ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TÌM HIỂU VỀ CHITOSAN

Hình 2: Cấu trúc của Chitosan  Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, được tạo thành bằng cách loạicác nhóm acetyl từ phân tử chitin quá trình deacetyl... Trên mỗi mắc xích của phân

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ CHITIN VÀ CHITOSAN

1 Lịch sử phát triển [16]

Danh từ chitin theo tiếng Hi Lạp nghĩa là lớp áo vỏ ngoài hay sự bao bọc,được đề nghị bởi Odier vào năm 1832 khi tác giả tách được một polysaccharide từcánh cứng của bọ da Tuy nhiên, polysaccharide này được phát hiện bởi Braconnot(một giáo sư về lịch sử tự nhiên, giám đốc vườn Bách thảo và là thành viên củaViện Hàn lâm Khoa học Nancy, Pháp) vào năm 1811 với tên gọi là “Fungi”.Chitin rất phổ biến trong tự nhiên, nó được phát hiện ở trong động vật lẫn thực vật,tham gia vào thành phần cấu tạo thành tế bào nấm (chiếm 3 - 5% trọng lượngtươi), cấu tạo bộ khung xương của vỏ tôm, sam, cua, côn trùng, … Chitosan đượctổng hợp ngoài nguồn nguyên liệu chính từ chitin trong tự nhiên còn được tổnghợp bằng cách nuôi cấy vi sinh vật

Tới năm 1859, Rouget lần đầu tiên phát hiện ra chitosan (dẫn xuất củachitin) khi ông đun sôi chitin trong KOH đậm đặc

Năm 1878, Ledderhose đã viết nên phương trình phản ứng thuỷ phân giữaglucosamine với acetic acid hình thành chitin

Năm 1894, Gilson đã xác định sự hiện diện của glusosamine

Năm 1989, Van Wisseling lần đầu tiên viết một cách tổng quan về chitin.Năm 1906, Von Furth và Russo đã chỉ ra rằng chitosan hình thành muốitinh thể với acid và bị kết tủa từ dung dịch acid bởi những tác nhân kết tủa làkiềm

Quá trình nghiên cứu về chitin, chitosan thực sự bắt đầu có hệ thống vàonăm đầu của thế kỉ XX Vào năm 1950, chitosan được mô tả một cách rõ ràng nhưmột polymer của glucosamine và cấu trúc của chitin cũng được nghiên cứu, nhữngcuốn sách đầu tiên về chitin được xuất bản trong thập kỉ 50 Và cho đến nay,chitin, chitosan là tên gọi quen thuộc với hầu hết các nhà hoá, sinh, … Hội nghịkhoa học đầu tiên ở vùng Châu Á Thái Bình Dương đã được tổ chức tại trườngĐại học Kebangsaan vào năm 1994 rất quan tâm đến tiềm năng sản xuất và ứngdụng của chitin và chitosan của các nước Đông Nam Á

Động lực chính cho sự phát triển và ứng dụng chitosan là nó được điều chế

dễ dàng từ nguồn nguyên liệu loại bỏ, phong phú trong tự nhiên, hạn chế được ônhiễm môi trường, không độc đối với con người và có khả năng tự phân huỷ sinhhọc Đặc tính quan trọng nhất của chitosan là khả năng tạo màng tốt, có độ mỏngcao có thể lên đến 25m mà vẫn có khả năng lấy ra được nên nó được ứng dụngkhá tốt trong màng bao thực phẩm

2 Chitin [2, 21, 22, 23, 27]

Chitin là một polysaccharide xuất hiện nhiều thứ hai trong thiên nhiên chỉsau cellulose, sản phẩm thương mại thường ở dạng rắn Chitin có mặt trong vỏ cácloại giáp xác (tôm, cua…), nhuyễn thể (sò, ốc…), bộ cánh cứng của côn trùng,

màng tế bào nấm thuộc họ Zygemycetes, có trong sinh khối nấm mốc và một vài

loại tảo

Hàm lượng chitin có trong một số loài thuỷ sản được xác định bởi Đỗ ĐìnhRăng và Phạm Đình Cường (2000) Hàm lượng đó được trình bày ở bảng sau:

Bảng 1: Hàm lượng chitin của một số loài thuỷ sản

Nguyên liệu Hàm lượng chitin (%)

[-(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-D-Công thức cấu tạo của chitin:

Chitin có cấu trúc tương tự cellulose, khi thay C(2) – nhóm hydroxyl của cellulose bằng C(2)–acetamido ta sẽ chitin

Hình 1: Cấu trúc của chitin

 Cấu trúc mạng tinh thể của chitin:

Chitin tồn tại ở 3 dạng polymorphic Hướng sắp xếp của các mạch thay đổi hình thành 3 dạng cấu trúc , , 

, - chitin có nhiều ở vùng mềm và dai của động vật

Trong tự nhiên, dạng liên kết của chitin thường là phức với protein và

polysaccharide Liên kết protein- chitin được gọi là “Coralent”

Chitin thường không tồn tại trong thiên nhiên như một chất riêng biệt màxuất hiện dưới dạng phức chất với nhiều chất khác như protein, polysaccharide (kể

cả cellulose) Chitin tinh khiết chỉ có trong vỏ gai (extracellular spine) của nhữngloài khúc tảo và trong phòng thí nghiệm sau quá trình xử lý để lọai các thành phầnkhác Thực tế ta chỉ khảo sát được chitin dưới dạng hợp chất có chứa chitin Ngay

cả khi dùng chitin đã được làm sạch người ta vẫn không xem nó là một đơn chất vìcác mạch polime sẽ chứa một phần 2-amino-2-deoxy-D-glycopyranose và mộtlượng đáng kể 2-acetamido-2-deoxy-D-glycopyranose

Việc nghiên cứu thành phần của chitin được tiến hành dựa trên sự thuỷphân bằng chlohydric

Chitin không tan trong nước, acid loãng hoặc base loãng nhưng tan trongacid vô cơ đậm đặc như HCl, H2SO4, H3PO4 (78-79%) Trong HCl đậm đặc, quátrình thuỷ phân chitin xảy ra bắt đầu từ nối glucose và tiếp đó là sự loại bỏ cácnhóm acetyl.

Chitin không hòa tan trong hầu hết các dung môi thông thường nên khả năngứng dụng bị hạn chế Do đó người ta thực hiện quá trình deacetyl hóa chitin để tạo

ra sản phẩm chitosan nhằm cải thiện độ hòa tan, tăng khả năng ứng dụng trongnhiều lĩnh vực

3 Chitosan [6, 8, 10, 16, 22, 23, 27]

Chitosan có tên khoa học: glycopyranose]

poly[-(1-4)-2-amido-2-deoxy-D- Công thức phân tử: (C6H11NO4)n với n nằm trong khoảng 700  4500

 Trọng lượng phân tử trung bình: 10000 – 50000 dalton

Hình 2: Cấu trúc của Chitosan

 Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, được tạo thành bằng cách loạicác nhóm acetyl từ phân tử chitin (quá trình deacetyl)

Trên mỗi mắc xích của phân tử chitosan có 3 loại nhóm chức, các nhómchức này có khả năng kết hợp với chất khác để tạo ra các dẫn xuất có lợi khácnhau của chitosan Bản chất điện ly được thể hiện khi các nhóm amin của chitosan

bị proton hoá trong dung dịch acid Trong dung dịch acid loãng không có chất điện

ly, độ nhớt cũng tăng theo nồng độ của chitosan và kích thước của mạch phụ thuộcvào sức căng ionic của chất trung gian và mức độ ion hoá Tính mềm dẻo củamạch tăng theo mức độ deacetyl hoá vì khi đó giảm liên kết hydrogen trong phân

tử chitosan

Chitosan có tác dụng kháng vi khuẩn khá tốt, nhất là trên các vi khuẩn gây

bệnh như E coli, Staphylococus aureus, Pseudomonas aeruginosa và tác dụng diệt nấm nhất là nấm Candida albicans Ngoài các tính năng trên của chitosan, các

dẫn xuất chitosan rất hấp dẫn trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, sinh học

và bảo vệ môi trường

Chitosan có khả năng hấp thu đáng kể một lượng lớn nước Có 2 chỉ sốquan trọng nhất của chitosan là mức độ deacetyl hoá (DD) và trọng lượng phân tửtrung bình Độ deacetyl hoá (DD) là độ chuyển hoá chitin thành chitosan Thôngthường các chitosan có độ deacetyl hoá 85 – 95%, đặc biệt sản phẩm chitosan có

độ deacetyl hoá khoảng 45 - 55% tan tốt trong nước nên được gọi là chitin tan

Tách nhóm acetyl

Trọng lượng phân tử trung bình của chitosan là một đại lượng có ý nghĩa thống kê,

nó được xác định thông qua độ nhớt của dung dịch chitosan, có giá trị biến đổi từ

10000 - 500000 tuỳ theo mỗi loại chitosan khác nhau Hai chỉ số này ảnh hưởngtrực tiếp đến các tính chất hoá lý, hoạt tính sinh học và ứng dụng của chitosan

Chitosan thương phẩm đã khử 80 - 85% nhóm acetyl (DD = 80 - 85%).Bảng 2: Một vài thông số kỹ thuật của chitin và chitosan thương phẩm(được sản xuất tại công ty Kate International, 14/1909, Kaf villa, Chullickal,Kochi- 682005, Kerala, India)

Thông số kỹ thuật Chitin Chitosan

4 Mức độ khác nhau của chitin và chitosan [16]

Trong thực tế, không có sản phẩm nào chiếm 100% chitin hoặc chứa 100%chitosan, do đó để đánh giá mức độ khác biệt của chitin và chitosan người ta dùngkhái niệm độ acetyl hoá (DA) hoặc độ deacetyl hoá (DD) Thực chất đây là sựkhác nhau do hàm lượng nhóm –NHCOCH3 và nhóm NH2 trong chitin vàchitosan Nếu sản phẩm có độ DA lớn hơn 50% (DD nhỏ hơn 50%) là sản phẩmchitin còn nếu ngược lại là chitosan

Hình 3: Chitosan thương phẩm

Chương 2 TÍNH CHẤT CỦA CHITOSAN [6, 11, 22, 23, 27]

Những tính chất chung của chitosan thương phẩm:

+ Kích thước hạt: 1 - 3 mm

+ Trọng lượng riêng biểu kiến: 0,15 – 0,05

+ Độ ẩm: 10%

+ Phần hòa tan trong kiềm và tro: 5%

+ Màu dung dịch: trắng hơi

 Tính tan:

Chitosan là một base tạo được các muối với acid do đó hình thành cácpolyelectrolyte mà tính tan phụ thuộc vào bản chất của những amino liên quan.Thường thì acid được cho vào chitosan đang ngâm nước để tạo thành muối và sựhòa tan tự xảy ra đồng thời Ví dụ để có dung dịch 1% thì dùng 1,0g chitosan trong50ml nước và cho tiếp thêm 50ml dd acid 2%

Tính tan của chitosan trong các dung môi khác nhau như sau:

+ Trong acid vô cơ:

Chitosan tan được trong HCl, HBr, HI, HNO3 và HClO4 lõang nhưng cũng

có thể tạo tủa tách riêng được trong dung dịch HCl hoặc HBr khi tăng nồng độ

acid Chitosan cũng hòa tan được trong H2SO4 ở nhiệt độ phòng Trong acidH2SO4 đậm đặc, sự hòa tan xảy ra song song với sự sulphat hóa và thủy phânchitin.

+ Trong các acid hữu cơ:

Chitosan hình thành muối tan được trong nước với một nhóm acid hữu cơ.Những muối monocarboxylic acid lên đến hecxanoic dễ dàng hòa tan trong nướckhi hình thành với maloic acid đến nonane dioic acid đều hòa tan được trong nước.Những nghiên cứu về muối của chitosan và các acid aromatic carboxylic cũng chothấy khả năng tan được trong nước như chitosan benzoate, chitosan o- aminobenzoate (chitosan anthranilate), chitosan p- amino benzoate và cũng có một sốmuối không tan hoặc ít tan trong nước như chitosan phenylacetate … Còn muốicủa chitosan và acid formic, acid acetic tan rất tốt trong nước

+ Trong những dung môi hữu cơ:

Chitosan hòa tan một cách dễ dàng trong hỗn hợp DMF - N2O4 với tỷ lệN2O4 : chitosan = 3 : 1 cho những dung dịch có độ nhớt thấp và không xảy ra mộtbiến đổi hóa học nào của chitosan Đây là dung môi hữu cơ được nghiên cứu đến

 Tính tương hợp với các dung môi:

Dung dịch chitosan trong dung dịch acid acetic có thể tạo một thể thốngnhất với các dung môi phân cực mà không gây ra sự tạo tủa chitosan Dung dịchacid acetic- chitosan có tính tương hợp tốt với rượu như metanol, propanol,butanol, ethylen glycol, diethylene glycol, aceton, glycol formamide Những dungdịch acid của chitosan đều hòa lẫn được với các lọai nhựa tan trong nước khôngion, hồ, dextrin, glucose, saccharose, các glycol, sorbitol và các lọai dầu mỡ, cácparafin, hydrocloric, nitric, formic, citric, và acid lactic nhưng không hòa tan trongacid sulfuric và các sulphate

 Bản chất điện ly cao phân tử của chitosan trong dung dịch acid:

Trong dung dịch acid, những nhóm amin của chitosan bị proton hóa và thểhiện bản chất của chất điện ly cao phân tử Trong dung dịch lõang không có mặtchất điện ly, chỉ số độ nhớt tăng theo sự tăng nồng độ dung dịch chitosan Đây làđặc trưng của những dung dịch chất điện ly cao phân tử và là kết quả của sự tăngkích thước sợi khi pha lõang dung dịch do lực đẩy tĩnh điện giữa các đọan mạch.Lực đẩy này có thể bị khử mất bằng cách thêm một chất điện ly trọng lượng phân

tử thấp có tác dụng che những phần mang điện trên mặt polymer Và đồng thời,chỉ số độ nhớt cũng giảm theo nồng độ chitosan cho trước

 Cấu tạo và kích thước phân tử của những mạch chitosan trong dung dịch acid:

Mạch sẽ mềm dẻo khi tăng sức căng ionic của dung dịch vì lực đẩy tĩnhđiện giữa các mạch giảm Độ dài bền vững phụ thuộc vào sức căng ionic của chấttrung gian và mức độ ion hóa

Tính mềm dẻo của mạch tăng theo mức độ deacetyl hóa vì khi đó giảm sựtạo liên kết hydrogen trong phân tử giữa nhóm C(6)-OH và C(2)-NHCOCH3 Tính

ổn định của mạch sẽ giảm khi tăng sự deacetyl hóa và tăng theo sự tăng nhiệt độ.Trong dung dịch chitosan tồn tại những glycan -(1- 4) và có cấu tạo xoắn ngẫunhiên

Bảng 3: Kích thước phân tử chitosan trong dung dịch acid

CH3COOH 0,33M – NaCl 0,3M 30 - 230CH3COOH 0,167M – NaCl 0,46M 73CH3COOH 0,2M – NaCl 0,1M – Ure 4M 122

2 Tính chất hóa học

Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức -OH, nhóm -NH2 trong cácmắt xích D- glucozamin, do đó nó có thể tham gia các phản ứng hóa học đặc trưngcho từng nhóm chức, tạo ra các dẫn xuất thế

Mặt khác chitosan là một polime mà các monome được nối với nhau bởicác liên kết -(1-4)-glucoside; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hoáhọc như: axit, bazơ, tác nhân oxy - hóa và các enzim thuỷ phân

Hình 4: Cấu trúc của Chitosan

 Tính acid bazơ:

Chitosan là một bazơ

Hằng số Kb của nhóm amin thu được từ phương trình:

-NH2 + H2O  -NH3 + OH

Và pKa = -logKa

pKa của chitosan phụ thuộc vào mật độ điện tích của polime và mức độdeacetyl hóa Giá trị pKa có thể thay đổi từ 6,0 đến 6,8

 Khả năng hấp phụ tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp:

Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên tửoxi và nitơ của nhóm chức còn cặp electron chưa sử dụng, do đó chúng có khảnăng tạo phức, phối trí với hầu hết các kim loại nặng và các kim loại chuyển tiếpnhư: Hg2+, Cd2+, Zn2+, Cu2+,Ni2+,Co2+, Tuỳ nhóm chức trên mạch polime màthành phần và cấu trúc của phức khác nhau

Hình 5: Phức Ni(II) chitosan

Sự tạo phức giữa chitosan và ion kim loại xảy ra chủ yếu nhờ những nhómamin đóng vai trò ligant Do đó mức độ deacetyl hóa chitosan và nồng độ củanhững nhóm amin linh động có ảnh hưởng lớn đến mức độ tạo phức Kết quả thựcnghiệm cho thấy mức độ hấp phụ những ion chuyển tiếp ở pH7 bởi các dung dịchchitosan có mức độ deacetyl hóa khác nhau sẽ khác nhau như sau:

Bảng 4: Mức độ hấp thu kim loại của chitosan

 Phản ứng thủy phân trong môi trường acid:

Trong môi trường acid chitosan bị thủy phân nhưng mức độ thủy phân phụthuộc vào loại acid, nồng độ acid và một số các yếu tố khác như nhiệt độ, thời gianphản ứng Những kết quả cho thấy :

 Trong môi trường H2SO4, sự thủy phân chitosan kèm theo quá trình Sulphate hóa, cho sự phân hóa ngẫu nhiên các mạch phân tử

N- Trong môi trường HF, chitosan cũng bị thủy phân nhưng kém hơn chitin,tạo thành hỗn hợp các oligome sau 19h ở 20oC

 Trong các môi trường acid khác như HCl, H3PO4,… sự thủy phân cũng xảy

O O

O2NO

CH2ONO2

CH2ONO2 OO

O2NO

OH

- Phản ứng sulphate hóa:

Cho chitosan tác dụng với hỗn hợp H2SO4 95% và ClSO3H 98% ở nhiệt độ

từ 0 - 4oC, tỉ lệ 1 : 2 trong 1h, cho sản phẩm ở dạng Zwitter ionic (là liên kết tĩnhđiện giữa C(6)OSO3- và NH3 C(2) trong phân tử) làm tăng tính cứng của chuỗi.Sản phẩm có dạng:

O HO

O

O3SOCH2O

Chitosan phản ứng với RCOOH tạo:

Ngoài ra chitosan còn có thể tạo các bazo shiff, do tác dụng với cácandehyde mạch thẳng hay vòng tạo các dẫn xuất N-alkylidene chitosan và N-arylidene chitosan gel.

3 Phương pháp khảo sát phản ứng định tính chitosan

Để kiểm tra một chất có phải là chitosan hay không, người ta có thể sửdụng phản ứng với kali bicromat như sau:

+ Cho 1ml dung dịch kali bicromat 5% vào 10ml dung dịch chitosan 0,5%trong dung dịch acid acetic 1%

+ Nếu có xuất hiện kết tủa màu vàng là có chitosan

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT CHITOSAN

I Phương pháp sản xuất [16, 26]

Chitosan là sản phẩm deacetyl hóa của chitin Chitin có thể được sản xuất

từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như từ tôm, cua, côn trùng có bộ cánhcứng, các loài giáp xác, nhuyễn thể (sò, ốc…), từ nấm… Đặc biệt trong vỏ tômcua, hàm lượng chitin cao, từ 10 - 15% nguyên liệu khô Trong đó chitin liên kếtvới protein, các chất vô cơ mà chủ yếu là CaCO3 và các chất béo Do đó cần phảiloại các hợp chất này ra khỏi chitin

Có 2 phương pháp để sản xuất chitosan là sử dụng hóa chất và enzym.Phương pháp dùng hóa chất rất đơn giản, ít chi phí đầu tư nhưng ảnh hưởng khôngtốt đến môi trường xung quanh Ngược lại, phương pháp sử dụng enzym khônglàm ô nhiễm môi trường, song phức tạp và đòi hỏi chi phí đầu tư cao Hiện naytrên thế giới, chitosan phần lớn được sản xuất bằng hóa chất, phương pháp dùngenzym mới bước đầu đi vào ứng dụng ở một số nước Theo thực tế nghiên cứuđiều chế cho thấy ở nước ta chưa thể điều chế chitin- chitosan theo phương phápsinh học, do các lý do sau:

+ Hiệu suất thu sản phẩm chitosan rất thấp, mặc dù hoạt tính enzym caonhưng chỉ có một phần nhỏ chitin tham gia phản ứng do độ tinh thể của vỏ cao, chỉ

có những nhóm acetyl của chitin nằm bên ngoài mới tiếp xúc được với enzym

+ Việc sản xuất chitosan bằng enzym sẽ thành công khi và chỉ khi enzymđược phá tinh thể trước khi cho phản ứng deacetyl hóa Mà thực tế, vấn đề cácphòng thí nghiệm trong nước chưa thực hiện được điều này do thiếu thiết bị máymóc

+ Điều chế chitosan theo phương pháp sinh học bằng cách sử dụng enzymđòi hỏi phải có một nguồn cung cấp enzym thường xuyên và ổn định hay một môitrường nuôi cấy enzym thích hợp Điều này trong nước vẫn chưa thực hiện được

Bên cạnh những bất lợi của phương pháp sinh học thì phương pháp hóa họclại tỏ ra có nhiều lợi điểm hơn:

+ Quy trình sản xuất đơn giản, thiết bị rẻ tiền

+ Hoá chất sử dụng rẻ tiền

+ Chất lượng sản phẩm cao hơn do có thể thực hiện phản ứng ở nhiệt độcao hơn

+ Hiệu suất thu hồi sản phẩm khá cao

Tuy nhiên phương pháp hoá học cũng có những bất lợi cần quan tâm:

+ Vấn đề xử lý nước thải: phải xử lý nước thải trước khi thải ra môi trường

+ Vấn đề thu hồi hoá chất.

+ Điều kiện làm việc với hóa chất (NaOH 50%) ở nhiệt độ cao dễ gây ănmòn thiết bị, làm giảm chất lượng chitosan do làm giảm hoạt tính của nhóm chức–NH2

+ Chưa có biện pháp tận thu protein sau khi loại ra khỏi vỏ giáp xác

Bảng 5: Thành phần hóa học của vỏ các loại giáp xác

Hình 6: Hiệu suất thu hồi chitosan từ các nguồn nguyên liệu khác nhau

Hình 7: Hàm lượng chitin trong 7 loài giáp xác

Hình 8: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất Chitosan

Làm nguội Rửa

Nghiề n

Bột Chitosa n

Hòa tan trong HCl

Kết tủa chậm Kết tủa nhanh

Vẩy Chitosan 50-60%

Chitosan kết tủa mịn

Hình 9: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chitosan

 Cụ thể người ta tiến hành lần lượt các công đoạn sau:

1 Chuẩn bị:

Làm sạch vỏ giáp xác: Phế liệu vỏ giáp xác được thu thập và đun sôi trong

1h để loại hết các mô Vỏ tiếp tục được cho vào lò ở 163OC trong 1h, sau đó lấy ra,tách phần mô đã sấy khô còn sót lại trên vỏ, cọ rứa sạch lớp vỏ

Khử màu: Lớp vỏ cứng bên ngoài của loài giáp xác có chứa chất màu chủ

yếu là cardenoid Thành phần chính là astarene, astaxanthin, canthaxanthin, lutin

và  - carotene Chúng không xuất hiện dưới dạng phức chất với các chất vô cơcũng như protein, vì vậy khử protein và khử khoáng cũng không loại đượccardenoid Tuy vậy có thể khử màu bằng chất trích màu như KMnO4, NaOCl, SO2,NaHSO3… Có thể bổ sung công đoạn ngâm vỏ trong dung dịch chất tẩy trắngloãng trước khi thực hiện quá trình đun sôi

Làm nguội vỏ giáp xác: Vỏ sau khi đã làm

sạch được đặt trong lò ở 80oC trong 48h để phá vỡ cấu

trúc tinh thể của chitin, nhằm chuyển hầu hết chitin

trong vỏ thành dạng vô định hình Sau 48h, vỏ được

lấy ra khỏi lò và đổ nhanh vào bể chứa nitơ lỏng

(-196oC) để làm nguội Việc làm nguội nhanh sẽ hạn

chế được sự tái hình thành tinh thể chitin, làm chúng

trở nên vô định hình hơn Ngoài ra trong quá trình làm

nguội, nhiệt độ của nitơ lỏng còn làm cho vỏ trở nên

rất giòn, dễ vỡ, giúp quá trình nghiền sau đó sẻ dễ

dàng hơn Sau khoảng thời gian nhất định, lấy vỏ ra

khỏi dung dịch nitơ lỏng, nghiền bằng cối và chày Có

thể thay dung dịch nitơ lỏng bằng hỗn hợp

methanol- nước đá khô

2 Loại Protein:

Protein được loại bằng cách nấu với NaOH, nhiệt độ 60-100oC Gần đâycác nghiên cứu mới được thực hiện với một khoảng rộng với các tác nhân nhưNaOH, NaHCO3, KOH, K2CO3, Ca(OH)2, Na2SO4, NaHSO3, Ca(SO4)2, NaPO4,Na2S Song NaOH vẫn được dùng thông dụng hơn

Tùy từng loại vỏ mà điều kiện xử lý có thể thay đổi về nồng độ NaOH,nhiệt độ hoặc thời gian Với những loại vật liệu dễ khử protein, có thể dùngNa2CO3 0.1M ở khoảng 100oC trong 4h Đối với vật liệu khó xử lý, có thể dùngNaOH 5M ở khoảng 100oC trong 4h Tuy nhiên, hầu hết các quá trình khử thườngdùng NaOH 1N với một khoảng nhiệt độ và thời gian xử lý (từ 65-100oC) trongvòng 0.5-7h

Hình 10: Nghiền vỏ bằng cối và

chày

Tiến hành: Cho hỗn hợp vỏ đã làm nguội vào dd NaOH 3,5% (tỉ lệ 1:10

w/v) ở 65oC Sau 2h lấy phần nổi lên trên, rửa bằng nước cất và sấy khô ở 90oC.Người ta có thể định lượng xác định lượng protein tách ra từ vỏ tôm

Hình 11: Loại protein bằng cách đun với dung dịch NaOH

3 Loại muối khoáng:

Để khử khoáng có thể dùng các tác nhân acid như HCl, HNO3, H2SO4,CH3COOH, HCOOH,… song người ta thường dùng HCl ở nhiệt độ phòng Tùytính chất nguyên liệu mà thay đổi nồng độ acid và thời gian xử lý cần thiết Ngoài

ra người ta cũng nghiên cứu quá trình khử EDTA ở pH kiềm Nguyên liệu được

xử lý bằng EDTA ở pH9 hoặc pH10, sau đó xử lý ở pH3 sẽ cho sản phẩm cókhoảng 15% chất vô cơ chủ yếu là silicat

Tiến hành: Vỏ tôm đã loại protein được cho vào dd HCl 1N (tỉ lệ 1:15

w/v) ở 25oC trong 2h ở nhiệt độ phòng Sau 2h lấy phần vỏ nổi lên trên, rửa bằngnước cất, sấy ở 90oC Vỏ tôm sau khi đã sấy khô chứa chủ yếu là chitin

Hình 12: Loại muối khoáng bằng

dung dịch HCl

4 Phản ứng deacetyl hóa:

Phản ứng chính trong điều chế chitosan là deacetyl hóa bằng dung dịchkiềm Dung dịch phản ứng cần được gia nhiệt và khuấy trộn đều trong suốt thờigian phản ứng

Tiến hành: Chitin thu được đem phản ứng với dung dịch NaOH 40% (tỉ lệ

1:25 w/v) để trong lò ở 80oC trong 96h Chuẩn độ đến pH 7.0 với dung dịch HCl1N Chitosan sẽ kết tủa, ta tiến hành lọc hoặc ly tâm, sau đó sấy thu được chitosan

5 Tinh sạch chitosan:

Kết tủa sau khi đã sấy khô được nghiền thành bột và hòa tan trong dd acidacetic 2% với tỉ lệ 1:100 (w/v) Cho dung dịch vào các ống thẩm tích, đặt các ốngvào dung dịch acid acetic có nồng độ tương đương trong 24h Mục đích của quátrình nhằm loại bỏ các hợp chất có phân tử lượng nhỏ ( muối CH3COONa, muốicalci, các protein có phân tử lượng thấp…) Sau đó lấy dung dịch trong ống ra vàsấy chân không, ta thu được chitosan gần như tinh khiết (Được kiểm nghiệm bằngphương pháp phân tích HPLC)

Tiến hành thí nghiệm lần lượt với 1g và 10g vỏ tôm ban đầu, sự giảm khốilượng vỏ tôm khi qua từng công đoạn được thể hiện trong bảng sau:

Hình 13: Thực hiện phản ứng deacetyl hóa chitin

Bảng 6: Sự giảm khối lượng vỏ tôm qua từng công đoạn

Hình 14: Chitosan thu được từ một số loại vỏ giáp xác

Các yếu tố ảnh hưởng đến mức độ deacetyl hóa:

 Nhiệt độ

 Nồng độ dd NaOH

 Thời gian phản ứngTiến hành thí nghiệm khảo sát mức độ deacetyl hóa dung dịch chitosan ởhai chế độ nhiệt độ 1000C và 1200C, hai nồng độ dung dịch NaOH 40% và 50%.Kết quả thu được biểu diễn bằng đồ thị như sau:

Hình 15: Ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ NaOH đến

mức độ deacetyl hoá dd Chitin

Hình 16: Ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ NaOH đến khối

lượng phân tử trung bình của dd Chitosan