Nghiên cứu tạo và ứng dụng kháng thể đơn dòng nhằm phát hiện sớm ung thư cổ tử cung

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang	157
Dung lượng	5,42 MB

Nội dung

Đề tài nghiên cứu các nội dung sau: Tạo protein tái tổ hợp và xây dựng quy trình tạo protein tái tổ hợp. Tạo KTĐD và xây dựng quy trình tạo KTĐD. Quy trình và kit immunoPCR. Quy trình và kit hóa tế bào miễn dịch. Quy trình và kit ELISA.

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM CÔNG TY TNHH CNSH KHOA THƯƠNG SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU TẠO VÀ ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG NHẰM PHÁT HIỆN SỚM UNG THƯ CỔ TỬ CUNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI PGS.TS. HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/ 2013 MỤC LỤC CÁC THÔNG TIN LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI i TÓM TẮT TIẾNG VIỆT iv ABSTRACT v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ xii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PHẦN 1. TỔNG QUAN 2 1.1 Các protein virus HPV và protein tế bào liên quan đến ung thư cổ tử cung (UTCTC) 2 1.1.1 Các protein virus, oncoprotein E7 và protein cấu trúc L1 2 1.1.2 Các protein tế bào 3 1.2. Tổng quan về kháng thể đơn dòng 3 1.2.1 Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng kỹ thuật tạo tế bào lai (hybridoma) 3 1.2.2. Kỹ thuật sản xuất KTĐD từ người bằng cách bất tử hóa lympho bào 4 1.2.3. Dung hợp tế bào lympho người với tế bào u tủy chuột 4 1.2.4. Tạo kháng thể khảm và kháng thể “người hóa” 4 1.2.5. Phương pháp trình diện phage 5 1.2.6. Phương pháp tạo chuột chuyển gene biểu hiện Ig người 5 1.2.7. Sản xuất kháng thể đơn dòng 5 1.3 Các phương pháp phát hiện E7 và p16 INK4A 9 PHẦN 2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 9 PHẦN 3. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 10 3.1 VẬT LIỆU 10 3.1.1. Tế bào 10 3.1.2. Chủng vi sinh vật 10 3.1.3. Vector 10 3.1.4. Chuột thí nghiệm 11 3.1.5. Bệnh phẩm 11 3.1.6. Hóa chất-Môi trường 11 3.1.6.1 Hóa chất 11 3.1.6.2 Môi trường 15 3.2. PHƯƠNG PHÁP 15 3.2.1. Phương pháp thiết kế mồi 15 3.2.2. Phương pháp tách chiết DNA, RNA 16 3.2.2.1. Tách chiết DNA bộ gene 16 3.2.2.2. Tách chiết DNA plasmid 16 3.2.2.3. Tách chiết RNA 17 3.2.3. Phương pháp PCR và RT-PCR 17 3.2.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 17 3.2.5. Phương pháp giải trình tự 17 3.2.6. Phương pháp tạo dòng biểu hiện 18 3.2.6.1. Tạo vector tái tổ hợp mang gene mong muốn 18 3.2.6.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli DH5α và BL21 (DE3) 19 3.2.6.3. Chọn lọc dòng vi khuẩn tái tổ hợp có mang gene mong muốn 19 3.2.7. Phương pháp thu nhận – tinh sạch protein tái tổ hợp 20 3.2.8. Phương pháp điện di SDS-PAGE 20 3.2.9. Phương pháp Western blot 21 3.2.10. Phương pháp Bradford 21 3.2.11. Phương pháp tạo KTĐD 21 3.2.11.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột 18 3.2.11.2. Dung hợp tạo tế bào lai (hybridoma) 22 3.2.11.3. Sản xuất và tinh sạch KTĐD 23 3.2.12. Phương pháp ELISA 24 3.2.12.1. ELISA trực tiếp 24 3.2.12.2. ELISA “sandwich” 25 3.2.12.3. Phương pháp checkerboard 25 3.2.13. Phương pháp chuyển gene vào tế bào động vật 25 3.2.14. Phương pháp hóa tế bào miễn dịch (immunocytochemistry) 26 3.2.14.1.Phương pháp lai hóa miễn dịch tế bào trên lamelle 26 3.2.14.2. Phương pháp lai hóa tế bào miễn dịch trên lame kính 27 3.2.15. Phương pháp immunoPCR 27 3.2.15.1. Biotin hóa kháng thể 27 3.2.15.2. Tạo đoạn DNA chỉ thị đánh dấu biotin (DNA-biotin) 28 3.2.15.3. ImmunoPCR 28 PHẦN 4. KẾT QUẢ 30 4.1. TẠO PROTEIN TÁI TỔ HỢP E7 HPV 6/11/16, L1 HPV 16/18 VÀ p16 INK4A 30 4.1.1. CHUẨN BỊ NGUYÊN LIỆU CHO TẠO DÒNG 30 4.1.1.1 Thiết kế mồi cho phản ứng PCR nhân bản các gene E7 HPV 6/11/16, L1 HPV 16/18 và p16 INK4A 30 4.1.1.2. Thu nhận các gene cần tạo dòng 31 4.1.2. DÒNG HÓA CÁC GENE TƯƠNG ỨNG VÀO VECTOR pET28a(+), pE-SUMO3, pETM-44, pGATVÀ KIỂM TRA VECTOR TÁI TỔ HỢP BẰNG PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ 33 4.1.3. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP VÀ KIỂM TRA CHÚNG BẰNG SDS -PAGE VÀ WESTERN BLOT 36 4.1.3.1 Kết quả biểu hiện protein E7 HPV 16 38 4.1.3.2. Kết quả biểu hiện protein p16 INK4A 38 4.1.3.3. Kết quả biểu hiện protein E7 HPV 6 và E7 HPV 11 39 4.1.3.4. Kết quả biểu hiện protein L1 HPV 16 và L1 HPV 18 40 4.1.4. THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP 40 4.2. KHẢO SÁT MỘT SỐ THÔNG SỐ CHO QUY TRÌNH THU NHẬN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TINH SẠCH 41 4.2.1. BIỂU HIỆN VÀ THU NHẬN PROTEIN TÁI TỔ HỢP 41 4.2.1.1. Hệ vector biểu hiện 41 4.2.1.2. Nhiệt độ cảm ứng 42 4.2.1.3. Nồng độ IPTG cảm ứng 43 4.2.1.4. Thời gian cảm ứng 44 4.2.2. TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP 46 4.2.2.1. Nồng độ imidazole dùng trong dung dịch rửa cột 47 4.2.2.2. Dung dịch đệm của phản ứng cắt loại bỏ đuôi SUMO 48 4.2.2.3. Ảnh hưởng của một số chất biến tính lên phản ứng cắt 50 4.2.2.4. Kết quả tinh sạch protein p16 INK4A từ vector pE-SUMO3 tái tổ hợp 51 4.3. TẠO KTĐD KHÁNG PROTEIN E7 HPV 16 VÀ p16 INK4A 52 4.3.1. GÂY ĐÁP ỨNG MIỂN DỊCH CHUỘT VỚI KHÁNG NGUYÊN MỤC TIÊU 52 4.3.1.1. Gây đáp ứng miễn dịch chuột với kháng nguyên E7 HPV 16 tái tổ hợp 52 4.3.1.2. Gây đáp ứng miễn dịch chuột với kháng nguyên p16 INK4A tái tổ hợp 53 4.3.2. CHỌN LỌC DÒNG HYBRIDOMA SẢN XUẤT KTĐD KHÁNG PROTEIN E7 HPV 16 VÀ p16 INK4A 54 4.3.2.1. KTĐD kháng protein E7 HPV16 54 4.3.2.2 KTĐD kháng protein p16 INK4A 55 4.3.3. THU NHẬN VÀ TINH SẠCH KTĐD KHÁNG E7 HPV 16 VÀ p16 INK4A 55 4.3.3.1. Kết quả xác định isotype KTĐD kháng E7 HPV 16 và p16 INK4A 55 4.3.3.2. Kết quả tinh sạch KTĐD kháng protein E7 HPV 16 và p16 INK4A 57 4.3.4. KIỂM TRA VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA KTĐD 58 4.3.4.1. Kết quả xác định ái lực của KTĐD với kháng nguyên tái tổ hợp 58 4.3.4.2. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD 59 4.4. KHẢO SÁT MỘT SỐ THÔNG SỐ CHO QUY TRÌNH TẠO KTĐD 62 4.4.1. SẢN XUÂT KTĐD QUA NUÔI CẤY TĨNH 62 4.4.1.1. Thu nhận tối đa sinh khối tế bào 4H5 dùng để cấy (seeding) 62 4.4.1.2. Xác định một số điều kiện nuôi tế bào 4H5 để sản xuất KTĐD 63 4.4.2. QUY TRÌNH SẢN XUÂT KTĐD QUA NUÔI CẤY BIOREACTOR 66 4.4.2.1. Mật độ tế bào cấy 66 4.4.2.2. Nồng độ FBS trong môi trường nuôi tế bào 67 4.5. XÂY DỰNG QUY TRÌNH IMMUNOPCR 68 4.5.1. TẠO KTĐD 4H5 ĐÁNH DẤU BIOTIN 69 4.5.2. TẠO ĐOẠN DNA ĐÁNH DẤU BIOTIN 71 