Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… Lê Nguyễn Nguyên Hạ PHÁT HIỆN ĐOẠN GEN ELIP 18 CỦA CHỦNG Edwarasiella ictaluri ATCC 33202 BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAMP (Loop – mediated isothermal amplification) Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60.42.40 LUẬN ÁN THẠC SỸ KHOA HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS TRƯƠNG NAM HẢI Hà Nội, 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… Lê Nguyễn Nguyên Hạ PHÁT HIỆN ĐOẠN GEN ELIP 18 CỦA CHỦNG Edwarasiella ictaluri ATCC 33202 BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAMP (Loop – mediated isothermal amplification) Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60.42.40 LUẬN ÁN THẠC SỸ KHOA HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS TRƯƠNG NAM HẢI Hà Nội, 2010 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Ở Việt Nam, trong 10 năm trở lại đây nghề nuôi cá tra đang phát triển rất nhanh với quy mô lớn tại một số tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long nhƣ An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang với mục đích xuất khẩu sang các nƣớc nhƣ Mỹ và Châu Âu. Việc thâm canh hóa trong nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), đặc biệt là nuôi với mật độ cao và chƣa có những biện pháp quản lý dịch bệnh hợp lý đã làm cho dịch bệnh xảy ra thƣờng xuyên hơn và gây thiệt hại nhiều hơn. Một trong những bệnh truyền nhiễm đã và đang gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất và sản lƣợng cá nuôi là bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây nên. Tỉ lệ xuất hiện bệnh mủ gan trên cá tra khoảng 61%, nhƣng tỷ lệ chết đến 60 - 80%, làm giảm năng suất đáng kể trong các hệ thống nuôi. Hiện nay chƣa có vaccine phòng bệnh này một cách hiệu quả, do đó việc phát hiện sớm tác nhân gây bệnh đóng vai trò quan trọng trong phòng chống, kiểm soát và điều trị bệnh cho cá, ao nuôi nhằm hạn chế tối thiểu thiệt hại về kinh tế cho bà con. Thông thƣờng, để phát hiện một tác nhân gây bệnh bằng phƣơng pháp vi sinh trong phòng thí nghiệm thƣờng mất từ 3 đến 7 ngày, đối với phƣơng pháp PCR truyền thống có thể từ 3 đến 4 giờ, đối với phƣơng pháp ELISA có thể từ 1 đến 2 ngày. Các phƣơng pháp này không nhanh nhạy, lại khó thao tác, phức tạp và có chi phí cao. Trong khi đó, LAMP là một phƣơng pháp chẩn đoán mới, nhanh nhạy, phát hiện chính xác tác nhân gây bệnh với khả năng ứng dụng nhanh bên ngoài phòng thí nghiệm. Đứng trƣớc tình hình đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Phát hiện đoạn gen eip18 của chủng Edwardsiella ictaluri ATCC 33202 bằng phƣơng pháp LAMP (Loop mediated isothermal amplifications)” với mục đích xây dựng phƣơng pháp để phát triển hƣớng tạo kit phát hiện một số tác nhân gây bệnh. 