artemisinin Kt qu xỏc nh cỏc proton trong phõn t artemisinin c a ra bng sau: Bng 1: Cỏc d liu cu trỳc ph 1H-NMR ca artemisinin Proton 3H14 (ppm) d: 1,15 J (H2) . " ;Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của một số thực vật Việt Nam" của Viện hoá học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam NguyÔn Thanh HuyÒn. đành chờ chết. Để thực hiện chính sách y dược học cổ truyền đến năm 2010 của Chính phủ, các nhà khoa học và ngành y tế đang quan tâm đến việc nghiên cứu, sử dụng artemisinin và các dẫn xuất của. trúc và nghiên cứu hoạt tính chống sốt rét và chống ung thư của hợp chất này góp phần làm sáng tỏ phần động của hoá học các hợp chất thiên nhiên đó là môi tương quan giữa hoạt tính sinh học và