4.5.3. KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ 1D5 PHỦ GIẾNG 71 4.5.4. KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ 4H5-BIOTIN VÀ STREPTAVIDIN- ALKALINE PHOSPHATASE (STV-AP) 71 4.5.5. KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ DNA ĐÁNH DẤU BIOTIN 73 4.5.6. KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ STREPTAVIDIN (STV) 73 4.5.7. TÁC NHÂN “KHÓA” GIẾNG VÀ SỐ CHU KÌ PCR 74 4.6. XÂY DỰNG QUY TRÌNH HÓA TẾ BÀO MIỄN DỊCH 75 4.6.1. NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ TỐI ƯU CHO QUY TRÌNH LAI TRÊN LAMELLE 75 4.6.2. TÁC NHÂN CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRONG QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH 79 4.6.3. NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ TRONG QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH 80 4.6.4. CÁC ĐIỀU KIỆN BỘC LỘ KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH 81 4.6.5. KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH 83 4.6.6. KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN ỔN ĐỊNH KTĐD 1C10 85 4.7. QUY TRÌNH ELISA 87 4.7.1. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ “BẮT GIỮ” (PHỦ GIẾNG) TỐT NHẤT 89 4.7.2. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ “PHÁT HIỆN” TỐT NHẤT 90 4.7.3. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ “CỘNG HỢP HRP” TỐT NHẤT 90 4.7.4. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ TÁC NHÂN KHÓA GIẾNG TỐT NHẤT 91 4.8. KIT IMMUNOPCR - XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG 95 4.8.1. ĐỘ ĐÚNG 95 4.8.2. ĐỘ CHÍNH XÁC 96 4.8.3. ĐỘ ĐẶC HIỆU PHÂN TÍCH 98 4.8.4. ĐỘ NHẠY PHÂN TÍCH 99 4.8.5. KHẢ NĂNG TRIỂN KHAI ĐẠI TRÀ KIT TẠI CÁC CƠ SỞ Y TẾ 99 4.9. KIT HÓA TẾ BÀO MIỄN DỊCH (HTBMD) - XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG 101 4.9.1. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CỦA KIT KTE7-16ICC 101 4.9.1.1. Độ đúng 101 4.9.1.2. Độ chính xác 103 4.9.1.3. Độ đặc hiệu phân tích 104 4.9.1.4. Khả năng triển khai đại trà kit tại cơ sở y tế 108 4.9.2. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CỦA KIT KTE7-18ICC 108 4.9.2.1. Độ đúng 108 4.9.2.2. Độ chính xác 110 4.9.2.3. Độ đặc hiệu phân tích 111 4.9.2.4. Khả năng triển khai đại trà kit tại cơ sở y tế 113 4.9.3. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CỦA KIT KTp16ICC 113 4.9.3.1. Độ đúng 113 4.9.3.2. Độ chính xác 115 4.9.3.3. Độ đặc hiệu phân tích 118 4.9.3.4. Độ ổn định 119 4.9.3.5. Khả năng triển khai đại trà kit tại cơ sở y tế 121 4.10. KIT ELISA – XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG 121 4.10.1. XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ “NGƯỠNG” (CUT-OFF) CỦA KIT 121 4.10.2. ĐỘ ĐÚNG 123 4.10.3. ĐỘ CHÍNH XÁC 124 4.10.4. ĐỘ ĐẶC HIỆU PHÂN TÍCH 126 4.10.5. ĐỘ NHẠY PHÂN TÍCH 126 4.10.6. KHẢ NĂNG TRIỂN KHAI ĐẠI TRÀ KIT TẠI CƠ SỞ Y TẾ 127 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 128 TÀI LIỆU THAM KHẢO 130 i CÁC THÔNG TIN LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 1. Tên đề tài : NGHIÊN CỨU TẠO VÀ ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG NHẰM PHÁT HIỆN SỚM UNG THƯ CỔ TỬ CUNG Chủ nhiệm : PGS TS Hồ Huỳnh Thùy Dương Cơ quan chủ trì : Công ty TNHH CNSH Khoa Thương Thời gian thực hiện : 36 tháng, Báo cáo tiến độ : 6/2011 Thời gian được gia hạn : 6 tháng Kinh phí được duyệt : 3.050.000.000 đồng Kinh phí đã cấp : 2. Mục tiêu : Mục tiêu dài hạn của đề tài là phát triển một công nghệ mới ở Việt Nam, công nghệ kháng thể đơn dòng (KTĐD) phục vụ cho chẩn đoán và điều trị. Đối tượng nghiên cứu của đề tài là HPV (Human Papillomavirus), một loại virus có liên quan chặt chẽ với ung thư cổ tử cung. Mục tiêu cụ thể bao gồm : (1) Hoàn chỉnh quy trình tạo KTĐD ở quy mô nhỏ và vừa, áp dụng để tạo KTĐD kháng một số protein liên quan đến ung thư cổ tử cung như E7 HPV16/18, p16 INK4A ; (2) Ứng dụng các KTĐD đã tạo được để phát triển các phương pháp chẩn đoán dựa trên kỹ thuật immuno PCR và miễn dịch mô/ tế bào ; (3) Xây dựng một số kit nhằm phát hiện sớm ung thư cổ tử cung dựa trên kỹ thuật immuno-PCR và hóa miễn dịch mô, tế bào. 3. Nội dung STT Nội dung đăng ký Nội dung thực hiện 1 Báo cáo tổng kết với đầy đủ nội dung và đúng quy định của Sở Khoa học và công nghệ 1 báo cáo tổng kết trình bày đầy đủ nội dung nghiên cứu của đề tài. 2 Protein tái tổ hợp E7 HPV 6/11/16, L1 HPV 16/18 và p16 INK4A – trình tự chính xác, độ tinh sạch 95 %, 10 mg cho mỗi loại protein Protein tái tổ hợp E7 HPV 6 /11/16, và p16 INK4A – trình tự chính xác, độ tinh sạch lần lượt là 95,4 %, 93 %, 95,4 % và 92,3 %, 10 mg cho mỗi loại protein Gene L1 HPV 16 và L1 HPV 18 tạo dòng biểu hiện không thành công. 3 Quy trình tạo protein tái tổ hợp. Quy trình tạo protein tái tổ hợp vời các vector ii Bộ vector cùng với quy trình tạo dòng tương ứng có thể sử dụng để tạo dòng nhiều loại protein pET28(a+), pETM-44, pGAT và pSUMO3 có thể dùng để tạo dòng các protein có tính tan khác nhau 4 Quy trình tạo KTĐD – thực hiện được tại Việt Nam, xác định được các thông số về loại môi trường, tốc độ lắc, thời gian nuôi cấy trước khi thu kháng thể Quy trình tạo KTĐD – thực hiện được tại Việt Nam. Quy trình thu nhận KTĐD 4H5 gồm các thông số cụ thể : (1) thu sinh khối làm nguyên liệu cấy : môi trường RPMI 1640 chứa FBS 10 %, mật độ 2.10 6 tế bào/ml môi trường, nuôi 48 giờ ; (2) thu nhận KTĐD bằng nuôi cấy bình Roux: môi trường RPMI 1640 chứa FBS 5 %, mật độ 2.10 6 tế bào/ml môi trường, thu mẫu sau 96 giờ ; thu nhận KTĐD với bioreactor : môi trường RPMI 1640 chứa FBS 10 %, mật độ 5.10 5 tế bào/ml môi trường, thu mẫu sau 168 giờ 5 Kháng thể đơn dòng – 2 loại KTĐD kháng E7 HPV 16 và p16 INK4A , độ tinh sạch  90 %, hàm lượng 10 mg/l môi trường nuôi cấy hybridoma 2 loại KTĐD : 2C1 kháng E7 HPV 16, hàm lượng 7,6 mg/ml. độ tinh sạch 95 %, và 1C10 kháng p16 INK4A , hàm lượng 7,3 mg/ml, độ tinh sạch 92 %. 2 KTĐD 4H5 và 1D5 kháng E7 HPV 18 tạo từ đề tài trước được sản xuất với hàm lượng lần lượt là 8,8 mg/ml và 6,7 mg/ml và độ tinh sạch lần lượt là 90 % và 98 %. 6 Quy trình immunoPCR – 3 quy trình phát hiện protein E7 HPV 16/18 và p16 INK4A 1 quy trình immunoPCR phát hiện protein E7 HPV 18 7 Kit immunoPCR phát hiện protein E7 HPV 16/18 và p16 INK4A – 3 kit phát hiện các protein E7 HPV 16, E7 HPV 189 và p16 INK4A trong mẫu bệnh với độ đặc hiệu là 95 % so với kit OncoTect (Invirion 01 kit immunoPCR phát hiện protein E7 HPV 18 trong mẫu bệnh, độ nhạy phân tích 1 ng/ml, không có so sánh với kit đối chứng ; 50 phản ứng/kit x 6 kit iii Diagnostics), độ nhạy cao hơn 10- 100 lần ; 50 phản ứng /kit x 3 loại kit x 6 kit/loại 8 Quy trình hóa miễn dịch tế bào/mô – 2 quy trình hóa miễn dịch tế bào hoặc hóa miễn dịch mô để phát hiện p16 INK4A và E7 HPV 16 Quy trình hóa miễn dịch tế bào – 3 quy trình phát hiện p16 INK4A , E7 HPV 16, và E7 HPV 18 được xậy dựng dựa trên các dòng tế bào chứng dương và âm phù hợp 9 Kit hóa miễn dịch tế bào/mô – 02 kit phát hiện p16 INK4A và E7 HPV 16 với độ đặc hiệu và độ nhạy tương đương (90-100%) với các kit thương mại tương ứng ; 50 phản ứng /kit x 2 loại kit x 6 kit/loại Kit hóa miễn dịch tế bào – 03 kit phát hiện p16 INK4A , E7 HPV 16 và E7 HPV 18. Kit E7 HPV 16 phù hợp 80 % với kit chứng ; kit E7 HPV 18 phù hợp 53 % với kit chứng ; kit p16 INK4A phù hợp 85 – 85,7 % với kit chứng ; 50 phản ứng /kit x 2 loại kit x 6 kit/loại 10 Bài báo quốc tế và trong nước – 02 bài đăng tại tạp chí khoa học và công nghệ chuyên ngành 03 bài báo đăng tại tạp chí chuyên ngành trong nước 11 Báo cáo khoa học tại hội thảo quốc tế và trong nước chuyên ngành – 2 bài 01 báo cáo poster tại hội nghị quốc tế 12 Quy trình ELISA phát hiện p16 INK4A được xậy dựng dựa trên các dòng tế bào chứng dương và âm phù hợp 13 Kit ELISA phát hiện được p16 INK4A trong dịch tế bào cổ tử cung, độ nhạy và độ đặc hiệu lâm sàng lần lượt là 91,6 % và 88,89 % tại gía trị “ngưỡng” là 0,250. 14 Luận văn Thạc sĩ 03 luận văn thạc sĩ chuyên ngành Di truyền [...]... Mục tiêu cụ thể bao gồm : 1 Hoàn chỉnh quy trình tạo KTĐD ở quy mô nhỏ và vừa, áp dụng để tạo KTĐD kháng một số protein liên quan đến ung thư cổ tử cung như E7 HPV16/18, p16INK4A 2 Ứng dụng các KTĐD đã tạo được để phát triển các phương pháp chẩn đoán dựa trên kỹ thuật immuno PCR và miễn dịch mô/ tế bào 3 Xây dựng một số kit nhằm phát hiện sớm ung thư cổ tử cung dựa trên kỹ thuật immuno-PCR và hóa miễn... là phát triển công nghệ kháng thể đơn dòng (KTĐD) phục vụ chẩn đoán và điều trị bệnh Mục tiêu cụ thể là hoàn chỉnh quy trình tạo KTĐD kháng một số protein liên quan chặt chẽ đến ung thư cổ tử cung như E7 HPV 16, 18, p16INK4A ; ứng dụng các KTĐD tạo được để phát triển các quy trình immunoPCR và hóa tế bào miễn dịch ; và dựa trên các quy trình này để xây dựng các kit chẩn đoán nhằm phát hiện sớm ung thư. .. đơn dòng (KTĐD) kháng E7 HPV 16 và 18, và p16INK4A và sử dụng các KTĐD này để phát triển các quy trình và kit nhằm phát hiện sớm các trường hợp có khả năng diễn tiến thành UTCTC 1 PHẦN 1 TỔNG QUAN 1.1 Các protein virus HPV và protein tế bào liên quan đến ung thư cổ tử cung (UTCTC) Bình thư ng, khi xâm nhiễm cổ tử cung, HPV sẽ biểu hiện và nhân bản chủ yếu trong các tế bào biểu mô nền và cận nền (basal... Collection), dòng tế bào ung thư cổ tử cung có chứa bộ gene HPV 18, biểu hiện protein p16INK4A  Tế bào CaSki (ATCC), dòng tế bảo ung thư cổ tử cung có chứa bộ gene của HPV 16  Tế bào C-33 A (ATCC), dòng tế bào ung thư cổ tử cung không chứa bộ gene HPV  Tế bào MCF-7 (ATCC), dòng tế bào không biểu hiện protein p16INK4A  Tế bào u tủy P3X63Ag8.653 (ATCC) không sản sinh các chuỗi immunoglobin và mất khả... Ig và được cảm ứng biểu hiện vượt mức Những dòng tế bào sản xuất kháng thể mục tiêu được chọn lọc và phân lập để thu nhận KTĐD Kỹ thuật này có thể ứng dụng tạo kháng thể cho những kháng nguyên có tính sinh miễn dịch thấp (Little & cs, 2009; Wu & cs, 2005) Để làm giảm khả năng gây đáp ứng miễn dịch từ các kháng thể đơn dòng khảm và “người hóa”, các nhà nghiên cứu đã cố gắng xây dựng vài phương pháp tạo. .. Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng kháng thể đơn dòng trong chẩn đoán và điều trị bệnh ở người” (Lê Quang Huấn, 2012) PHẦN 2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Mục tiêu dài hạn của đề tài là phát triển một công nghệ mới ở Việt Nam, công nghệ kháng thể đơn dòng (KTĐD) phục vụ cho chẩn đoán và điều trị Đối tượng nghiên cứu của đề tài là HPV (Human Papillomavirus), một loại virus có liên quan chặt chẽ với ung thư cổ tử cung. .. (humanised antibody) Kháng thể khảm là kháng thể người có vùng biến đổi (Fv) của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ từ KTĐD chuột đặc hiệu với kháng nguyên và có vùng hằng định (Fc) cuả kháng thể người Kháng thể “người hóa” là kháng thể chỉ có 3 trình tự siêu biến đổi (CDR) trên phân tử kháng thể người có nguồn gốc từ chuột DNA tái tổ hợp mã hóa cho các kháng thể khảm và kháng thể “người hóa” được chuyển vào tế bào động... kháng thể lên đến 10 mg/ml, tuy nhiên phương pháp này bị hạn chế bởi những quy định về việc sử dụng động vật cho mục đích thí nghiệm [Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies, 1999] 1.3 Các phương pháp phát hiện E7 và p16INK4A Các công trình nghiên cứu về tạo và ứng dụng KTĐD và đa dòng kháng E6, E7 HPV 16 và 18 còn khá hạn chế Sớm nhất có thể kể đến công trình tạo KTĐD trên chuột kháng. .. biết có thể giảm mức phát hiện tới 30 pg E6/thử nghiệm Nhiều công trình phát triển KTĐD kháng E6 và E7 HPV 16, 18 và sử dụng chúng để phát hiện protein E6, E7 tái tổ hợp và trong dịch tế bào tử cung (Ehehalt & cs, 2011) Trong chẩn đoán HPV, có rất nhiều kit phát hiện các type HPV “nguy cơ cao/thấp”nhưng chỉ kit Hybrid Capture II là đã được FDA (Food and Drug Administration) công nhận cho sử dụng vào chẩn... bào u tủy chuột để tạo tế bào lai người-chuột Tuy nhiên, phương pháp này gặp một số khó khăn về kỹ thuật như: hiệu quả dung hợp rất thấp và một số nhiễm sắc người bị mất ngẫu nhiên sau khi dung hợp (Karpas & cs, 2001) 1.2.4 Tạo kháng thể khảm và kháng thể “người hóa” Bằng kỹ thuật di truyền người ta đã tạo ra DNA tái tổ hợp biểu hiện phân tử kháng thể khảm (chimeric antibody) và kháng thể “người hóa” . CÔNG TY TNHH CNSH KHOA THƯƠNG SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU TẠO VÀ ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG NHẰM PHÁT HIỆN SỚM UNG THƯ CỔ TỬ CUNG CHỦ NHIỆM. LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 128 TÀI LIỆU THAM KHẢO 130 i CÁC THÔNG TIN LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 1. Tên đề tài : NGHIÊN CỨU TẠO VÀ ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG NHẰM PHÁT HIỆN SỚM UNG THƯ CỔ TỬ CUNG Chủ. chẽ với ung thư cổ tử cung. Mục tiêu cụ thể bao gồm : (1) Hoàn chỉnh quy trình tạo KTĐD ở quy mô nhỏ và vừa, áp dụng để tạo KTĐD kháng một số protein liên quan đến ung thư cổ tử cung như E7

Ngày đăng: 07/02/2015, 15:31

Nguồn tham khảo

Tài liệu tham khảo

Loại

Chi tiết

1. Adler M, Wacker R, Niemeyer CM. Sensitivity by combinations: immune-PCR and related technologies. Analyst 2008, 133:702-718

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	Analyst

2. Andersson E, Karrberg C, Radberg T, Blomqvist L, Zetterqvist BM, Ryd W, Lingh M, Horal P. Type-dependent E6/E7 mRNA expression of single and multiple high- risk human papillomavirus infections in cervical neoplasia. J Clin Virol 2012, 54:61-65

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	J Clin Virol

3. Ausubel F. M, Brent R, Kingston R. E, Moore D. D, Seidman J. G, Smith J. A, Struhl K, Current Protocol in Molecular Biology 2001, Wiley & Son

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	Current Protocol in Molecular Biology
Tác giả:	Ausubel F. M, Brent R, Kingston R. E, Moore D. D, Seidman J. G, Smith J. A, Struhl K
Nhà XB:	Wiley & Son
Năm:	2001

4. Balasubramanian A, Hughes J, Mao C, Ridder R, Herkert M, Kiviat NB, Koutsky LA. Evaluation of an ELISA for p16INK4A as a screening test for cervical cancer.Cancer Epidemiol Biomarkers 2009, 18:OF1-10

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	Cancer Epidemiol Biomarkers

5. Beatty JD, Beatty BG, Vlahos WG. Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay. J Immunol Methods 1987, 100:173- 179

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	J Immunol Methods

6. Bergeron C, Ordi J, Schmidt D, Trunk MJ, Keller T, Ridder R. Conjunctive p16 INK4a testing significantly increases accuracy in diagnosing high-grade cervical intraepithelial neoplasia. Am J Clin Pathol 2010, 133:395-406

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	Am J Clin Pathol

7. Carmen S, Jermutus L, Concepts in antibody phage display. Briefings in functional genomics and proteomics 2002, 1(2): 189-203

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	Concepts in antibody phage display
Tác giả:	Carmen S, Jermutus L
Nhà XB:	Briefings in functional genomics and proteomics
Năm:	2002

8. CDRH – Center for Devices and Radiological Health. Food and Drug Administration US Department of Health and Human Services. Guidance for submission of immunohistochemistry applications to the FDA. 1998

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	Guidance for submission of immunohistochemistry applications to the FDA
Tác giả:	CDRH – Center for Devices and Radiological Health, Food and Drug Administration US Department of Health and Human Services
Năm:	1998

9. Chambers SP & Swalley SE. Designing experiments for high-throughput protein expression. Methods in molecular biology : high-throughput protein expression and purification. 2009. Vol 498. Humana Press

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	Methods in molecular biology : high-throughput protein expression and purification

10. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987, 162:156-159

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	Anal Biochem

12. Costa AR, Rodrigues ME, Henriques M, Azeredo J, Oliveira R. Guidelines to cell engineering for monoclonal antibody production. Eur J Pharm Biopharm 2010, 74:127-138

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	Guidelines to cell engineering for monoclonal antibody production
Tác giả:	Costa AR, Rodrigues ME, Henriques M, Azeredo J, Oliveira R
Nhà XB:	Eur J Pharm Biopharm
Năm:	2010

14. Crowther JR, Unger H & Viljoen GJ. Aspects of kit validation for tests used for the diagnosis and surveillance of livestock diseases : producer and end-used responsibilities. Rev Sci Tech Off Int Epiz 2006, 25:913-935

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	Aspects of kit validation for tests used for the diagnosis and surveillance of livestock diseases : producer and end-used responsibilities
Tác giả:	Crowther JR, Unger H, Viljoen GJ
Nhà XB:	Rev Sci Tech Off Int Epiz
Năm:	2006

15. Davis C. G., Gallo M. L., Corvalan R. F. (1999), Transgenic mouse as a source of fully human antibodies for the treatment of cancer, Cancer and Metastasis Revews, 18: 421-425

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	Transgenic mouse as a source of fully human antibodies for the treatment of cancer
Tác giả:	Davis C. G., Gallo M. L., Corvalan R. F
Năm:	1999

16. de Villiers EM, Fauquet C, Broker TR, Bernard HU, zur Hausen H. Classification of papillomaviruses. Virology 2004, 324:17-27

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	Virology

17. Deo Y.M., Mahadevan M.D., Fuchs R. Practical considerations in operation and scale-up of spin-filter based bioreactors for monoclonal antibody production.Biotechnol. Prog. 1996, 12:57 – 64

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	Biotechnol. Prog

18. Dreier K, Scheiden R, Lener B, Ehehalt D, Pircher H et al. Subcellular localization of the human papillomavirus 16 E7 oncoprotein in CaSki cells and its detection in cervical adenocarcinoma and adenocarcinoma in situ. Virology 2011, 409:54-68

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	Virology

19. Denton KJ, Bergeron C, Klement P, Trunk MJ, Keller T, Ridder R. The sensitivity and specificity of p16 INK4a Cytology vs HPV testing for detecting high-grade cervical disease in the triage of ASC-US and LSIL Pap cytology results. Am J Clin Pathol 2010, 134:12-21

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	Am J Clin Pathol

20. Di Stefano L, Accurti V, Coletti G, D’Alfonso A, Carta G. p 16INK4a and low-grade cervical intraepithelial neoplasia. Diagnostic and therapeutic implications. Eur J Gynaecol Oncol 2010, 31:411-414

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	Eur J Gynaecol Oncol

21. Ding L, Zou XJ, Ao JE, Yao AX, Cai L. ELISA test to detect CDKN2 (p16 INK4A ) expression in exfoliative cells : a new screening tool for cervical cancer. Mol Diagn Ther 2008, 12:395-400

Sách, tạp chí