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VI KHUẨN Edwardsiella Edwardsiella là một trong những chi mới thuộc họ Enterobacteriaceae, lần đầu tiên đƣợc phân lập và phân loại bởi nhà khoa học ngƣời Mỹ P.R Edwards (1901-1966) [16, 28]. Chi Edwardsiella gồ m 3 loài: E. tarda, E. ictaluri, E. hoshinae, trong đó E. ictaluri đƣợc tìm thấy muộn nhất. Chi Edwardsiella mang các đặc điểm điển hình của họ Enterobacteriaceae: vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng, nhỏ, kích thƣớc 1 × 2 - 3 µm, không hình thành bào tử, không di động hoặc di động bằng tiên mao, hô hấp kị khí tùy tiện. Kích thƣớc khuẩn lạc trên môi trƣờng cơ sở sau 24 giờ nuôi cấ y rấ t nhỏ chỉ từ 0,5 đến 1 mm) [12, 32]. Hình 1.1. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri soi dƣới kính hiển vi điện tử (A) và nhuộm Gram (B) (http://www.micro-gen.ouhsc.edu) Nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu của chi Edwardsiella là 37 0 C, trừ E. ictaluri, phát triển ở nhiệt độ thấp hơn 28-30 o C. Trong quá trình tăng trƣởng cần bổ sung nicotinamide và acid amin, khử nitrat thành nitrit. Lên men D-glucose cho sản phẩm là các acid và các khí thông thƣờng khác. Ngoài ra còn có thể lên men một số carbohydrate khác nhƣng không lên men đƣợc nhiều nhƣ các chi khác thuộc họ Enterobacteriaceae. Vi khuẩn thƣờng phân lập đƣợc từ các loài cá sông, các loài động vật máu lạnh và môi trƣờng sống của chúng, đặc biệt là nƣớc ngọt. Chúng gây bệnh cho cả động vật máu nóng nhƣ: chó, lợn, bò, khỉ, chuột, chồn hôi, sƣ tử biển… nhƣng vai trò gây bệnh ở các đối tƣợng này chƣa đƣợc biết đến nhiều. Hầu hết ngƣởi ta chỉ quan tâm đến tác hại gây bệnh của vi khuẩn thuộc chi này trên cá, đặc A B 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn biệt là cá da trơn do mức độ nguy hiểm về khả năng bùng phát thành dịch với mức độ thiệt hại về kinh tế khá lớn [12]. Vi khuẩn thuộc chi Edwardsiella có khả năng đ ề kháng v ới colistin và polimycin B nhƣng lạ i khá nhạ y cả m vớ i mộ t số tá c nhân khá ng vi sinh vậ t thông thƣờ ng nhƣ penicillin G , ampicillin, carbenicillin, streptomycin, kanamycin, gentamicin, tetracycline, chloramphenicol, cephalosporins, sulfadiazine, exceptions và nalidixic acid [7, 12]. Tuy nhiên, Waltman và đtg (1986) đã bá o cá o về khả năng kháng mạnh các hợp chất lƣu hunh, streptomycin và methicillin bằ ng phƣơng phá p khuế ch tá n trên đĩ a thạ ch, nhƣ̃ ng khá c biệ t nà y cũ ng có thể là do sƣ̣ khá c biệ t về nguồ n phân lập vi khuẩ n. E. tarda có thể gây ra sự bùng phát bệnh xuất huyết trong ao nuôi cá chình hay bệnh thối rữa khí thũng ở cá da trơn và nhiễm trùng cơ hội ở ngƣời [22]. Các báo cáo này cho thấy E. tarda gây ra bùng phát ổ dịch trong hàng loạt các ao nuôi. E. tarda thƣờng đƣợc phân lập từ cá hồi và các loài cá khác ở Tây bắc Thái Bình Dƣơng của Hoa K và cũng đƣợc khẳng định là nguyên nhân gây bệnh trên cá hồi, cá bẹ và cá hồi cầu vồng cũng nhƣ là cá da trơn [12]. Theo báo cáo của Grimont và cộng sự năm 1980, môi trƣờng sống của E. hoshinae đƣợc biết đến hiện nay bao gồm các loài bò sát, chim và nƣớc. Mặt dù có hai trong số các nghiên cứu của họ đƣợc phân lập từ phân con ngƣời nhƣng những ngƣời này không bị bệnh nên không có bằng chứng để khẳng định E. hoshinae gây ra bệnh tiêu chảy cho ngƣời. Một loài khác của Edwardsiella là E. ictaluri đƣợc cho là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng huyết cấp tính trên cá da trơn. Từ khi công bố đầu tiên của Hawke và đtg (1981), bệnh này đã trở thành một vấn đề rất trầm trọng của ngành nuôi cá da trơn trong vùng đông nam Hoa K. Shott và đtg (1986) cho rằng bệnh sinh của E. ictaluri có thể đƣợc truyền thông qua nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa. Viêm ruột gây nhiễm trùng máu do E. ictaluri gây ra khi nhiệt độ môi trƣờng từ 22- 28 o C, và tiến triển nhanh chóng, kết quả là tỷ lệ tử vong tăng lên đáng kể [18]. Nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển của E. ictaluri trong phòng thí nghiệm là từ 25 - 30 o C và nhiệt độ cho bệnh bắt đầu xuất hiện ở ngoài môi trƣờng là khoảng 22 - 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 28 o C. Điều này phản ánh sự thích ứng của chúng trong vật chủ biến nhiệt. E. ictaluri sinh trƣở ng rấ t chậ m trên môi trƣờ ng thạ ch đĩa , thông thƣờ ng sau 2-3 ngày nuôi cấ y ở 30 0 C mớ i tạo thành khuẩn lạc kích thƣớc 1 mm. Trong khi đó E. tarda và E. hoshinae sinh trƣởng và phát triển ở nhiệt độ cao hơn khoảng 37 o C và về mặ t sinh hó a cũng nhi ều hoạt tính hơn E. ictaluri [12, 14]. E. ictaluri có khả năng di động yếu khi nuôi cấy tại 25 - 30 o C và hoàn toàn không di động khi nuôi cấy ở 37 o C. Khả năng di động này có thể thay đổi phụ thuộc vào các điều kiện sống khác nhau [32]. E. ictaluri có những đặc điểm điển hình của chi này nhƣ kị khí không bắt buộc, hoạt tính catalase (+), hoạt tính oxidase (-), hoạt tính urease(+), dƣơng tính với glucose. Khác với E. tarda chúng không sinh H 2 S và không sinh Indole. Do hai loài này có hình dạng rất giống nhau và cùng là tác nhân gây bệnh trên cá da trơn nên sự khác nhau về các hoạt tính sinh hóa là đặc điểm quan trọng để phân biệt và xác định đƣợc chính xác tác nhân gây trên trên cùng một vật chủ [28]. Một đặc điểm sinh hóa điển hình của E. ictaluri là khả năng sinh enzyme phân hủy chondroitin – thành phần chính của sụn. Khả năng này liên quan trực tiếp tới bệnh viêm não cấp tính ở cá đặc biệt đối với cá giống có tỷ lệ sụn cao. Hoạt tính tan huyết cũng là một trong những hoạt tính quan trọng liên quan tới độc tính của vi khuẩn này. Do là loài vi khuẩn ƣa huyết nên trên cá thể bị bệnh thƣờng chỉ đƣợc phân lập đƣợc ở những cơ quan nhiều máu nhƣ gan, thận, tì tạng. Chỉ có một lƣợng rất nhỏ vi khuẩn đƣợc phân lập từ mô não của cá bệnh. E. ictaluri thiếu các enzyme nhƣ lipase, protease, pectinase, alginease, collagenase, chitinase và hầu hết các enzyme ngoại bào [12]. Các plasmid khác nhau, từ 2-120 MDa cũng đƣợc tìm thấy ở Edwardsiella [20]. Sự hiện diện của R plasmid là trung gian kháng kháng sinh đã đƣợc tìm thấy trong E. tarda bởi Aoki và đtg (1977). Các chủng E. ictaluri phân lậ p tƣ̀ cá da trơn luôn luôn chƣ́ a 2 plasmid 5.7 và 4.9 kb (kí hiệu là pCL 1 và pCL2) [17]. Các nhà khoa họ c giả thiế t rằ ng chƣ́ c năng củ a cá c plasmid nà y mã hó a cho cá c protein tạ o ra tính độ c hoặ c có vai trò quan trọ ng trong vậ t chủ hoặ c cả hai . Lobb và đtg (1993) đã phân lậ p đƣợ c vi khuẩ n tƣ̀ cá kiế m xanh (khác biệt về mặt huyết thanh học với cá 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn da trơn) có chứa 4 plasmid có liên quan đế n khả năng di độ ng củ a vi khuẩ n nà y vớ i kích thƣớc lần lƣợt là 6.0, 5.7, 4.1 và 3.1 kb trong đó plasmid 5.7 và 4.1 kb nà y tƣơng tƣ̣ vớ i pCL1 và pCL2 [17, 20]. Genome của E. ictaluri là một nhiễm sắc thể đơn dạng vòng, có kích thƣớc khoảng 2,15 Mb. Nghiên cứu DNA chỉ ra rằng E. ictaluri liên quan chặt chẽ nhất đến E. tarda. Trong hệ gen của E. ictaluri thì họ gen eip là đặc trƣng chỉ có ở loài E. ictaluri. Họ gen này bao gồm 11 gen trong đó chỉ có 8 gen xác định mã hóa cho protein. Trong số đó có 3 gen lần lƣợt là eip18, eip19, eip20 mã hóa cho các sản phẩm protein với trọng lƣợng khoảng 18, 19 và 20 kDa. Theo Moore và đtg (2002) thì gen eip18 đƣợc biểu hiện trong quá trình nhiễm bệnh và đóng vai trò là kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch [22]. Do họ gen này mang tính đặc trƣng cho loài nên có thể sử dụng một trong số 3 gen này để phân lập đến loài bằng phƣơng pháp sinh học phân tử. Hiện nay, gen eip18 là gen đƣợc dùng nhiều trong các nghiên cứu để phát hiện, định danh vi khuẩn E. ictaluri, tác nhân gây bệnh nhiễm trùng huyết trên cá da trơn Mỹ [34]. Phân tích phát sinh loài dựa trên sự tƣơng đồng của 16S- 23S rDNA cho thấy sự tƣơng đồng giữa E. ictaluri và E. tarda đạt tới 96% [19]. Tỷ lệ G + C của E. ictaluri là khoảng 53%. Việc sử dụng các trình tự gen mã hóa 16S rRNA để nghiên cứu phát sinh loài vi khuẩn và phân loại đã đƣợc sử dụng rất phổ biến. Chúng tồn tại nhƣ một họ đa gen hoặc operon; chức năng của gen mã hóa 16S rRNA không thay đổi theo thời gian cho thấy sự thay đổi thứ tự ngẫu nhiên là một thƣớc đo chính xác trong quá trình tiến hóa và gen 16S rRNA có kích thƣớc khoảng 1500 bp là đủ lớn cho các mục đích thông thƣờng dùng trong phân loại ở cấp độ phân tử [25]. 1.2 BỆNH GAN THẬN MỦ 1.2.1 Tác nhân gây bệnh gan thận mủ E. ictaluri đƣợc phát hiện là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng huyết ở cá da trơn (Ictalurus punctatus) nuôi ở các bang Đông nam Mỹ bởi Hawke năm 1981 [18]. Từ đó đến nay vi khuẩn này luôn đƣợc xem là nguyên nhân gây bệnh nhiễm trùng huyết với tỷ lệ chết rất cao trên cá da trơn nuôi công nghiệp. Cá thƣờng bị 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn nhiễm bệnh vào các tháng cuối năm khi nhiệt độ nƣớc hạ thấp (khoảng từ tháng 9 đến tháng 1 năm sau). Do mở rộng nuôi trồng và kiểm soát dịch không tốt nên dẫn đến việc dịch bệnh diễn ra quanh năm. Thời điểm phát triển bệnh và khả năng lây lan của bệnh khác nhau theo từng năm liên quan đến những biến động về thời thiết và điều kiện nuôi trồng. Vi khuẩn tồn tại trong môi trƣờng ao nuôi và trong cơ thể cá khỏe mạnh, khi bị shock do vận chuyển, thay đổi nhiệt độ, thức ăn cũng có thể dẫn đến bùng phát bệnh. Bệnh có thể tiến triển rất nhanh trong ao nuôi gây thiệt hại nặng về kinh tế [38]. Ở Việt Nam, bệnh gan thận mủ xuất hiện đầu tiên vào cuối năm 1998 [3]. Mặc dù đƣợc phát hiện muộn hơn so với một số các bệnh khác nhƣng bệnh gan thận mủ đƣợc đánh giá là bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng. Tỷ lệ cá chết do nhiễm bệnh cao, từ 50 - 60% và nguy hiểm nhất là giai đoạn cá giống. Ở giai đoạn này tỷ lệ cá chết có thể lên tới 90% [4]. Nhƣ vậy bệnh gan thận mủ đƣợc đánh giá là một trong những bệnh gây tổn thất lớn cho ngành nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là cá tra và cá basa của nƣớc ta. Cá tra Việt Nam mắc bệnh gan thận mủ có những biểu hiện tƣơng tự nhƣ cá da trơn của Mỹ nhƣ: ở mức độ nhẹ, cá ăn ít, gầy yếu, bụng chƣớng to, mắt hơi lồi, bên ngoài thân cá bình thƣờng không biểu hiện xuất huyết nhƣng khi mổ ra thì gan, thận, t tạng xuất hiện nhiều đốm trắng (nhƣ đốm mủ). Ở mức độ nặng hơn cá có thể bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nƣớc, cá thƣờng nhào lộn và xoay tròn mất phƣơng hƣớng. Khi bệnh nặng cá không phản ứng với tiếng động. Một số cá có thể xuất huyết tất cả các vi và toàn thân. Đó là những biểu hiện đặc trƣng nhất của bệnh gan thận mủ [1, 8]. 1.2.2 Tình hình bệnh dịch Nuôi trồng thủy sản thƣơng mại lần đầu tiên đƣợc coi là nhƣ là ngành kinh tế bắt đầu từ thập niên 1950 ở Mỹ. Trong thập niên 1960, 1970 nuôi cá da trơn phát triển nhanh chóng, các cải tiến trong quản lý ao nuôi, nhận diện và kiểm soát dịch bệnh, và chuẩn bị thức ăn cũng đƣợc phát triển. Ngành công nghiệp này phát triển 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn nhanh ở miền Nam nƣớc Mỹ, ít nhất 90% cá nuôi đƣợc sản xuất trong khu vực thung lũng sông Mississippi. Đến nay, cá da trơn (Ictalurus punctatus) đƣợc nuôi với quy mô lớn ở các bang Đông Nam nƣớc Mỹ nhằm cung cấp cá da trơn thƣơng phẩm cho thị trƣờng này. Tuy nhiên, những thiệt hại gần đây do dịch bệnh mang lại làm cho ngành công nghiệp cá da trơn tổn thất hàng triệu USD và tăng đều đặn hàng năm cùng với sự phát triển của ngành công nghiệp này. Sản lƣợng cá da trơn thƣơng mại sản xuất chiếm 85- 90% của tổng số sản xuất nuôi trồng thuỷ sản cá ở Hoa K, với gần 300.000 tấn sản xuất hàng năm và thiệt hại đáng kể do bệnh nhiễm trùng huyết đƣợc báo cáo hơn 60% của tất cả các trang trại hoạt động (USDA, 2007). Hình thức nuôi thâm canh với mật độ cao là nguyên nhân dẫn đến những vấn đề suy thoái môi trƣờng và bệnh dịch [10]. Bệnh nhiễm trùng huyết là một trong những bệnh phổ biến và tốn kém nhất trong số các bệnh do vi khuẩn gây ra ảnh hƣởng lớn tới việc nuôi trồng và xuất khẩu cá tra ra thị trƣờng tiêu thụ và là một trong những bệnh gây trở ngại chính cho lợi nhuận của nông dân nuôi cá da trơn thƣơng mại. Bệnh thƣờng phát triển từ tháng 9 năm này đến tháng 1 năm sau. Theo báo cáo của các nƣớc trên thế giới bệnh nhiễm trùng huyết gây thiệt hại về lợi nhuận cho ngƣời nuôi từ 4 tới 50 triệu USD, ngƣời dân hằng năm phải bỏ ra 10 triệu USD cho chi phí do bệnh này [7]. Ở Việt Nam, ngành nuôi trồng thủy sản hiện nay đã phát triển khá mạnh và góp một phần không nhỏ trong GDP cả nƣớc. Năm 2008 diện tích nuôi trồng thủy sản mở rộng lên hơn 1 triệu ha và sản lƣợng đạt gần 2,4 triệu tấn góp phần đƣa kim ngạch xuất khẩu thủy sản lên 4.5 tỷ USD. Những năm gần đây cá Tra (Pangasius hypophthalmus) là loài cá nƣớc ngọt đƣợc nuôi và xuất khẩu nhiều nhất so với các đối tƣợng thủy sản khác. Theo Cục chế biến, Thƣơng mại nông lâm thủy sản và Nghề nuôi, tổng kim ngạch xuất khẩu cá Tra cả nƣớc tính từ đầu năm đến 15/11/2009 đạt gần 1,171 tỷ USD [6]. Ở Việt Nam đối tƣợng này đƣợc nuôi với quy mô công nghiệp ở một số tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long nhƣ: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang… Mặc dù đƣợc phát hiện muộn hơn so với một số các bệnh khác nhƣng bệnh gan thận mủ đƣợc đánh giá là bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng. Theo báo cáo năm 2009, tổng diện tích thả nuôi trong 6 tháng đầu 8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn năm 2009 của các địa phƣơng thuộc đồng bằng Sông Cửu Long vào khoảng 7.940 ha, bệnh gây thiệt hại khoảng 113 ha [4]. Ngƣời dân thƣờng dùng kháng sinh liều thấp để phòng bệnh cho cá do chi phí cao, việc sử dụng dẫn đến hiệu quả điều trị của kháng sinh ngày càng giảm theo thời gian sử dụng. Việc sử dụng kháng sinh không đúng liều lƣợng đã dẫn đến việc hình thành các chủng vi khuẩn E. ictaluri kháng kháng sinh trở thành trở ngại chính trong việc điều trị và hạn chế tác hại của bệnh. Khi cá bị bệnh ngƣời nuôi thƣờng dùng chất hoá học và thuốc kháng sinh để chữa trị, tuy nhiên vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra kháng với một số loại thuốc kháng sinh nhƣ: Oxytetracylin, Oxolinic acid, Sulphonamid [2]; Bactrime (100%), Colistin (97,9%), Amoxicilin (40,4%), Tetracyclin (31,9%), Doxycyclin (27,7%) và thể hiện tính nhạy với các kháng sinh nhƣ sau: Doxycyclin (63,8%), Amoxicilin (59,6%), Tetracyclin (48,9%), Colistin (2,1%) [5]. Việc sử dụng kháng sinh làm cho các sản phẩm thủy sản sau đó thƣờng không đƣợc ƣa chuộng do sự tích lũy thuốc, hoá chất trong thịt. Một trong những kháng sinh còn có tác dụng với E. ictaluri là Florfenicol, là kháng sinh thế hệ mới nhất thuộc nhóm kháng sinh Phenicol có phổ kháng khuẩn rộng, hiệu quả trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn trên gia súc, gia cầm, đối với thủy sản do vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Đầu năm 2006, Khoa Thủy sản Trƣờng Đại học Cần Thơ công bố kết quả nghiên cứu tìm kiếm các loại thuốc kháng sinh thay thế các loại thuốc cấm, đã công nhận Florfenicol là kháng sinh đặc trị bệnh này. Sử dụng thuốc từ 7 - 10 ngày sẽ cho hiệu quả tốt, cá sẽ hồi phục nhanh khi ngƣời nuôi thực hiện tốt khâu vệ sinh diệt mầm bệnh trong khu vực nuôi và trong môi trƣờng nƣớc. Florfenicol có độ tồn dƣ thấp trong mô cơ. Dùng thuốc liều 10 mg/kg thể trọng liên tục 12 ngày, khi ngƣng sử dụng 7 ngày mức tồn dƣ trong cơ cá tra còn 0,222 - 0,109 ppm (mức cho phép của Việt Nam và Mỹ là 1 ppm) [4]. Florfenicol có hoạt tính chống lại sự phát triển của vi khuẩn bằng cách kết dính với tiểu đơn vị 50S của ribosome, ngăn chặn cầu nối peptid giữa các acid amin vì vậy ức chế sự tổng hợp protein làm cho vi khuẩn này không còn khả năng phát triển và tồn tại. Sản phẩm Vime - fenfish với hoạt chất chính Florfenicol và các chất dẫn [...]... trình tự gen eip18 của vi khuẩn E ictaluri ATCC 33202 3.1.1 Phân lập gen eip18 của vi khuẩn E ictaluri ATCC 33202 Nhằm phát hiện đoạn gen eip18 đặc hiệu của vi khuẩn E ictaluri, DNA genome các chủng vi khuẩn E ictaluri ATCC 33202 đƣợc tách theo phƣơng pháp đã đƣợc trình bày ở trên Sử dụng DNA genome đã đƣợc tách chiết và cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu dựa trên trình tự gen eip18 công bố trên Genbank... của gen eip18 của vi khuẩn E ictaluri ATCC 33202 Gen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 32 eip18 thu đƣợc có độ dài 437 bp tƣơng đồng 100% với gen eip18 của vi khuẩn E ictaluri đƣợc công bố trên NCBI với số đăng kí NC_012779.1 Trên cơ sở gen eip18 của vi khuẩn E ictaluri ATCC, chúng tôi tiến hành thiết kế mồi đặc hiệu nhằm phát hiện gen eip18 bằng phƣơng pháp. .. nhân gen eip18 của vi khuẩn E ictaluri ATCC 33202 đã đƣợc thiết kế thành công, 3.1.2 Xác định trình tự gen eip18 của vi khuẩn E ictaluri ATCC 33202 3.1.2.1 Tách dòng gen eip18 bằng vector pJET 1.2/blunt Vector pJet 1.2 là vector tách dòng đầu bằng, có khả năng mang các đoạn gen ngoại lai có kích thƣớc từ 6 bp đến 10 kb Để tiến hành tách dòng gen eip18, sản phẩm PCR trƣớc khi gắn vào vector đƣợc làm bằng. .. trình tự gen eip18 đã đƣợc công bố trên Genbank với số đăng ký NC_012779.1 bằng chƣơng trình Blast cho thấy, trình tự gen eip18 của E ictaluri ATCC 33202 tƣơng đồng 98% so với gen eip18 đã đƣợc đăng ký trên Genbank Ei/10 E.i Ei/10 E.i Ei/10 E.i Ei/10 E.i Ei/10 E.i Ei/10 E.i Ei/10 E.i Ei/10 E.i Hình 3.5 So sánh trình tự gen eip18 của Ei/10 với vi khuẩn E ictaluri ATCC 33202 đã đƣợc công bố trên Genbank... hiệu đoạn DNA có kích thƣớc 230 bp của gen eip18 Kết quả trên cho thấy các mồi mà chúng tôi thiết kế là đặc hiệu cho vi khuẩn E ictaluri Các mồi này hoàn toàn có thể đƣợc sử dụng để phát hiện gen eip18 của vi khuẩn E ictaluri 3.2.3 Tối ƣu các điều kiện phản ứng LAMP Từng thành phần của phản ứng LAMP lần lƣợt đƣợc tối ƣu để tìm ra nồng độ thích hợp nhất cho phản ứng khuếch đại gen eip18 của vi khuẩn E ictaluri. .. Để xác định trình tự đoạn gen eip18 đặc trƣng cho vi khuẩn E ictaluri, DNA plasmid từ dòng tế bào biến nạp đƣợc tiến hành tinh sạch bằng QIAGEN Kit (Invitrogen) và thực hiện giải trình tự gen 3.1.2.2 Xác định trình tự gen eip18 Để xác định trình tự gen eip18, vector tái tổ hợp đƣợc dùng để làm khuôn chạy PCR để đọc trình tự trên ABI PRISM 3100 Avant Genric Analyzer Trình tự đoạn gen thu đƣợc có độ dài... phƣơng pháp PCR truyền thống khoảng 3 đến 4 giờ Bên cạnh đó, các phƣơng pháp này không cho kết quả nhanh nhạy, phức tạp, khó thao tác mà lại tốn chi phí cao Do đó, chúng tôi tiến hành phát hiện E ictaluri ATCC bằng phƣơng pháp LAMP thông qua đoạn gen eip18 Phƣơng pháp này cho kết quả nhanh, nhạy và tiết kiệm, có khả năng ứng dụng cao trong thực tế, đáp ứng đƣợc tính cấp thiết trong việc phát hiện bệnh... 1.2 có mang gen eip 18  Xác định lại sự có mặt của gen eip18 trên vector tách dòng pJet 1.2 bằng phản ứng PCR Các dòng biến nạp ở trên đƣợc tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu dành cho gen eip18 với chu trình nhiệt nhƣ đã trình bày để kiểm tra sự có mặt của gen eip18, đối chứng âm không có DNA, đối chứng dƣơng là E ictaluri ATCC 33202 Kết quả cho thấy dòng biến nạp Ei/10 chứa vector mang gen đích với... Hình 3.1 (A): Điện di kiểm tra DNA genome vi khuẩn E ictaluri ATCC (B): Phân lập gen eip18 của vi khuẩn E ictaluri ATCC M: thang DNA 1kb chuẩn (Fermentas) Kết quả kiểm tra trên hình 3.1 A cho thấy DNA genome của các chủng vi khuẩn là một băng sáng rõ nét, không lẫn RNA, đảm bảo có thể làm sợi khuôn để thực hiện phản ứng tiếp theo Sản phẩm PCR thu đƣợc là đoạn gen eip18 với kích thƣớc đúng nhƣ lý thuyết... hiện gen eip18 bằng phƣơng pháp LAMP 3.2 Phƣơng pháp LAMP 3.2.1 Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP Để thiết kế mồi cho phản ứng LAMP phát hiện đặc hiệu E ictaluri ATCC 33202 chúng tôi đã sử dụng trình tự gen eip18 của vi khuẩn này nhƣ đã đọc trình tự Trình tự này đƣợc phân tích để tìm ra 6 trình tự đặc hiệu, 4 trình tự trên sợi DNA khuôn và hai trình tự trên DNA bổ sung Bộ mồi LAMP gồm 4 mồi đƣợc sơ đồ hóa . đề tài: Phát hiện đoạn gen eip18 của chủng Edwardsiella ictaluri ATCC 33202 bằng phƣơng pháp LAMP (Loop mediated isothermal amplifications) với mục đích xây dựng phƣơng pháp để phát triển. o0o………… Lê Nguyễn Nguyên Hạ PHÁT HIỆN ĐOẠN GEN ELIP 18 CỦA CHỦNG Edwarasiella ictaluri ATCC 33202 BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAMP (Loop – mediated isothermal amplification) Chuyên ngành:. o0o………… Lê Nguyễn Nguyên Hạ PHÁT HIỆN ĐOẠN GEN ELIP 18 CỦA CHỦNG Edwarasiella ictaluri ATCC 33202 BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAMP (Loop – mediated isothermal amplification) Chuyên ngành: