HÓA hợp CHẤT THIÊN NHIÊN SAPONIN

Cũng như một số lớn các hợp chất khác có trong thực vật, muốnchiết xuất saponin thực sự có trong tự nhiên thì nguyên liệu phải được làm khônhanh, bảo quản cẩn thận.. Chiết xuất Thông th

CÁC HỢP CHẤT SAPONIN

Saponin là một nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong thực vật

Chữ “sapo” có nghĩa là xà phòng Người ta biết khoảng 500 loài thuộc 80 họ

thực vật có saponin Một loài động vật cũng có saponin như : hải sâm, cá sao.Saponin có những tính chất đặc trưng sau:

- Tạo bọt nhiều và bền khi lắc với nước vì có hoạt tính bề mặt cao, dophân tử saponin có một đầu ưa nước, một đầu kị nước Tính chất nàylàm cho saponin có tính chất giống xà phòng: tính nhũ hóa và tẩy sạch

- Làm vỡ hồng cầu ngay trong nồng độ rất loãng, tính chất này người tagọi là tính phá huyết Người ta cho rằng tính phá huyết có liên quan đến

sự tạo phức giữa saponin và cholesterol và các ether của cholesteroltrong màng hồng cầu Nhưng có một số trường hợp chỉ số phá huyết vàkhả năng tạo phức với cholesterol không tỉ lệ thuận với nhau nên phảixét đến ảnh hưởng của saponin trên các thành phần khác của mànghồng cầu Qua việc theo dõi tính phá huyết, người ta thấy rằng cấu trúccủa phần aglycol có tác dụng trực tiếp đến tính phá huyết còn phầnđường có ảnh huởng đến mức độ phá huyết Hồng cầu của các động vậtkhác nhau cũng bị ảnh hưởng khác nhau đối với một loại saponin.Hồng cầu của cừu dễ bị phá nhất nên được dùng tốt để tính chỉ số pháhuyết

- Saponin có thể làm chết cá (hoặc một số động vật máu lạnh khác) ởnồng độ rất thấp Tính chất này được giải thích do saponin làm tănghoạt tính thấm của biểu mô đường hô hấp làm mất chất điện giải cầnthiết

- Saponin còn có tính đặc biệt nữa là tính tạo phức với cholesterol hoặcmột số chất 3-β-hydroxy steroid khác Đôi khi nguời ta dùng tính chấtnày để tách Saponin, hoặc ngược lại dùng saponin để tách các chất 3-β-hydroxy steroid khác

Saponin có vị đắng, khó chịu, thường ở dạng vô định hình, rất khótinh chế Do đó trước đây, các saponin trong cây thường được mô tả ở dạngsapogenin Người ta phân lập được các saponin có trên 10 đơn vị đường trongphân tử, có điểm chảy và toàn bộ cấu trúc xác định (kể cả dây nối giữa cácđơn vị đường)

Saponin tan trong nước, cồn loãng, khó tan trong cồn cao độ, rất íttan trong aceton, không tan trong ether và hexan Do đó có thể dùng 3 dungmôi này để tủa saponin trong quá trình chiết xuất

Các saponin đều là chất quang hoạt, phần lớn các sapogenin steroid

là tả truyền, saponin trierpenoid là hữu truyền

Điểm chảy của các saponin thường cao hơn 200oC Các saponinthường hay được chuyển thành các dẫn chất acetyl dễ kết tinh hơn, có điểmchảy và năng suất quay cực cố định hơn Trong một số trường hợp, khi muốntinh chế saponin hoặc sapogenin, người ta chuyển hóa chúng thành các acetylsau đó desacetyl hóa

Saponin có thể được tủa bởi chì actat, barium hydroxyd, amoniumsulfat Có thể dùng tính tạo tủa này để phân lập saponin Saponin có loại acid,trung tính và kiềm

PHÂN LOẠI

Trước đây, KOBERT chia saponin làm 2 loại: trung tính và acid căn

cứ vào tính tạo tủa Saponin trung tính thì tủa bởi Barium hydroxid và chìacetat, Còn saponin acid thì tan được trong kiềm, bị tủa bởi chì acetat trungtính và amonium sulfat

Xu hướng hiện nay, người ta chia làm 2 loại dựa theo cấu trúc hóahọc: saponin steroid và saponin triterpenoid

II.1 Saponin triterpenoid

Phần genin loại này có 30 carbon, gồm saponin triterpenoidpentacyclic và saponin triterpenoid tetracyclic

- Saponin triterpenoid pentacyclic : loại này được chia làm các nhóm

olean, ursan, lupan, hopan

• Nhóm olean: Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên

đều thuộc nhóm này Phần aglycon thường có 5 vòng và thường

là dẫn xuất của 3-β-hydroxy olean 12-ene, tức là β-amyrin

3

4 5

6 7 8

9 10

11

12 13

14 15 16

17 18

• Nhóm ursan

Cấu trúc nhóm ursan tương tự như nhóm olean Chỉ khác là nhómmethyl ở vị trí C-30 không gắn vào vị trí C-20 mà vào vị trí C-19 Cácsapogenin của nhóm ursan thường là những dẫn chất của 3-β-hydroxy ursan-12-ene tức α-amyrin Những saponin của nhóm này thường ít gặp hơn nhómolean

• Nhóm hopan:

Cấu trúc nhóm hopan có các vòng A, B, C, D giống như các nhóm

trên, chỉ khác vòng E có 5 cạnh, C-22 ngoài vòng và nhóm methyl gắn ở C-18

thay vì C-17

1 2

3

6 7

8

9 10

11

12 13

14 15 16

17 18

3

6 7

8

9 10

11

12 13

14 15 16

17 18

19

21 22

27

20 28

29 30

• Nhóm dammaran: Đại diện là các saponin của nhân sâm Phần

aglycon gồm 4 vòng và một mạch nhánh Phần đường nối vào –

OH ở C-3 hoặc nối vào nhóm –OH ở mạch nhánh

• Nhóm lanostan: Đại diện cho nhóm này là các saponin của loài

hải sâm Các saponin của động vật này có tác dụng phá huyết rấtmạnh, mạnh hơn các saponin có nguồn gốc thực vật, người tacho rằng chúng tiết ra các saponin ít tan trong nước để làm vũkhí tự vệ, cũng tạo bọt như các saponin trong thực vật, khi thủyphân thu được các sapoenin và đường

1 2

3

6 7 8 9 10

11

12 13 14 15

16 17 18 19

3

6 7

8 9 10

11 12 13 14 15

16 17 18

Phần lớn các saponin nhóm cucurbitan gặp trong họ Cucurbitaceae

(họ Bầu bí) Ở đây nhóm CH3 ở vị trí C-10 sẽ gắn vào vị trí C-9

1 2

3

6 7

8

9 10

11 12

13 14

15

16 17 18

II.2 Saponin steroid

Phần genin của saponin steroid có 27C, là dẫn chất của khungcholestan Gồm có 3 nhóm: spirostan, furostan và nhóm saponin steroidalcaloid

• Nhóm spirostan:

1 2

3

6 7

8

9 10

11 12 13 14

15 16 17 18

19

20 21

Diosgenin Hecogenin

• Nhóm furostan:

Nhóm này có cấu trúc tương tự nhóm spirostan, chỉ khác là vòng F

bị biến đổi, thường là sự mở vòng

• Nhóm saponin steroid alcaloid: là những hợp chất vừa có tính

alcaloid vừa có tính saponin gồm có nhóm spirosolan và nhóm solanidan

- Nhóm spirosolan:

Chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy ở vòng F được thay bằng

NH Một điểm cần chú ý nữa là ở đây có isomer ở C-22, thí dụ như salasodin

có trong cây cà Úc (Solanum laciniatum) có cấu trúc 22α còn tomatodin là các

saponin có trong cây cà chua thì có cấu trúc (25 S) 22β

HO

Solanidin

II PHƯƠNG PHÁP CHIẾT SAPONIN

Do đặc điểm cấu trúc saponin trong phân tử thường có chuỗi đườngdài nên chúng có tính phân cực mạnh, dễ hút ẩm, thường tồn tại ở dạng dẻo,sệt, khó kết tinh Do đó, việc chiết xuất hợp chất saponin ra khỏi cây cỏ là vấn

đề tương đối phức tạp so với một số hợp chất tự nhiên khác

Tùy thuộc vào tính chát hóa học của hợp chất saponin và các chất đikèm có trong cây để chọn phương pháp thích hợp

Cũng như một số lớn các hợp chất khác có trong thực vật, muốnchiết xuất saponin thực sự có trong tự nhiên thì nguyên liệu phải được làm khônhanh, bảo quản cẩn thận Tuy nhiên một số trường hợp trong sản xuất, người

ta lại ủ nguyên liệu để enzym có sẵn trong cây hoạt động để tăng hoạt chấtmong nuốn Ví dụ để chiết xuất diosgenin, 2 tác giả Blunden và Hardman

dùng phương pháp ủ để tăng saponin steroid có trong củ tươi Dioscorea belizensis lên từ 5-10% Hardman và Brain cũng đã dùng phương pháp ủ củ Dioscorea deltoidea và hạt của Trigonella foenunggraecum để làm tăng hiệu

suất của saponin lên

Trong một loài thực vật, saponin thường tồn tại một hỗn hợp gồmnhiều chất khác nhau Rất nhiều trường hợp các saponin này chỉ khác nhau docấu trúc mạch đường, do đó việc tách chiết các saponin riêng biệt rất khó.Phương pháp chủ yếu để tách riêng các saponin là sắc ký cột với pha tĩnh làsilicagel, celluloze, polyamid Người ta cũng thường dùng phương pháp sắc kýgel (gel chromatography)

III.1 Chiết xuất saponin triterpen

III.1.1 Loại mỡ

Nguyên liệu trước khi chiết cần được loại mỡ bằng một số dung môihữu cơ: ether dầu hỏa, benzen, ether etylic…

Quá trình loại mỡ có thể được tiến hành theo phương pháp sau đây:

Loại mỡ trước khi chiết:

Bột nguyên liệu được loại mỡ bằng cách đun hoàn lưu hay chiếtsoxhlet với dung môi loại mỡ Dung môi hòa tan mỡ được tách riêng ra, bãnguyên liệu được làm khô dung môi trước khi cho vào dụng cụ chiết kế tiếp.

Loại mỡ sau khi chiết:

Để tránh sử dụng một lượng lớn dung môi hữu cơ, người ta có thểloại mỡ sau khi chiết bằng cách lắc với dung môi loại mỡ Bằng cách nàylượng dung môi loại mỡ sẽ ít hơn nhiều so với cách loại mỡ trực tiếp trênnguyên liệu

Lọai mỡ bằng phương pháp đông lạnh:

Trong một số trường hợp chiết xuất lớn và dịch chiết nhiều mỡ, cóthể dùng phương pháp đông lạnh rồi hớt lớp mỡ đóng váng trên bề mặt Sau

đó, thu hồi dung môi chiết Để đảm bảo sạch mỡ, có thể lắc với dung môi loại

mỡ nếu thấy cần thiết

III.1.2 Chiết xuất

Thông thường, hợp chất saponin có tính phân cực mạnh nên dungmôi dùng để chiết saponin là các dung môi phân cực như: nước, cồn, methanol(thường dùng trong phòng thí nghiệm)

Nước là dung môi hòa tan saponin rất tốt, nhưng có nhược điểm là:ngoài saponin, nước còn hòa tan nhiều tạp chất trong cây như chất màu, nhựa,tinh bột, tanin, đường, muối vô cơ… Do đó sẽ gây khó khăn trong quá trìnhtinh chế Ngoài ra trong môi trường nước sẽ có một số saponin phân hủy do

men (ví dụ như saponin của Hedera helix, Gypsophyla paniculata)

Dung môi thường dùng để chiết saponin là cồn 40-90% Hầu hết cácsaponin đều tan tốt trong cồn và trong môi trường này khống chế được sự hoạtđộng của các men Tuy nhiên, khi dùng cồn làm dung môi chiết cần lưu ý một

số trường hợp của các saponin acid trong phân tử có chứa nhóm carboxyl,dưới tác dụng của cồn sẽ chuyển thành dẫn xuất alkyl ester

III.1.3 Loại các tạp chất

Trong dịch chiết thu được, ngoài saponin còn lẫn nhiều tạp chất đi kèm,

do đó phải từng bước loại dần các tạp chất để thu được một hỗn hợp thành

phần saponin tương dối cao gọi là “hỗn hợp saponin thô”.

Loại các hợp chất ít phân cực:

Để loại các tạp chất kém phân cực như các chất màu, các hợp chấtphenolic ta lắc dịch chiết với dung môi hữu cơ sau: choroform, ether, ethylacetat

Loại các chất phân cực mạnh:

Dịch chiết sau khi loại tạp ít phân cực sẽ được thu hồi dung môi, sau

đó lắc với n-buthanol Lớp n-buthanol sẽ chứa một lượng lớn saponin, còn lớpnước chủ yếu chứa các tạp chất phân cực mạnh như đường tự do, muối vôcơ…

III.1.3 Tủa hợp chất saponin thô

Tùy theo dung môi chiết và tùy thuộc vào bản chất của saponin đểchọn chất kết tủa thích hợp:

Bảng 27: Một số chất dùng để chiết saponin

EtOH 50-90% Metyletyl ceton

Sơ đồ tổng quát chiết xuất saponin triterpen

NGUYÊN LIỆU

Dịch MeOH

Hỗn hợp saponin thô

Chiết bằng dung môi (nước, cồn, MeOH)

Thu hồi còn 1/3 thể tích (lắc với cyclohexan)

Lắc với CHCl3

Thu hồi đến cắn +H2O, lắc với n-buthanol

Thu hồi chân không

Hòa tan cắn với MeOH

Tủa bằng ester

Sơ đồ chiết xuất saponin triterpen từ cây Ngũ gai bì chân chim

n-Cắn

Dịch MeOH

Hỗn hợp saponin thô

Sơ đồ chiết saponin triterpen từ Ngưu tất (Achyranthes

Hòa với MeOHTủa Ether

CôMeOH

Đường và các hợp chất tự do khácCắn

Bã

III.2 Chiết xuất saponin steroid

Quá trình chiết các saponin steroid cũng tương tự như các saponintriterpen gồm có các bước cơ bản: loại chất béo, chiết bằng dung môi phâncực, loại tạp…

Tuy nhiên, các hợp chất saponin steroid thường được ứng dụngnhiều trong công nghiệp bán tổng hợp chất corticoid dưới dạng sapogenin (Ví

dụ như: diosgenin, hecogenin, tigogenin ) vì thế trong quá trình chiết xuấtngười ta kết hợp thêm giai đoạn thủy phân để thu nhận các sapogenin cầnthiết

III.2.1 Chiết dưới dạng sapogenin

Bột nguyên liệu sau khi loại mỡ được chiết bằng dung môi phân cực(EtOH, MeOH) Cắn thu được sau khi thu hồi dịch chiết được tinh chế tiếp đểthu nhận saponin tinh khiết hoặc thủy phân bằng acid để thu nhận sapogenin

Thu hồi dung môi

Thủy phân acidTinh chế

Lọc

III.2.2 Chiết dưới dạng sapogenin

Sơ đồ chiết dưới dạng sapogenin

Trong thực tế, saponin có khả năng tự thủy phân do men có sẵntrong nguyên liệu Do đó, trong nguyên liệu ngoài dạng saponosid còn có một

số tồn tại ở dạng sapogenin Khi dùng dung môi phân cực để chiết saponin thìphần genin không tan sẽ nằm lại trong nguyên liệu, do đó hiệu suất chiết sẽgiảm Để khắc phục tình trạng trên, trước tiên, người ta thủy phân trực tiếpsaponin trong nguyên liệu, sau đó dùng dung môi kém phân cực (benzen,CHCl3, n-hexan, xylen…) để chiết tách các genin ra khỏi nguyên liệu Vớiphương pháp này, hiệu suất sẽ tăng lên rõ rệt

Bột nguyên liệu

Bã nguyên liệu

Dịch chiết

CắnDịch acid

Sapogenin

Làm khôChiết bằng dung môi hữu cơ

Thu hồi dung môi

Thủy phân bằng acid (HCl, H2SO4)Lọc, ép bã

Tinh chế

III.2.3 Làm giàu saponin trong nguyên liệu thực vật

Nhằm mục đích nâng cao hiệu suất trong việc chiết xuất diosgenin,một số tác giả đã nghiên cứu phương pháp làm giàu diosgenin từ nguyên liệuthực vật trước khi đem chiết xuất

Nhóm nghiên cứu của Harmam đã nhận xét rằng, hàm lượngsaponin tăng lên đáng kể khi cho lên men nguyên liệu trước khi chiết Nhómnày cũng tiến hành những thí nghiệm, nằm nâng cao hiệu suất chiết sapogeninbằng cách cho vào môi trường ủ men những chất kích thích tố thực vật hoặcnhững chất thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp steroid

Sơ đồ chiết diosgenin từ Dioscorea floribunda

Thu hồi dung môi

Ủ với dung dịch (100ml H2O + 1ml squalen)

ở 36oC/24h +HCN 2N (hồi lưu 24h)

Kết tinh bằng n-hexan

A Racennixenco theo dõi quá trình ủ men của D deltoidea nhận

thấy có sự chuyển hóa saponin loại furostan phân cực lớn (tan trong nước)sang loại spirostan phân cực ít (không tan trong nước) do loại bỏ glucose ở vịtrí C-22 và đóng vòng F

Trong nguyên liệu, các saponin có thể tồn tại ở một dạng chủ yếu làfurostan hay spirostan hoặc có thể tồn tại song song hai dạng với hàm lượngbằng nhau Do đó, khi chiết xuất cần phải tiến hành khảo sát xem saponin tồntại trong nguyên liệu ở dạng nào để có phương pháp xử lý và chiết xuất thíchhợp

Sơ đồ chiết Diosgenin từ các nguồn nguyên liệu khác nhau

(Viện nguyên liệu Hà Nội)

Sản phẩm giàu furostan

Bột dược liệu

đã thủy phân

Diosgenin

Chiết bằng nước nóng

Thủy phân acid

Ủ men 38-40o

Ủ men 38-40 o

Nước 6-10 lần

Chiết bằng DMHCSKLM

(TT Ehlich)

III.3 Chiết xuất saponin steroid alcaloid (còn gọi là gluco-alcaloid)

Sơ đồ tổng quát chiết saponin steroid alcaloid

Các hợp chất thuộc nhóm này vừa có tính chất của một glycosid,vừa có tính chất của một alcaloid vì thế trong quá trình chiết có thể lợi dụng 2tính chất này

Chiết bằng cồn, MeOH

Thu hồi dung môi

Hòa tan trong CH3COOH 5%

Kiềm hóa bằng NH4OH (pH=12)Lọc

Dịch chiết

Cắn

Dịch acid

Tủa glucoalcaloid Bột nguyên liệu

Sơ đồ chiết solasodin từ quả S.Xanthocarpum Schard ed Wendl

Cũng tương tự như saponin steroid, các saponin steroid cũng thườngđược xử lý ở dạng genin, do đó quá trình chiết thường có giai đoạn thủy phân

Để đạt hịêu suất cao, người ta thường tiến hành thủy phân trực tiếp nguyênliệu, sau đó chiết bằng dung môi kém phân cực, tinh chế tương tự như tinh chếhợp chất alcaloid

Sơ đồ chiết solasodin từ Solanum lacinatum

Bột nguyên liệu

Dịch acid (đường) Bã (solasodin chlohydrat)

Dịch xylen (solasodin baz)

Dịch xylen tạp Dịch acid (solasodin acetat)

Tủa solasodin kỹ thuật

Solasodin tinh khiết

HCl 5% / isopropanol Hồi lưu 2h

Tinh chế bằng than hoạtLắc với CH3COOH/isopropanol/H2O

Phương pháp tinh chế hợp chất saponin:

Tủa saponin thu được bằng các phương pháp chiết xuất trên, tuy đã qua nhiều giai đoạn loại tạp nhưng vẫn chưa tinh khiết (thường gọi là saponin thô) Muốn có được hỗn hợp saponin tinh khiết cần phải tiếp tục tinh chế Tùy theo tạp chất đi kèm trong các tủa thô để lựa chọn phương pháp tinh chế thích hợp

Sau đây là một số phương pháp dùng để tinh chế saponin:

- Tinh chế bằng than hoạt:

Dung dịch cồn saponin được đun với than hoạt, sau đó lọc lấy dịch lọc Bằng phương pháp này có thể loại được một số chất màu, nhựa,…

- Tinh chế bằng cột trao đổi ion:

Cho hỗn hợp saponin thô qua cột trao đổi ion (Amberlit, Dowex,…) sẽ loại được các tạp chất vô cơ

- Tinh chế bằng phương pháp tạo bọt:

Dựa vào tính chất dễ tạo bọt của saponin trong dung dịch nước, người

ta dùng một luồng khí trơ sục vào dung dịch nước của saponin thô Sau đó tách riêng lớp bọt bền trên bề mặt ra khỏi dung dịch, ở lớp bọt bền sẽ chứa một lượng lớn saponin Bằng phương pháp này, Research đã chiết được 97% saponin từ nguyên liệu

- Phương pháp dựa vào độ hòa tan:

Dựa vào độ hòa tan khác nhau giữa các saponin và tạp chất đi kèm để tách chúng ra khỏi nhau Ví dụ, các tạp chất đường tự do, muối vô cơ tan nhiều trong nước, saponin tan nhiều trong n-buthanol Lớp buthanol sẽ chứa saponin Có thể lặp lại quá trình này vài lần để thu được saponin tinh khiết hơn

- Phương pháp kết tủa:

Để tinh chế hỗn hợp saponin thô, người ta dùng phương pháp hòa tan saponin thô trong methanol, sau đó tủa với ether ethylic khan theo tỷ lệ 1 thể tích methanol và 10 thể tích ether Có thể lặp lại quá trình này vài lần để thu được saponin tinh khiết hơn

- Phương pháp tạo phức với cholesterol:

Lợi dụng khả năng tạo phức với cholesterol của một số saponin để trong ethanol tác dụng với dung dịch cholesterol trong ethanol nóng (50-60oC)

sẽ tạo phức ở dạng tủa Lọc lấy tủa phức, phá phức bằng các hòa tan tủa trong pyridin Thu hồi dịch pyridin đến cắn Hòa cắn trong methanol, sau đó tủa dịch methanol bằng ether ethylic sẽ thu được hỗn hợp saponin tinh khiết