i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG THỊ TRANG SỬ DỤNG CHỈ THỊ SSR ĐỂ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƢƠNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2014 ii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, đƣợc sự đồng ý của cán bộ hƣớng dẫn chƣa đƣợc ai công bố . Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Hoàng Thị Trang iii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã định hƣớng khoa học, tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình tôi tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Thanh Trà đã tạo mọi điều kiệ ệm. Tôi x Hoàng Phú Hiệp và các thầy, cô Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Th i Nguyên đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Tôi xin tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ khoa Khoa học sự sống, trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo và truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu khoa học. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã nhiệt tình động viên cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. . Thái Nguyên, tháng 10 năm 2014 Tác giả Hoàng Thị Trang iv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤ viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 3 1.1.1. Cây đậu tƣơng 3 1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tƣơng 9 1.2. BỆNH GỈ SẮT VÀ TÍNH KHÁNG BỆNH GỈ SẮT Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG 10 1.2.1. Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tƣơng 10 1.2.2. Tính chống chịu bệnh gỉ sắt của cây đậu tƣơng 12 1.2.3 ở cây đậu tƣơng 13 1.3. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG 17 1.3.1. Chỉ thị hình thái 17 18 v Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1.3.3.Chỉ thị phân tử 18 1.3.4. Bản đồ QTL 23 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 25 2.1.1. Vật liệu 25 2.1.2. Hóa chất 26 2.1.3. Thiết bị và địa điểm nghiên cứu 27 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.2.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu và tách chiết DNA tổng số 27 2.2.2. Tuyển chọn và tổng hợp các cặp mồi SSR cho phân tích mẫu 28 2.2.3. Phản ứng PCR-SSR 30 2.2.4. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose 31 2.2.5. Phƣơng pháp phân tích và xử lý dữ liệu PCR-SSR 31 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1. NHÂN BẢN CÁC PHÂN ĐOẠN DNA BẰNG PHẢN ỨNG PCR-SSR 32 3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mầm đậu tƣơng 32 3.1.2. Kết quả ằng phản ứng PCR- SSR 33 ỀN CỦA CÁC GIỐ TƢƠNG KHÁNG BỆ 41 44 KẾT LUẬ 49 1. Kết luận 49 2. Đề nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2-DE Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều ABC ATP - binding cassette AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa dạng chiều dài các phân đoạn đƣợc nhân bản ASM Acibenzolar-S-methyl benzo-(1,2,3)- thiadiazole-7-carboxylic acid S-methyl ester AVRDC Asian Vegetable Research Devlopment Center - Trung tâm phát triển rau màu Châu Á, Đài Loan AUDPC Area Under Disease Progress Curve Bp Base pair cs Cộng sự CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid ĐVT Đơn vị tính EDTA Ethylene Diamin Tretraaxetic Acid EtBr Ethidium bromide FAO Food and Agriculture Organisation – Tổ chức Nông Lƣơng thế giới ISSR Inter - Simple Sequence Repeat kb Kilo base MAS Marker Assisted Selection – Chỉ thị phân tử PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi tr ùng hợp polymerase QTL Quantitative Trait Loci - Bản đồ các locus kiểm soát tính trạng số lƣợng RAPD Random Amplified Polymorphism DNA - DNA đa hình đƣợc nhân bản ngẫu nhiên RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism - đa hình về chiều dài phân đoạn cắt hạn chế vii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ SDS Sodium Đoecyl Sulphat SNP Single nucleotide polymorphism SSR Simple Sequence Repeats -trình tự lặp lại đơn giản STSs Sequence Tagged Site TAE Tris – Acetate – EDTA Tris Trioxymetylaminometan XK Xuất khẩu USDA United State Department of Agriculture - Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ UPGMA Phƣơng pháp phân nhóm viii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Bảng 1.1. Diện tích thu hoạch đậu tƣơng một số nƣớc trên thế giới 4 Bảng 1.2. Sản lƣợng sản xuất đậu tƣơng ở một số quốc gia trên thế giới 5 Bảng 1.3. Năng suất đậu tƣơng một số nƣớc trên thế giới 7 Bảng 1.4. Diện tích, năng suất, tổng sản lƣợng của đậu tƣơng của nƣớc ta trong năm 2011, 2012, 2013 và dự báo trong các năm tiếp theo 2014 -2015 8 Bảng 2.1. Ký hiệu, xuất xứ và đặc điểm của các giống đậ 25 Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu 30 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR-SSR 31 Bảng 3.1. Số phân đoạn DNA đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR-SRR từ 5 cặp mồi SSR 39 Bảng 3.2. Tỷ lệ phân đoạn đa hình khi sử dụng 5 cặp mồi SSR. 40 SSR (%) 41 ix Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH 1.1. Diện tích trồng và sản lƣợng cây đậu tƣơng tại Việt Nam (2011-2015) …9 Hình 1.2. gỉ sắt 12 ệ ổng số tách từ mầm đậ 12 giống đậu tƣơng nghiên cứu 32 ới cặp mồi Satt009- F/Satt009-R 33 ới cặp mồi Sat_640 –F /Sat_640-R 34 với cặp mồi Sct_187-F /Sct187-R 35 với cặp mồi Satt431-F/ Satt431-R 36 với cặp mồi Satt460-F /Satt460-R 38 12 giống đậu tƣơng có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắ 42 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao, mang ý nghĩa trong cải tạo đất trồng, dễ canh tác, đặc biệt có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác nhau. Hạt đậu tƣơng chứa 30-55% protein, chứa nhiều loại amino acid không thay thế, 12-25% lipid và các vitamin cần thiết cho cơ thể. Các sản phầm từ đậu tƣơng đƣợc sử dụng rộng rãi cho các mục đích khác nhau nhƣ làm thức ăn, dầu ăn, thực phẩm chức năng, nguyên liệu cho y học và công nghiệp…Bên cạnh giá trị dinh dƣỡng cao, cây đậu tƣơng còn có khả năng cố định đạm nhờ vi khuẩn R. japonicum sống cộng sinh trên rễ cây tạo thành các nốt sần, giúp cải tạo đất hiệu quả. Do đó, cây đậu tƣơng đã đƣợc quan tâm trồng và phát triển mạnh ở nhiều quốc gia trên thế giới. Ở Việt Nam, đậu tƣơng là nhóm cây trồng chính đƣợc ƣu tiên khuyến khích phát triển, sản xuất đứng sau lúa, ngô và lạc. Việt Nam từng là một nƣớc xuất khẩu đậu tƣơng vào những năm 1980, tuy nhiên cho đến nay nƣớc ta đã trở thành nƣớc nhập khẩu đậu tƣơng với số lƣợng lớn với hàng triệu tấn khô dầu đậu tƣơng đang đƣợc nhập khẩu hàng năm. Mặc dù diện tích gieo trồng có tăng hàng năm những năng suất thấp và sản lƣợng đạt đƣợc không ổn định, khả năng chống chịu bệnh và các stress kém. Sâu bệnh nói chung và bệnh gỉ sắt nói riêng là nguyên nhân trực tiếp ảnh hƣởng tới diện tích gieo trồng và làm giảm năng suất, chất lƣợng hạt đậu tƣơng, gây tổn thất lớn về kinh tế. Bệnh gỉ sắt ở đậu tƣơng do loài nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra và đang đƣợc coi là một trong những mối đe dọa chính trên cây đậu tƣơng gây thiệt hại đáng kể, làm giảm từ 10-80% năng suất và chất lƣợng đậu tƣơng ở nhiều nƣớc [...]... sự đa dạng di truyền của tập đoàn đậu tƣơng có phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống có khả năng kháng bệnh mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống có chất lƣợng cao Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài: Sử dụng chỉ thị SSR để phân tích tính đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng. .. giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau 2 Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá đƣợc mức độ đa dạng di truyền của một số giống đậu tƣơng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau bằng chỉ thị SSR 3 Nội dung nghiên cứu - Tách và nhân bản các phân đoạn SSR bằng phản ứng PCR - SSR - Nghiên cứu, phân tích mức độ đa dạng di truyền của các giống đậu tƣơng dựa trên chỉ thị SSR Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/... M T S C PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG Hiện nay trong phân tích tính đa dạng di truyền của thực vật ngƣời ta có thể tiến hành thực hiện ở các cấp độ và phƣơng pháp khác nhau, từ các đặc điểm hình thái, sinh lý và hoá sinh đến đặc điểm của phân tử DNA, protein Phân tích đa dạng di truyền ở đậu tƣơng dựa trên một số phƣơng pháp nhƣ chỉ thị hình thái, chỉ thị hoá sinh và chỉ thị phân tử DNA... 1.3.1 Chỉ thị hình thái Chỉ thị hình thái là một chỉ thị đồng trội, thƣờng đƣợc biểu hiện dƣới dạng một tính trạng đƣợc kiểm soát bởi một locus đơn lẻ nhƣ các gen quy định màu sắc hoa và hình dạng của hạt, vỏ Mặc dù chỉ thị hình thái đƣợc sử dụng nhƣ một chỉ thị di truyền, song khả năng ứng dụng của nó trong chọn giống gặp phải nhiều hạn chế bởi chúng luôn chịu ảnh hƣởng của các nhân tố di truyền. .. cứu và Phát triển Đậu đỗ -Viện Cây lƣơng thực và cây thực phẩm đã nghiên cứu, lai tạo và kiểm định đƣợc một số giống có khả năng kháng với bệnh gỉ sắt nhƣ: DT2000, CBU8325, DT95 Giống DT2000 đƣợc công nhận là giống Quốc gia có khả năng kháng cao đối với gỉ sắt ở các mùa vụ khác nhau Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị SSR bƣớc đầu khả quan Nhƣ vậy, do các đoạn SSR có mức độ đa hình cao và phân bố ngẫu nhiên... (có khả năng chịu sâu, nấm và chịu hạn tốt) và các giống tạo ra từ bằng phƣơng pháp đột biến nhƣ DT84, DT95, M103 và DT96, con lai của DT84 và DT90 (có khả năng kháng bệnh gỉ sắt) đƣợc đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt dựa trên chỉ số tích luỹ bệnh theo thời gian AUDPC kết hợp các phân tích về phản ứng bệnh, khả năng tạo bào tử và tạo quầng [17] Kết quả cho thấy, các giống DT95 và CBU8325 có chỉ số. .. – SSRs) có mặt khắp nơi trong hệ gen của sinh vật nhân thực Trong thập kỷ qua, các chỉ thị này đã đƣợc nghiên cứu và khẳng định rất hữu dụng trong phân tích hệ gen và phân tích quan hệ di truyền, xác định khoảng cách di truyền, ƣớc tính dòng chảy gen và xây dựng bản đồ liên kết [33], [40] Mặc dù các chỉ thị SSR có tính ƣu việt rất lớn trong việc nghiên cứu di truyền hệ gen, phân tích đa dạng di truyền, ... bằng PCR sử dụng các mồi đặc trƣng; (v) Phân tích kích thƣớc của sản phẩm PCR nhằm xác định đƣợc sự có mặt của các alen SSR SSR là công cụ hữu ích của phân tích hệ gen, lập bản đồ gen và đặc biệt là chọn giống phân tử vì đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao Song nhƣợc điểm cơ bản của chỉ thị này là quá trình thiết kế mồi đắt đỏ, mỗi một loại mồi chỉ đặc trƣng cho một loài... làm thuốc chữa bệnh rất tốt, nhất là hạt đậu tƣơng có mầu đen 1.2 BỆNH GỈ SẮT VÀ TÍNH KHÁNG BỆNH GỈ SẮT Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 1.2.1 Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương Bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra là một trong những bệnh chính trên cây đậu tƣơng (Glycine max) ở Châu Á và gây thiệt hại đáng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 11 kể về năng suất ở các nƣớc trồng đậu tƣơng Hầu... nhiên DNA để phân tích sự đa dạng di truyền, kỹ thuật này đƣợc phát hiện vào năm 1990 bởi Welsh và cộng sự [42] RAPD đã đƣợc sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự đang dạng di truyền của cùng một loài hoặc sự khác biệt di truyền của những loài khác nhau Mồi đƣợc sử dụng trong kỹ thuật RAPD là những sợi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 19 oligonucleotide gồm 10 cặp nucleotide có trình . tài: Sử dụng chỉ thị SSR để phân tích tính đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau . 2. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá đƣợc mức độ đa dạng di truyền. 1.2.1. Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tƣơng 10 1.2.2. Tính chống chịu bệnh gỉ sắt của cây đậu tƣơng 12 1.2.3 ở cây đậu tƣơng 13 1.3. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG 17 1.3.1. Chỉ thị hình. tích phản ứng bệnh mà chƣa chú trọng nhiều đến việc tìm hiểu khả năng kháng bệnh gỉ sắt. Việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền của tập đoàn đậu tƣơng có phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt