Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HỢP THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT Ở NGÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HỢP THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT Ở NGÔ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh THÁI NGUYÊN - 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, sự giúp đỡ của các cán bộ Khoa Khoa học sự sống - Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên; Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này. Thái Nguyên, ngày 16 tháng 09 năm 2014 Tác giả luận văn Nguyễn Thi Hợp ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, ngƣời đã hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn chỉnh luận văn của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Khoa học sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và có những góp ý sâu sắc cho tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Văn Sơn và các cán bộ, kỹ thuật viên phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tốt nhất để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Cuối cùng, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Thái Nguyên, ngày 16 tháng 09 năm 2014 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hợp iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 1. Lí do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. NGÔ (ZEA MAY L.) 3 1.2. MỌT HẠI NGÔ Sitophyllus zeamais 9 1.3. PROTEINASE VÀ CYSTATIN 12 1.3.1. Proteinase và các loại proteinase 12 1.3.2. Proteinase inhibitor 14 1.4. CHUYỂN GEN THỰC VẬT 17 1.4.1. Phƣơng pháp chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 17 20 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 23 2.1.1. Vật liệu 23 2.1.2. Hoá chất và thiết bị 24 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu 25 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.2.1. Phân lập gen 25 iv 2.2.2. Phản ứng lai ghép gen Cystatin2 (Cys2) với vector pENTR TM /D-TOPO ® 31 2.2.3. Phƣơng pháp tạo vector chuyển gen mang cấu trúc gen Cys2 bằng kỹ thuật Gateway 33 2.2.4. Phƣơng pháp chuyển gen vào cây thuốc lá 35 2.2.4.1. Phƣơng pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào A. tumefaciens 35 2.2.4.2. Phƣơng pháp tái sinh cây thuốc lá 35 2.2.4.3. Phƣơng pháp tách DNA từ cây thuốc lá 36 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. PHÂN LẬP GEN CYSTATIN2 TỪ GIỐNG NGÔ CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT SL 38 3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN Cys2 43 3.3. TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN pPhaso-Cys2 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 58 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt 1 BAP 6- benzyl amino purine 2 bp Base pair Cặp bazơ 3 cDNA Complementary DNA 4 cs Cộng sự 5 DEPC Diethyl pyrocarbonate 6 DNA Deoxyribose nucleic acid 7 dNTP Deoxynucleoside triphosphate 8 EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid 9 E. coli Escherichia coli 10 GM Germination medium Môi trƣờng nảy mầm của hạt 11 IPTG Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside 12 kb kilo base 13 kDa kilo Dalton 14 LB Luria Bertani 15 MS Môi trƣờng nuôi cấy mô cơ bản theo Murashige và Skoog 16 mRNA messenger ribonucleic acid 17 OD Optical density vi 18 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp 19 RM Rooting medium Môi trƣờng ra rễ 20 RNA Ribonucleic acid 21 SDS Sodium dodecyl sulfate 22 TAE Tris – acetate- EDTA 23 X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β- D-galacto-pyranoside 24 Taq Thermus aquaticus 25 v/p Vòng/phút vii DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Bảng 1.1: Sản xuất ngô trên thế giới giai đoạn 1961 - 2012 7 Bảng 1.2: Diện tích, năng suất, sản lƣợng ngô của Việt Nam từ 2007 - 2013 9 Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 24 Bảng 2.2: Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA 26 Bảng 2.3: Thành phần của phản ứng PCR nhân gen Cys2 26 Bảng 2.4: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen Cys2 27 Bảng 2.5: Thành phần gắn gen Cystatin vào vector tách dòng pBT 27 Bảng 2.6: Thành phần của phản ứng colony - PCR 30 Bảng 2.7: Chu trình nhiệt của phản ứng colony- PCR 30 Bảng 2.8: Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 30 Bảng 2.9: Thành phần phản ứng ghép nối gen Cys2 với vector pENTR TM /D-TOPO ® 32 Bảng 2.10: Thành phần phản ứng LR 34 Bảng 2.11: Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA 36 Bảng 2.12: Thành phần chạy phản ứng PCR nhân gen Cys2 t 37 Bảng 3.1: Cys2 38130 42 Bảng 3.2: Sự sai khác giữa trình tự amino acid của giống SL và trình tự có mã số D38130 43 Bảng 3.3: Kết quả tạo cây thuốc lá chuyển gen Cys2 49 viii DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Hình 1.1: Mọt ngô Sitophilus zeamais 10 Hình 2.1: Ảnh của giống ngô SL 23 Hình 2.2: Sơ đồ minh họa phản ứng LR giữa pENTR- Cys2 33 Hình 3.1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hóa gen Cys2 38 Hình 3.2: Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch đoạn mã hoá của gen Cys2 39 Hình 3.3: Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen Cys2 40 Hình 3.4: Cystatin 2 của giống ngô SL và D38130 41 Hình 3.5: Hình ảnh t Cys2 38130 42 Hình 3.6: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR t p p plasmid pENTR-Cys2 44 Hình 3.7: Hình ảnh điện di kiểm tra vector tái tổ hợp pPhaso-Cys2 45 Hình 3.8: A.tumefaciens 46 Hình 3.9: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR t h trong chủng vi khuẩn A.tumefaciens CV58 47 Hình 3.10: 48 Hình 3.11: Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ lá cây thuốc lá; 49 Hình 3.12: Hình điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen Cys2 từ thuốc lá 50 [...]... năng kháng mọt ở ngô 2 Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chính gen cystatin liên quan đến khả năng kháng mọt giống ngô địa phƣơng Sơn La 3 Nội dung nghiên cứu - Phân lập và xác định đƣợc trình tự gen cystatin ở - Thiết kế vector mang cấu trúc gen cystatin vector chuyển gen - sự có mặt của phản ứng PCR gen cystatin vào cây thuốc lá gen cystatin bằng 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI... một gen cystatin lúa mạch trong ngô tăng cƣờng sức đề kháng [23] Các nghiên cứu đều thống nhất rằng đặc tính kháng mọt của cây ngô do nhiều gen quyết định, trong đó có gen Cystatin Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn của việc chọn tạo 2 giống ngô theo hƣớng nâng cao khả năng kháng mọt, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen cystatin liên quan đến khả năng kháng. .. ngô mới có khả năng kháng mọt cao, chất lƣợng tạo Có nhiều công trình nghiên cứu đến khả năng kháng mọt của ngô, là kết quả nghiên cứu thành phần sâu mọt hại ngô bảo quản, đặc điểm sinh thái học của loài mọt ngô, đánh giá giống ngô nhiệt đới kháng mọt Sitophilus zeamais [40], đánh giá giống ngô kháng mọt [42], nghiên cứu đánh giá cải thiện giống ngô lai với mức độ kháng khác nhau với mọt ngô [46],... đƣợc đoạn gen cystatin 16 có chiều dài 461bp với 2 exon và 1 intron; Protein do gen mã hóa có 98 amino acid [15] So với gen cystatin phân lập từ DNA hệ gen, gen cystatin phân lập từ mRNA chiếm số lƣợng lớn hơn Kết quả nghiên cứu ở ngô cho thấy, có 10 gen cystatin của ngô, các gen ký hiệu là CC gồm có CC1, CC2, CC3, CC4, CC5, CC6, CC7, CC8, CC9, và CC10 [37] Trong 10 gen cystatin ở ngô, có 9 gen đƣợc... này là hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ Hệ thống này gọi là hệ thống vector liên hợp Cả gen tiền ung thƣ và gen tổng hợp opine ở dạng T - DNA hoang dại đều đƣợc thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh) Gen sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid cũng bị loại bỏ và chỉ giữ lại gen vir cần thiết cho việc hình thành bộ máy và cấu trúc đảm bảo cho việc sao chép... công nghệ gen Đây là kỹ thuật chuyển gen đƣợc ƣa chuộng nhất vì có nhiều ƣu điểm so với chuyển gen bằng phƣơng pháp bắn gen, nhƣ cho nhiều sự kiện chuyển gen ổn định, ít bản sao, thể hiện đúng, tăng tần số đồng biểu hiện và ít có sự tái sắp xếp gen chuyển nạp Đến nay, các quy trình chuyển gen hiệu quả đã đƣợc xây dựng cho các cây một lá mầm nhƣ lúa [24], [30], lúa mì [26] Chuyển gen vào phôi non ngô dòng... phân biệt chủ yếu dựa vào dạng cơ quan sinh dục đực (penis) ở mọt gạo có hình bán nguyệt, còn ở mọt ngô là hình 3 góc Bề mặt phía trên của penis ở mọt gạo đơn giản, không có lông dài, còn ở mọt ngô thì có 2 lông dài Đầu máng đẻ trứng của con cái mọt gạo có hình chữ Y, còn của mọt ngô là hình móc nhọn 11 Các lỗ chấm ở ngực trƣớc khá trơn và không có vùng lỗ chấm lộn xộn ở giữa Chấm lõm trên đầu rất rõ... tái sinh từ phôi non và xác định phƣơng pháp chuyển gen thích hợp ở ngô ở hai dòng ngô HR8 và HR9, tác giả nhận định rằng chuyển gen bằng súng bắn gen có hiệu quả cao nhất đối với hai dòng ngô nghiên cứu [14] Đinh Văn Trình và cs sử dụng A.tumefaciens EHA105 chứa vector pBiG.ubi mang gen chịu hạn - ZmDREB2A và gen kháng hygromycin hpt Nhóm tác giả sử dụng râu ngô đã đƣợc cách ly tiếp xúc với dịch huyền... tumefaciens vào phôi non để tạo cây ngô chuyển gen kháng chất điệt cỏ [34] 21 Với việc áp dụng kĩ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Trƣơng Thu Hằng đã chọn tạo thành công dòng ngô HR9 có mang gen kháng sâu CryIAc Khi phân tích biểu hiện của gen kháng sâu (CryIAc) ở thế hệ T1, đã chỉ ra rằng trong số hơn 1500 cá thể thuộc 10 dòng HR9 thế hệ T0 mang gen CryIAc có khoảng hơn 100... sữa đến màu nâu nhạt Giai đoạn nhộng: dài 3-4 mm, hình bầu dục, cân đối 2 đầu, lúc đầu màu vàng sữa sau chuyển sang màu vàng nâu Cũng nhƣ mọt gạo, mọt ngô có thể bay đƣợc, nó còn bay mạnh hơn mọt gạo cho nên mọt ngô đã gây hại ngay từ ngoài đồng Trên các ruộng ngô ở Tây Nguyên, mọt ngô thƣờng xuất hiện và phát triển vào thời kỳ chuẩn bị thu hoạch [6], [27] Đặc điểm về chu kì sống Khả năng sinh trƣởng . giống ngô theo hƣớng nâng cao khả năng kháng mọt, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen cystatin liên quan đến khả năng kháng mọt ở ngô . 2 LẬP GEN CYSTATIN2 TỪ GIỐNG NGÔ CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT SL 38 3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN Cys2 43 3.3. TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN pPhaso-Cys2 47 KẾT LUẬN. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chính gen cystatin liên quan đến khả năng kháng mọt giống ngô địa phƣơng Sơn La. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và xác định đƣợc trình tự gen cystatin