BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG - o0o - HOÀNG THỊ BẢO YẾN NGHIÊN CỨU CHỌN LOẠI VI KHUẨN LACTIC THÍCH HỢP CHO MỤC ĐÍCH KHỬ PROTEIN VÀ KHỐNG TRÊN ĐẦU VÀ VỎ TƠM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: ThS LÊ PHƢƠNG CHUNG NHA TRANG, 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án này, em nhận đƣợc nhiều bảo, giúp đỡ, động viên khích lệ nhiều thầy cô, anh chị bạn bè Trƣớc hết em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Nha Trang, nh đạo Viện C ng nghệ sinh học m i trƣờng, c c thầy c gi o Bộ môn Công nghệ sinh học đ giảng dạy truyền đạt kiến thức quý b u nhƣ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian học tập trƣờng Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến Th.S ê Phƣơng Chung đ tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho em suốt thời gian thực đề tài Qua em xin chân thành cảm ơn đến tồn thể thầy quản lý phịng thí nghiệm Hóa vi sinh thực phẩm, Cơng nghệ sinh học, Cơng nghệ chế biến đ tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đồ án Cảm ơn tất ngƣời bạn đ lu n quan tâm, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Cuối xin bày tỏ lòng biết ơn c ng ơn sinh thành nu i dƣỡng cha mẹ, giúp đỡ tận tình anh chị em thân yêu Những ngƣời đ lu n theo dõi ủng hộ vật chất lẫn tinh thần để em hoàn thành đề tài Nha Trang, ngày 10 tháng năm 2014 Sinh viên thực Hoàng Thị Bảo Yến i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN M ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nguồn phế liệu tôm 1.1.1 Nguồn phế liệu tôm 1.1.2 Cấu tạo thành phần hóa học phế liệu tơm 1.2 Tổng quan chitin chitosan 1.2.1 Sự tồn chitin chitosan tự nhiên 1.2.2 Cấu trúc tính chất chitin 1.3 Ứng dụng chitin chitosan chitosan 1.4 Công nghệ sản xuất chitin chitosan 1.4.1 Công nghệ sản xuất chitin chitosan phƣơng ph p hóa học 11 1.4.2 Công nghệ sản xuất chitin chitosan phƣơng ph p sinh học 12 1.4.3 Cải thiện quy trình sản xuất chitin chitosan phƣơng ph p sinh học kết hợp với phƣơng ph p hóa học 15 1.5 Tổng quan lên men lactic 18 Chƣơng II 20 Đ I TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 20 2.1.1 Vi khuẩn giống 20 2.1.2 Nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng 20 2.2 Phƣơng ph p nghiên cứu 21 2.2.1 Phƣơng ph p thu nhận mẫu 21 2.2.2 C c phƣơng ph p phân tích hóa học 21 2.2.3 Phƣơng pháp thu sinh khối vi khuẩn lactic 32 2.2.4 Phƣơng ph p xử lý số liệu: 22 ii 2.3 Hóa chất thiết bị 32 2.3.1 Hóa chất 32 2.3.2 Thiết bị 32 Chƣơng 33 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO U N 33 3.1 Thành phần hóa học đầu t m thẻ chân trắng 33 3.2 Tăng sinh kết thúc thời gian nhân giống 33 3.3 Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431, Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 xử lý đầu tôm 36 3.3.1 X c định tỉ lệ vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431, Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 nhân giống m i trƣờng MRS bổ sung vào nguyên liệu 36 3.3.2 X c định thời gian lên men khử protein khử khoáng 39 3.3.3 X c định chế độ khử khoáng HCl 42 3.3.4 X c định chế độ khử protein NaOH 47 3.3.5 Đề xuất quy trình sản xuất chitin theo phƣơng ph p xử lý sinh học 52 Chƣơng KẾT U N VÀ Đ UẤT KIẾN 56 4.1 Kết luận: 56 4.2 Đề xuất ý kiến 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo chitin Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo chitosan Hình 1.3 Quy trình sản xuất chitin chitosan, Trƣờng Đại học Nha Trang [10] 11 Hình 1.4 Quy trình sản xuất chitin Holanda Netto (2006) 14 Hình 1.5 Quy trình sản xuất chitin từ phế liệu tơm có kết hợp xử lý enzyme protease thu hồi protein astaxanthin 16 Hình 2.1 Sơ đồ hoạt hóa hai chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarumVTCC 431 Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 22 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng qu t 23 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm x c định tỷ lệ vi khuẩn 25 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm x c định thời gian xử lý vỏ đầu tôm vi khuẩn lactic 26 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm x c định nồng độ axit HCl khử khoáng 28 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm x c định thời gian xử lý axit HCl khử khoáng 29 Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm x c định nồng độ NaOH khử protein sau lên men 30 Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm x c định thời gian xử lý NaOH khử protein sau lên men 31 Hình 3.1 Sự thay đổi độ đục m i trƣờng nuôi cấy theo thời gian chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 34 Hình 3.2 Sự thay đổi độ đục m i trƣờng nuôi cấy theo thời gian chủng vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 35 Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn hiệu khử khoáng chủng Lactobacillus plantarumVTCC 431 sau thay đổi nồng độ dịch vi khuẩn % ( v/w) 36 iv Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn hiệu khử protein chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 sau thay đổi nồng độ dịch vi khuẩn % ( v/w) 37 Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn hiệu khử protein chủng vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 sau thay đổi nồng độ dịch vi khuẩn % ( v/w) 37 Hình 3.6 Biểu đồ biểu diễn hiệu khử khoáng chủng vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 sau thay đổi nồng độ dịch vi khuẩn v w 38 Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn hiệu khử protein dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 sau thay đổi thời gian lên men (h) 40 Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn hiệu khử khống dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 sau thay đổi thời gian lên men (h) 40 Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn hiệu khử protein dịch vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 sau thay đổi thời gian lên men (h) 41 Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn hiệu khử khoáng dịch vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 sau thay đổi thời gian lên men (h) 41 Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn hiệu khử khống cịn lại HCl thay đổi nồng độ (%) sau khử khoáng dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 43 Hình 3.12 Biểu đồ biểu diễn hiệu khử khống cịn lại HCl thay đổi nồng độ (%) sau khử khoáng dịch vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 44 Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn hiệu khử khống cịn lại HCl thay đổi thời gian (h) sau lên men với dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 45 Hình 3.14 Biểu đồ biểu diễn hiệu khử khống cịn lại HCl thay đổi thời gian (h) sau lên men với dịch vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 46 Hình 3.15 Biểu đồ biểu diễn hiệu khử protein lại NaOH thay đổi nồng độ (%) sau lên men với dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 48 v Hình 3.16 Biểu đồ biểu diễn hiệu khử protein lại NaOH thay đổi nồng độ (%) sau lên men với dịch vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 48 Hình 3.17 Biểu đồ biểu diễn hiệu khử protein lại NaOH thay đổi thời gian (h) sau lên men với dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 50 Hình 3.18 Biểu đồ biểu diễn hiệu khử protein lại NaOH thay đổi thời gian (h) sau lên men với dịch vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 50 Hình 3.19 Đề xuất quy trình 53 vi N MỤ ẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học phế liệu tôm Penaaus vannamei Trang Sĩ Trung cộng sự, 2007) ảng 1.2 Ứng dụng chitin chitosan Bảng 1.3 Chỉ tiêu chất lƣợng chitin thu đƣợc theo quy trình cải tiến quy trình hóa học truyền thống 17 Bảng 1.4 Chỉ tiêu chất lƣợng chitosan sản xuất từ chitin quy trình cải tiến 17 ảng 3.1 Thành phần hóa học đầu t m thẻ chân trắng 33 ảng 3.2 Th ng số tối ƣu cho qu trình khử kho ng protein dịch vi khuẩn 42 Bảng 3.3Thông số tối ƣu cho c ng đoạn khử khống cịn lại 47 Bảng 3.4Thông số tối ƣu cho c ng đoạn khử protein lại 52 Bảng 3.5 Đ nh gi sản phẩm chitin từ quy trình đ đề xuất với sản phẩm chitin từ phƣơng ph p hóa học truyền thống 55 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BSA ovine serum albumin huyết bò DA Độ acetyl DD Độ deacetyl E/S Tỷ lệ enzyme chất FAO Food and Agriculture Organization (tổ chức Nông Lƣơng giới) GVC Giảng viên h Hour (giờ) MRS De Man, Rogosa, Sharpe NXB Nhà xuất SD Standard deviation độ lệch chuẩn) STT Số thứ tự TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam V/W Tỷ lệ thể tích khối lƣợng VTCC Vietnam Type Culture Collection (bảo tàng giống chuẩn Việt Nam) W/V Tỷ lệ khối lƣợng thể tích MỞ ẦU T nh ấ hi i Là ngành trọng tâm kinh tế quốc dân, ngành thủy sản nƣớc ta năm gần đ đạt đƣợc thành tựu đ ng kể nuôi trồng, chế biến nhƣ xuất thực đ đóng góp phần khơng nhỏ vào phát triển chung kinh tế Nhƣng với phát triển mạnh m ngành nu i trồng chế biến thủy sản, vấn đề đƣợc quan tâm lớn phế liệu từ c ng nghiệp chế biến, có phế liệu từ chế biến t m xuất Nếu kh ng đƣợc xử lý hay tận dụng cho mục đích kh c s nguồn phế thải t c động lớn đến m i trƣờng c dù vậy, phế liệu tôm lại nguồn cung cấp chitin chitosan phong phú Vì ngồi việc dùng phế liệu t m để chế biến thức ăn chăn nu i cịn sử dụng chúng để sản xuất chitin chitosan mang lại giá trị kinh tế cao Ở Việt Nam nay, công nghệ sản xuất chitin chitosan chủ yếu theo phƣơng ph p hóa học dùng HCl NaOH để khử tạp chất gồm protein kho ng chất khỏi đầu vỏ tôm deacetyl Nhƣợc điểm c ng nghệ gây nhiễm m i trƣờng, ăn mịn thiết bị, chi phí sản xuất cao, chƣa tận thu đƣợc thành phần có giá trị nhƣ protein, chất màu từ phế liệu thủy sản Đ có nhiều nghiên cứu nhằm cải thiện quy trình, hạn chế nhƣợc điểm, tăng hiệu suất thu hồi c c thành phần có ích, sử dụng vi sinh vật h trợ giải ph p đƣợc nhiều nghiên cứu đề cập tiến hành Xuất phát từ thực tế trên, đƣợc đồng ý Gi m đốc Viện công nghệ sinh học m i trƣờng, Trƣờng Đại học Nha Trang, đề tài “Nghiên cứu chọn loại vi khuẩn lactic thích hợp cho mục đích khử protein khống đầu vỏ tơm” đƣợc thực Đề tài nhằm cải tiến quy trình sản xuất chitin chitosan bằngcách sử dụng phƣơng ph p sinh học bổ sung vi khuẩn lactic để khử protein khống chất khỏi đầu vỏ tơm với mong muốncó thể giảm lƣợng hóa chất sử dụng HCl NaOH gây ô nhiễm m i trƣờng ... nhiều nghiên cứu đề cập tiến hành Xuất phát từ thực tế trên, đƣợc đồng ý Gi m đốc Vi? ??n công nghệ sinh học m i trƣờng, Trƣờng Đại học Nha Trang, đề tài ? ?Nghiên cứu chọn loại vi khuẩn lactic thích hợp. .. thích hợp cho mục đích khử protein khống đầu vỏ tơm” đƣợc thực Đề tài nhằm cải tiến quy trình sản xuất chitin chitosan bằngcách sử dụng phƣơng ph p sinh học bổ sung vi khuẩn lactic để khử protein. .. biểu diễn hiệu khử protein chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC 431 sau thay đổi nồng độ dịch vi khuẩn % ( v/w) 37 Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn hiệu khử protein chủng vi khuẩn Lactobacillus