Nghiên cứu tạo phức hệ nano tích hợp Curcumin

Các dược chất hoặc các tác nhân chẩn đoán được tích hợp vào bên trong liên kết hóa học hoặc gắn vào bề mặt của các hạt nano này.. Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ QUANG HUẤN

Hà Nội - 2012

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Quang

Huấn, Trưởng phòng Phòng Công nghệ tế bào động vật - Viện Công nghệ sinh

học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, dạy bảo và dành phần kinh phí thích hợp từ đề tài khoa học cơ bản định hướng ứng dụng để thực hiện các nội dung nghiên cứu của đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lã Thị Huyền, ThS Lê Thị Minh Phúc

và nhóm nanomedicine phòng Công nghệ tế bào động vật đã trực tiếp giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh, chị, các bạn đồng nghiệp tại phòng Công nghệ tế bào động vật đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình làm khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy giáo, cô giáo dạy khoa Sinh học, Trường Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã dạy bảo

và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè luôn động viên

và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày 26 tháng 9 năm 2012

Học viên

Đặng Thị Minh Lụa

RES Reticuloendothelial System

SEM Scanning Electron Microscopy

SLN Solid Lipid Nanoparticles

TEM Transmission Electron Microscopy

TPP Tripolyphosphate

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Các hệ vận chuyển thuốc kích thước nano 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Phân loại 3

1.2 Tổng quan về chitosan và nano chitosan 6

1.2.1 Cấu trúc của chitosan 6

1.2.2 Tính chất chitosan 7

1.2.3 Ứng dụng của chitosan 8

1.2.4 Nano chitosan 8

1.3 Curcumin 10

1.3.1.Cấu trúc hóa học của curcumin 10

1.3.2 Dược động học của curcumin 12

1.3.3 Tác dụng dược lý của curcumin 13

1.3.4 Hệ vận chuyển curcumin 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Hóa chất và thiết bị 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp tạo chitosan phân tử lượng thấp 21

2.2.2 Phương pháp tạo hạt nano chitosan 21

2.2.3 Phương pháp tạo phức hệ nano tích hợp curcumin 22

2.2.4 Phương pháp chụp kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope - TEM) 23

2.2.5 Phương pháp chụp kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope - SEM) 24

2.2.8 Phương pháp xác định hiệu xuất đóng gói 29

2.2.9 Khảo sát tính thấm của hạt nano vào tế bào động vật 29

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Kết quả tạo nano chitosan 31

3.2 Hình thể học của hạt nano tích hợp cucurmin 33

3.3 Kết quả đo size, phân bố size và thế zeta của hạt nano tích hợp curcumin 34

3.4 Hiệu suất đóng gói curcumin 36

3.5 Tính thấm của hạt nano vào tế bào HEK293 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

MỞ ĐẦU

Công nghệ nano đã tạo ra hàng loạt hệ vật chất kích thước từ vài nm tới hàng trăm nm để vận chuyển dược chất đến các bộ phận mong muốn trong cơ thể Các hệ vận chuyển thuốc có nhiều triển vọng là polymer-micelles, dendrimers, các hạt nano có nguồn gốc kim loại polymer, ceramic, protein, virus, và các hạt nano liposome Các dược chất hoặc các tác nhân chẩn đoán được tích hợp vào bên trong liên kết hóa học hoặc gắn vào bề mặt của các hạt nano này

Curcumin là hoạt chất được chiết xuất từ củ nghệ vàng Curcumin có nhiều hoạt tính sinh học và dược học quan trọng như tính kháng viêm, chống ung thư và kháng virus, cũng như các ứng dụng y học tiềm năng do tính độc thấp của chúng Trong những năm gần đây, curcumin đã được chứng minh là

có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào trên nhiều dòng tế bào ung thư in vitro

và đã được sử dụng để ngăn ngừa và điều trị nhiều bệnh ung thư in vivo Tuy

nhiên, do độ hòa tan kém, sinh khả dụng thấp và bị chuyển hóa nhanh chóng tại ruột và gan đã làm hạn chế các ứng dụng của curcumin Curcumin có thể được phát triển như một loại thuốc điều trị thông qua thay đổi công thức hoặc gắn lên hệ vận chuyển, cho phép nâng cao khả năng hấp thụ của tế bào Để vận chuyển curcumin đến các cơ quan đích, cần phải cải thiện độ hòa tan và sinh khả dụng của nó [1] Gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung tạo ra các hạt nano polyme dựa trên copolymer Pluronic® F-127 (PF)

Pluronic® F-127 (PF) là một copolymer không độc hại ưa nước, được

sử dụng rộng rãi như một tá dược để làm tăng tính ổn định và độ hòa tan của thuốc PF là một ABA copolymer bao gồm tiểu phần A polyoxyethylene (PEO), tiểu phần B polyoxypropylene (PPO) [2] Khi gia tăng nhiệt độ của

micelle tạo bởi copolymer có thể tích hợp được các thuốc ưa nước, kỵ nước

và kéo dài thời gian giải phóng thuốc [4,5] Tuy nhiên, việc sử dụng các micelle PF làm hệ vận chuyển thuốc đường dài là không thực tế, vì các hạt micelle có thể bị kết tụ và thay đổi cấu trúc khi tiếp xúc nồng độ và nhiệt độ khác nhau Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự ổn định của các hạt micelle có thể được cải thiện sau khi được phủ một lớp polymer với các vật liệu như PLGA, polyvinychloride hoặc chitosan [6]

Chitosan là một loại polymer carbohydrate tự nhiên, được tạo ra bằng cách deacetyl hóa đầu N- của chitin Chitosan có nhiều ưu điểm để làm vật mang trong các hệ thống vận chuyển thuốc kích cỡ nano Chitosan không độc,

có khả năng tương thích sinh học, phân hủy sinh học và đã được chứng minh

để kiểm soát sự giải phóng thuốc, protein hay các peptide Chitosan hòa tan tốt trong nước, tránh việc sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại, và không cần tinh sạch khi tạo ra các hạt nano [7]

Sự kết hợp polymer-micelles, phức hệ nano Chitosan-PF tích hợp curcumin tạo ra hệ vận chuyển curcumin đầy hứa hẹn Xuất phát từ những cơ

sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu tạo phức hệ nano tích hợp curcumin” với mục tiêu:

- Tạo được phức hệ nano tích hợp curcumin

- Kiểm tra, đánh giá phức hệ nano đã tạo được

- Khảo sát tính thấm của hạt nano vào tế bào động vật, kiểm tra độc tính trên

tế bào ung thư, từ đó định hướng ứng dụng trong điều trị ung thư

Công nghệ nano đã tạo ra hàng loạt hệ vật chất với kích thước từ vài

nm tới hàng trăm nm được sử dụng để vận chuyển dược chất đến các bộ phận mong muốn trong cơ thể với liều lượng thích hợp và theo đúng thời gian mong muốn, đảm bảo được 3 yếu tố góp phần tạo nên tính an toàn và hiệu quả của thuốc: đúng nơi, đúng lúc và đúng liều Các hệ vận chuyển thuốc có nhiều triển vọng là polymer-micelles, dendrimers, các hạt nano có nguồn gốc kim loại polymer, ceramic, protein, virus, và các hạt nano liposome Các dược chất hoặc các tác nhân chẩn đoán sẽ được đưa vào bên trong liên kết hoá học hoặc gắn vào bề mặt của các hạt nano này

• Hạt nano polyme (polymeric nanoparticles)

• Hạt nano lipid (lipid nanoparticles)

Hình 1.1 Một số hạt nano thường gặp

Ngoài ra, còn có những hạt nano có cấu trúc hỗn hợp giữa polyme, lipid và hợp chất vô cơ Các polymer có khả năng phân hủy sinh học và tương thích sinh học thường được sử dụng là polylactide, polyglycolide, poly(lactide-co-glycolide), poly(ε-caprolactone), poly(alkyl-cyanoacrylate), gelatine, chitosan… Các lipid thường được sử dụng là các lipid không độc với

cơ thể, có cấu tạo khá tương đồng với lipid sinh học như phospholipid, cholesterol, glyceride… và dẫn xuất của các lipid này Các hạt nano vô cơ thường được sử dụng trong chẩn đoán và điều trị như: hạt nano từ tính (magnetic nanoparticle), chấm lượng tử (quantum dots)

Phân loại theo cấu trúc, các hạt nano có thể chia thành 3 dạng:

• Hạt nano dạng màng bao: cấu tạo giống như túi (vesicle) hoặc nang (capsule), gồm một thành phần polymer hoặc một màng đơn hay màng kép lipid bao quanh một lõi có thể ở trạng thái rắn, rắn-lỏng hoặc lỏng

ưa nước hoặc ưa dầu

• Hạt nano cấu trúc dạng khung xốp (matrix): khung xốp polyme, lipid hoặc các hợp chất vô cơ phân bố đều bên trong hạt nano thường có dạng hình cầu

• Hạt nano cấu trúc dạng phức hợp (complex): thường là một phức hợp

đa thành phần giữa polymer hoặc lipid tích điện dương và hoạt chất tích điện âm (protein, peptide và acid nucleic) kết hợp với nhau nhờ tương tác điện tích

Phân loại theo tính chất bề mặt của hạt nano, dựa trên các thay đổi bề mặt hạt nano như: tính ưa dầu, hiệu ứng cản trở không gian và thành phần cấu tạo bề mặt nhằm hướng hạt nano đến đích tác dụng Các hạt nano này có thể được chia làm 3 loại:

• Hạt nano thụ động (pasive nanoparticles): bề mặt không có sự cản trở

về mặt không gian và thường ưa dầu Các hạt nano này dễ dàng bị opsonin hóa bởi các protein huyết tương trong tuần hoàn và sau đó bị bắt giữ bởi tế bào thực bào đơn nhân có các receptor bề mặt nhận biết đặc hiệu protein huyết tương, rồi di chuyển chủ yếu đến vùng gan, lách,

vì vậy các hạt nano này thường được gọi là hạt nano hướng gan lách

• Hạt nano Stealth® (Stealth® nanoparticles): bề mặt hạt nano được bao phủ bởi lớp polymer ưa nước và linh động như polyethylenglycol (PEG), polysaccharide, poloxamer, poloxamine Các hạt nano này thường liên kết cộng hóa trị với PEG trên bề mặt lên có thể gọi là hạt nano ghép PEG Nhờ thay đổi cấu trúc bề mặt, các hạt nano này hầu như không bị opsonin và bắt giữ thực bào Do vậy thường được áp dụng để điều trị bệnh ngoài vùng gan lách

• Hạt nano chủ động (active nanoparticles): Các hạt nano được gắn kết với các ligand trên bề mặt nhằm nhận biết đặc hiệu các receptor ở mô

và tế bào đích Các hạt nano này còn được gọi là hạt nano hướng đích [8]

Hạt nano thụ động Hạt nano Stealth® Hạt nano chủ động

Hình 1.2 Cấu trúc hạt nano 1.2 Tổng quan về chitosan và nano chitosan

1.2.1 Cấu trúc của chitosan

Chitosan là một loại polymer carbohydrate tự nhiên có thể tạo ra bằng cách deacetyl hoá chitin Chitosan có thể tìm thấy trong tự nhiên từ động vật giáp xác như tôm, cua Chitosan còn có thể được tìm thấy từ những loài vi sinh vật như nấm, nấm men

Hình 1.3 Công thức cấu tạo chitin và chitosan

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm (-NHCOCH3) ở vị trí C2 Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết α-(1-4)-glycoside [9], [10]

1.2.2 Tính chất chitosan

• Không độc, tính tương thích sinh học cao và có khả năng phân huỷ sinh học nên không gây dị ứng và không gây phản ứng phụ, không gây tác hại đến môi trường, cấu trúc ổn định

• Tan tốt trong dung dịch acid loãng (pH < 6,3) và kết tủa ở những giá trị

pH cao hơn, hóa tím trong dung dịch iod

• Có tính kháng khuẩn tốt

• Là hợp chất cao phân tử nên trọng lượng phân tử của nó giảm dần theo thời gian do phản ứng tự cắt mạch Nhưng khi trọng lượng phân tử giảm thì hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm không bị giảm đi

• Có khả năng hấp phụ cao đối với các kim loại nặng

• Ở pH < 6,3, chitosan có tính điện dương cao

• Trong phân tử chitosan có chứa nhóm –OH, -NHCOCH3 trong các mắt xích N-acetyl-D-glucosamine có nghĩa chúng vừa là alcol vừa là amine, vừa là amide Phản ứng hoá học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N-

• Mặt khác chitosan là những polymer mà các monomer được nối với nhau bởi các liên kết α-(1-4)-glycoside; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất như: acid, bazơ, tác nhân oxy hoá và các enzyme thuỷ phân [9], [10]

1.2.3 Ứng dụng của chitosan

Trong y tế, chitosan có tác dụng làm màng chữa bỏng, tá dược độn trong làm cốm, tá dược ổn định viên nén, thuốc trị viêm loét dạ dày tá tràng Hỗn hợp chitosan-collagen làm giảm cholesterol trong máu, giảm sự hấp thụ lipid Chitin được dùng làm da nhân tạo, thuốc diệt khuẩn, chỉ khâu trong phẫu thuật

Trong công nghiệp thực phẩm, chitosan làm phụ gia thực phẩm duy trì hương vị tự nhiên, ổn định màu, nhũ tương, làm dày cấu trúc, màng bảo quản rau quả tươi, làm trong nước quả ép, giữ màu sắc và hương vị tự nhiên của sản phẩm

Trong công nghiệp in, chitosan làm chất keo cảm quang, trong công nghiệp nhuộm làm tăng độ màu vải nhuộm Trong nông nghiệp, oligochitosan làm thuốc tăng trưởng thực vật và kích thích gây tạo kháng sinh thực vật, thuốc diệt nấm bệnh cho thực vật, gia tăng hệ số nhân và sinh khối tươi cho cây nuôi cấy mô

Trong khoa học kỹ thuật, chitosan làm dung dịch tăng độ khuyếch đại của kính hiển vi, xử lý nước thải công nghiệp và sinh hoạt: thu hồi ion kim loại, protein, phenol, thuốc trừ sâu, thuốc nhuộm…[9], [10]

1.2.4 Nano chitosan

Chitosan được sử dụng làm nguyên liệu điều chế hạt nano chitosan trong những năm gần đây vì những tính chất ưu việt của nó ở kích thước nano Chitosan là dạng deacetyl hóa từ chitin, có cấu trúc polysaccharide, được tìm thấy ở loài động vật giáp xác, côn trùng và một vài loại nấm Với nhiều tính năng như tính tương thích sinh học, phân hủy sinh học, bám dính màng và không độc hại, nó trở thành nguyên liệu cho nhiều ứng dụng dược sinh học Do đó, hạt nano chitosan trở thành hệ thống phân phối thuốc có tiềm năng lớn [11]

Nano chitosan do có kích thước siêu nhỏ (từ 10 đến 1000nm) nên dễ dàng đi qua màng tế bào, có thể đưa vào cơ thể qua nhiều đường khác nhau như dùng ngoài da, dùng qua đường miệng, qua mũi… Nano chitosan có diện tích và điện tích bề mặt cực lớn nên được ứng dụng nhiều trong sinh y học như mang thuốc, vaccine, vectơ chuyển gen, chống khuẩn, thuốc điều trị ung thư… Khi sử dụng nano chitosan làm chất dẫn thuốc, thuốc điều trị được bảo

vệ bởi những hạt nano chitosan khỏi sự phân huỷ sinh học Do kích thước rất nhỏ, những hạt này có tác dụng thấm sâu vào cơ thể, đưa thuốc đến đúng mục tiêu, nâng cao hiệu quả điều trị [12]

Trên thế giới, hầu hết những công trình nghiên cứu gần đây đều nhằm mục đích chế tạo ra những chất mang nano để dẫn truyền thuốc, protein, gen

và phát triển vectơ chitosan hướng đích thuốc trên những tế bào ung thư Một

số công trình tiêu biểu là điều chế hạt chitosan composite với acid polyacrylic

để điều khiển và kéo dài thời gian phóng thích thuốc; điều chế nano chitosan với cholesterol để dẫn thuốc đến mắt; biến tính với N-trimethyl mang protein làm hệ thống dẫn truyền đường mũi; tạo phức với acid deoxycholic để dẫn truyền gen [13] Ngoài ra, nano chitosan còn được nghiên cứu về khả năng diệt khuẩn [14], [15], ứng dụng trong thực phẩm chức năng [16], [17] Nhiều công trình cũng tiến hành nghiên cứu về kích cỡ, điện tích bề mặt hạt nano chitosan vì đây là những đặc tính rất quan trọng quyết định hiệu quả gây nhiễm gen, gắn kết các phân tử protein trên hạt nano [18] Ở nước ta, có nhóm của PGS TS Nguyễn Anh Dũng [19] và nhóm của TS Trần Đại Lâm [20] nghiên cứu về vấn đề này

1.3 Curcumin

Polyphenol đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì sức khỏe và phòng bệnh Polyphenol trong chế độ ăn uống của con người có nguồn gốc chủ yếu từ các loại rau, trái cây và các loại gia vị Đồ uống và đồ dùng như cà phê, trà xanh và trà đen, cũng như sô-cô-la, rượu vang đỏ, dầu ô liu, các loại hạt…,cũng giàu polyphenol Nhiều loại trong số đó được sử dụng như là thuốc cho phòng chống dịch bệnh, cũng như duy trì tuổi trẻ và tuổi thọ Gần đây các nhiên cứu chỉ ra rằng, các chất có nguồn gốc tự nhiên này có khả năng chống oxi hóa và chống viêm mạnh mẽ Ngoài ra, nhiều trong số chúng đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh hệ thống miễn dịch và hiện đang được nghiên cứu như các tác nhân bảo vệ hóa học, thần kinh, tim mạch, gan [21], [22]

Đặc biệt, củ nghệ, một ví dụ điển hình giàu polyphenol, đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ trong y học cổ truyền Ấn Độ và Y học cổ truyền Trung Quốc [22] Hơn nữa củ nghệ cũng được sử dụng như một phụ gia thực phẩm và chất bảo quản Curcumin là thành phần polyphenol chính của củ nghệ được bán rộng rãi trên toàn thế giới Củ nghệ được biết đến ở Châu Âu vào thế kỷ 13 bởi Marco Polo và lần đầu tiên được công bố trên tạp chí Lancet năm 1937 Curcumin cũng mới được nghiên cứu và thử nghiệm tiền lâm sàng giai đoạn I, II, III trong 10-15 năm qua

1.3.1.Cấu trúc hóa học của curcumin

Màu vàng của nghệ chủ yếu là do sự hiện diện của curcuminoids polyphenolic, chiếm khoảng 3% đến 5% của hầu hết các chế phẩm nghệ Các chiết xuất từ cồn của củ nghệ chủ yếu có chứa ba loại curcuminoids, cụ thể là chất curcumin (cũng được gọi là curcumin I hoặc diferuloylmethane), demethoxycurcumin (curcumin II), và bisdemethoxycurcumin (curcumin III) (hình 1.4) Curcumin lần đầu tiên được chiết xuất bởi Vogel và Pelletier vào

năm 1815 và cấu trúc của nó như diferuloylmethane được thiết lập vào năm

1910 Cấu trúc hóa học của nó đã được khẳng định trong năm 1973 bởi Roughley và Whiting [23]

Hình 1.4 Cấu trúc của 3 loại curcuminoids chính trong củ nghệ

Curcumin được sử dụng nhiều nhất không phải là curcumin tinh khiết,

mà là một hỗn hợp của curcumin (khoảng 77%), desmethoxy curcumin (khoảng 18%) và bisdesmethoxy curcumin (khoảng 5%) [24] Trong số hơn

120 loài Curcuma được tìm thấy, chỉ có những loài C.aromatica,

C.phaecaulis, C.zedoaria, C.xanthorrhiza, C.Mangga chứa hợp chất curcuminoid Trong số các curcuminoids, curcumin là chất hóa học chính và

C.Longa là nguồn thu chính của curcumin [22]

Curcumin tên hóa học: (E, E) 1,7bis (4hydroxy3methoxyphenyl) 1,6-heptadiene-3, Dione) bis-α, β-không bão hòa β-diketone Nó có trọng lượng phân tử 368,38; điểm nóng chảy 179-183° C; và công thức hóa học

-C21H20O6 Theo điều kiện sinh lý, chất curcumin có thể tồn tại trong cả hai dạng enol và bis-keto, cùng tồn tại trong trạng thái cân bằng

Hình 1.5 Dạng Keto-enol của curcumin (Strimpakos and Sharma, 2008)

Curcumin dễ dàng hòa tan trong dimethylsulfoxide (DMSO), ethanol, acetone, nhưng nó ít hòa tan trong nước Trong các dung dịch có tính axit và trung tính, cũng như trong trạng thái rắn, dạng keto chiếm ưu thế, và chất curcumin hoạt động như thể cho các nguyên tử H+ Ngược lại, trong điều kiện kiềm (≥ pH 8), dạng enolic chiếm ưu thế, và phần phenolic của phân tử đóng vai trò chủ yếu là thể cho electron [25]

1.3.2 Dược động học của curcumin

Nghiên cứu sự hấp thu, phân bố, chuyển hóa và bài tiết của curcumin trong những năm gần đây cho thấy curcumin trải qua một quá trình chuyển hóa nhanh chóng, và nó được cho rằng là nguyên nhân chính gây ra sinh khả dụng thấp trong hệ tuần hoàn Curcumin dùng đường uống với liều 1000 mg/kg chuột, kết quả khoảng 75% được bài tiết trong phân và số lượng không đáng kể được phát hiện trong nước tiểu [26] Ravindranath và cs đã công bố các liều dùng đường uống phần lớn được bài tiết trong phân, trong khi khoảng 35% được bài tiết ở dạng không thay đổi và 65% được đào thải dưới dạng các chất chuyển hóa của curcumin [27] Sau khi tiêm tĩnh mạch ở chuột, số lượng lớn các chất này và các chất chyển hóa của nó được bài tiết qua mật, chủ yếu

là glucoronides tetrahydrocurcumin và hexahydrocurcumin (hình 1.6) [28,29]

Hình 1.6 Cấu trúc một số chất chuyển hóa quan trọng của curcumin

Sự phối hợp của curcumin đường uống với piperine, một alkaloid được tìm thấy trong hạt tiêu đen (piper nigrum) và hạt tiêu dài (piper loanga), để tăng nồng độ curcumin trong huyết thanh ở loài gặm nhấm Trong một nghiên cứu sử dụng curcumin đường uống liều cao ở chuột (2000 mg/kg), các nhà khoa học phát hiện ra rằng chính sự phối hợp cùng piperine làm tăng sinh khả dụng lên 154% [30] Cơ chế của sự kết hợp này đến nay vẫn chưa được làm

rõ

1.3.3 Tác dụng dược lý của curcumin

Những bằng chứng tích lũy trong những năm qua đã chỉ ra rằng, nhiều loại thuốc kháng viêm như steroids và các NSAISs có liên quan đến nhiều tác dụng phụ, các biến chứng tim mạch hầu hết gây ra bởi việc sử dụng thuốc coxib Do đó các tác nhân kháng viêm cần có độ an toàn và hiệu quả cao hơn

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng curcumin có tác dụng bảo vệ gan và thận, ngăn chặn huyết khối, nhồi máu cơ tim Ngoài ra, hoạt tính chống oxi hóa mạnh mẽ, hoạt động kháng khuẩn, chống ung thư và kháng viêm cũng được công bố

Cơ chế kháng viêm của curcumin bao gồm:

• Ức chế sự hoạt hóa của yếu tố phiên mã NF-kB, quy định sự biểu hiện sản phẩm của gen tiền viêm

• Giảm sự biểu hiện của cyclooxygenase-2 (COX-2), một loại enzyme liên kết với hầu hết các loại viêm

• Giảm độ hoạt động và mức độ protein trong cảm ứng sinh tổng hợp enzyme nitric oxide (iNOS) thông qua việc giảm sự biểu hiện của gen iNOS

• Ức chế chuyển hóa acid arachidonic nhờ lipoxygenase và loại bỏ các gốc tự do tạo ra trong con đường này

• Giảm sự biểu hiện của các phân tử bám dính bề mặt tế bào khác nhau

đã được liên kết với viêm

• Giảm sự biểu hiện của các cytokine viêm khác nhau, bao gồm cả TNF, IL-1, IL-6, IL-8 và chemokines

• Curcumin là một chất chống oxi hóa mạnh, điều này góp phần vào hoạt động kháng viêm của nó

• Các nghiên cứu chỉ ra rằng các enzyme như COX-2 và iNOS biểu hiện quá mức có liên quan trong chất sinh ung thư của nhiều khối u Mặc dù

nó không có ảnh hưởng trực tiếp trên tế bào của người, nhưng cần lưu ý rằng hoạt tính kháng khuẩn của curcumin có khả năng ngăn chặn hóa

học bởi vì ngày càng nhiều tác nhân gây bệnh được liên kết trực tiếp với ung thư ở người [31]

1.3.4 Hệ vận chuyển curcumin

Trong nghiên cứu nhằm nâng cao sinh khả dụng của curcumin, bước đầu tiên là cải thiện tính hòa tan của nó Với mục đích trên, nhiều phương pháp truyền thống khác nhau dựa trên các thông số vật lý như nhiệt độ, pH, và phức hợp với các ion kim loại, polymer hoặc huyết thanh đã được áp dụng để làm tăng độ hòa tan của curcumin Ngoài ra, các biến đổi hóa học của curcumin cũng được tiến hành để tạo ra các dẫn xuất của curcumin hoặc tương tự Kurien và cs cho rằng độ hòa tan của curcumin và nghệ có thể tăng lên lần lượt là 12 lần và 3 lần bằng cách sử dụng nhiệt mà không làm phân hủy curcumin [32] Đối với vận chuyển thuốc trong cơ thể, nước là phương tiện vận chuyển an toàn và đơn giản nhất, do đó xem xét khả năng hòa tan của curcumin bằng nhiệt trong nghiên cứu in vivo và in vitro là đáng quan tâm [32] Zebib và cs đã chuẩn bị phức hợp của curcumin với ion kim loại ( Zn2+,

Cu2+, Mg2+, Se2+ ) đã được biết đến là tăng độ hòa tan và tăng tiềm năng chống ung thư [33] Phức hợp cucumin với huyết thanh albumin làm tăng đáng kể độ hòa tan của curcumin và cùng thời điểm đó làm giảm hiệu ứng độc hại của amphoterecin B bằng cách trì hoãn sự phá hủy màng hồng cầu [34] Qui và cs đã công bố dẫn xuất curcumin 4-arylidence được tìm thấy là hòa tan hơn và tiềm năng chống ung thư cao hơn [35] Safavy và cs đã tiếp hợp curcumin hòa tan trong nước với 2 phân tử PEG khác nhau Phân tử tiếp hợp thể hiện sự tăng tính độc tế bào so với curcumin ở dạng đơn lẻ [36]

Thuyết vận chuyển khác nhau đã được đề xuất trong những năm gần đây như là phương tiện để cải thiện tính sinh khả dụng của curcumin Tính

- Hệ vận chuyển cấy ghép trùng hợp của curcumin: Bansal và cs chuẩn bị curcumin trong poly-(ε-caprolactone) nhằm mục đích cấy ghép dưới da và đánh giá các mô cấy ở chuột Nồng độ tối đa của curcumin trong gan được phát hiện vào ngày thứ tư sau khi cấy ghép và duy trì trong 7 ngày Nghiên cứu khảng định tiềm năng của phương pháp cấy ghép polymer để tránh dùng đường uống giữ sự bền vững của curcumin

- Mixen: curcumin gắn mixen poly(ethyleneoxide)-b-poly(ε-caprolactone) có thể tiêm được nhằm kiểm soát sự vận chuyển của curcumin được thực hiện bởi Ma và cs đã chứng minh rằng mixen được đóng gói curcumin giữ lại độc tính của nó trong cả khối u ác tính chuột và u vỏ tế bào lympho người [37] Curcumin gắn mixen poly(D,L-lactide-co-glycolide)-b-poly(ethylene glycol)-b-poly(DL-lactide-co-glycolide; PLGA-PEG-PLGA) thực hiện bởi Song và cs cho thấy sự cải thiện ở vùng dưới của đường cong (AUC) và t1/2 trong cơ thể Hơn nữa, mixen giảm sự hấp thu curcumin bởi gan và lá lách, đồng thời tăng

sự phân bố của curcumin trong phổi và não [38]

- Hệ vận chuyển nano: công nghệ nano và thuốc nano mở ra tiềm năng cho sự phát triển hệ vận chuyển kích thước nano của curcumin Shaikh và cs phát triển các hạt nano đóng gói curcumin bằng kỹ thuật emulsion Dược động học trong cơ thể cho thấy các hạt nano chứa curcumin đạt được sự gia tăng gấp 9 lần tính sinh khả dụng đường uống so với curcumin kết hợp với piperine như

là sự tăng cường hấp thụ [39] Tsai và cs đã tiến hành tối ưu hóa công thức nano polylactic-co-glycolic acid (PLGA) của curcumin, kết quả là tăng hơn

22 lần tính sinh khả dụng đường uống ở chuột so với curcumin thông thường [40] Curcumin gắn hạt nano dextran sulphate-chitosan cho thấy ưu tiên tiêu diệt tế bào ung thư so với tế bào thường, cho thấy tiềm năng trong điều trị hướng đích [41]

Một hệ vận chuyển rất có triển vọng xuất hiện là “nanocurcumin”, trùng hợp hạt nano đóng gói curcumin, dễ dàng phân tán trong dung dịch và

có tiềm năng chống ung thư trong các nghiên cứu tiền lâm sàn ở cơ thể sống Nanocurcumin giữ lại được các đặc trưng vốn có của curcumin, ức chế sự hoạt hóa của yếu tố phiên mã NF-kB và giảm mức độ ổn định của các cytokine tiền viêm như là ILs và TNF-α [42] Nanocurcumin được phát triển bởi Bhawana và cs và thực hiện bằng kỹ thuật xay ướt, trong phạm vi kích thước 2-40 nm thể hiện tiềm năng kháng khuẩn mạnh mẽ và tăng cường hoạt tính chống ung thư [43]

Wu và cs phát triển nanogel để vận chuyển curcumin trong tế bào với mục đích điều trị [44] Dạng lai kết hợp hạt nano Au/Ag, lớp gel polystyrene, gel polyethylene có tiềm năng gây độc mạnh chống lại tế bào B16F10 bằng cách kết hợp với hóa trị liệu

Một số nhóm nghiên cứu đã đề xuất tạo phức hợp phosholipid như là cách cải thiện vận chuyển curcumine Phức hợp của curcumin với phosphatidylcholine có hiệu quả tăng cường tương thích sinh học, dược động học và tăng hoạt tính bảo vệ gan so với pha trộn vật lý của curcumin và phosphatidylcholine [45] Phức hợp curcumin-phospholipid dùng đường uống có nồng độ trong huyết thanh cao hơn so với curcumin không được phức hợp Hơn nữa, phức hợp duy trì hiệu quả nồng độ curcumin trong khoảng thời gian dài Tuy nhiên, hàm lượng của curcumin trong phức hợp được tìm thấy là giới hạn trong khoảng 17 và 32 % (w/w), thấp hơn nhiều

curcumin-so với hàm lượng có thể đạt được bằng cách đóng gói lipocurcumin-some của curcumin

Curcumin được đóng gói liposome cải thiện sự vận chuyển của curcumin trong tĩnh mạch đến mô đại thực bào, đặc biệt là xương tủy và đại

của curcumin trong SLN ở chuột cho thấy cải thiện đáng kể so với curcumin hòa tan [47] Để tăng cường hơn nữa tiềm năng chống ung thư của curcumin, trung gian vận chuyển SLN tích hợp curcumin được phát triển và chứng minh

ưu thế của nó trong tế bào ung thư vú [48] SLN phát triển bởi Yadav và cs được đánh giá trong bệnh viêm ruột ở chuột cho thấy tăng cường hoạt tính chống hình thành mạch và chống viêm [49] Có lẽ một trong những hệ vận chuyển curcumin được nghiên cứu nhiều nhất là liposome Liposome cũng được thiết lập như hệ vận chuyển có thể kết hợp được với các thuốc kém hòa tan [50] Curcumin được mong đợi là thích ứng bản thân nó bên trong cấu tạo

kỵ nước của liposome, dẫn đến hiệu suất tạo thuốc cao hơn [51] Curcumin liposome cũng được công bố là có độ ổn định cao hơn curcumin tự do trong PBS, trong máu, huyết tương và môi trường RPMI-1640 chứa 10% huyết thanh bò [52] Li và cs đã phát triển hệ vận chuyển liposome của curcumin nhằm mục đích tiêm tĩnh mạch Curcumin liposome chặn gắn kết NF-kB và giảm sự biểu hiện của NF-kB, bao gồm cả COX-2 và IL-8 được cho là liên quan đến sự tăng trưởng và xâm lấn của khối u Hoạt tính của curcumin liposome bằng hoặc tốt hơn so với curcumin tự do ở cùng nồng độ g/mol Hiệu quả kháng khối u và chống hình thành mạch (anti angiogenesis) được ngăn chặn trong cơ thể và dựa trên kết quả của các tác giả đã đề xuất rằng hệ vận chuyển curcumin liposome cung cấp nhân tố căn bản cho điều trị bênh ung thư biểu mô tuyến tụy [53] Li và cs đã chỉ ra rằng curcumin liposome ức chế tăng trưởng dựa vào liều lượng và apoptosis trong hai dòng tế bào ung thư đại trực tràng ở người (tế bào LoVo và Colo205) và kết hợp hiệu quả với oxaliphatin, một tiêu chuẩn hóa trị liệu cho các bệnh ác tính Trong nghiên cứu invivo liposome curcumin ức chế đáng kể sự phát triển của khối u trong

mô tế bào colo205 và LoVo ở chuột [54] Thangapazham và cs phát triển hệ vận chuyển curcumin liposome trong đó liposome được phủ một lớp kháng thể đặc hiệu kháng nguyên tiền liệt tuyến để hướng đích Sự ưu việt của hệ

thống như vậy được đánh giá trong 2 dòng tế bào ung thư tiền liệt tuyến ở người Liposome phủ kháng thể tăng gấp 10 lần hoạt tính chống tăng sinh trong các dòng tế bào ung thư tiền liệt tuyến (LNCaP và C4-2B) so với curcumin tự do Nó cũng được quan sát thấy rằng dòng tế bào LNCaP tương đối nhạy cảm với curcumin liposome hơn tế bào C4-2B [55] Wang và cs công bố công thức curcumin liposome có thể ức chế tăng trưởng của tế bào ung thư biểu mô đầu và cổ (HNSCC) trong nghiên cứu invitro dựa vào công thức và liều lượng có thể ngăn kích hoạt NF-kB mà không ảnh hưởng đến sự biểu hiện của pAKT Sự biểu hiện của chu trình D1, COX-2, MMP-9, Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1L và Mcl-1S đã được giảm Khối u chuột nude bị chặn sau 3,5 tuần điều trị với curcumin liposome và tính không độc của curcumin liposome cũng được xác nhận Các tác giả suy đoán rằng curcumin liposome là tác nhân điều trị không độc cho HNSCC [56] Takahashi và cs phát triển hệ vận chuyển liposome áp dụng cho đường uống của curcumin, kết hợp lên đến 68% curcumin, làm tốc độ hấp thụ nhanh hơn và tốt hơn sau khi uống ở chuột Những kết quả này chỉ ra rằng sự đóng gói liposome tăng cường sự hấp thụ tiêu hóa của curcumin [57] Công thức liposome dựa trên mạch của phân

tử curcumin bis-demethoxy cho thấy hoạt tính bảo vệ gan tốt hơn so với dạng

tự do của nó [58] Narayana và cs đề xuất phương pháp thú vị tiếp cận điều trị ung thư tiền liệt tuyến Sự kết hợp của các dạng liposome của curcumin giảm đáng kể ung thư tiền liệt tuyến trong cơ thể Nghiên cứu invitro cho thấy curcumin kết hợp với resveratrol ức chế hiệu quả sự tăng trưởng tế bào và làm chết tế bào Những phát hiện cho thấy rằng sự kết hợp liposome và các dược chất có thể làm giảm tỷ lệ mắc ung thư tuyến tiền liệt [59] Mourtas và cs đề xuất thuyết curcumin gắn nanoliposome có ái lực rất cao với peptide amyloid-β-42 như là vectors vận chuyển mục tiêu trong điều trị bệnh Alzheimer [60]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Hóa chất và thiết bị

Hóa chất

Acid Acetic (CH3COOH) Sodium Nitrite (NaNO2) Sodium hydroxide (NaOH) 4N Acetone

Sodium tripolyphosphate (TPP): Na5P3O10

Pluronic F-127(PF) Curcumin

Nước khử ion

Thiết bị

Cân phân tích Máy chuẩn pH Máy khuấy từ Máy đông khô Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Kính hiển vi điện tử quét (SEM)

Kính hiển vi huỳnh quang Máy đo quang

Máy đo size và thế zeta

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tạo chitosan phân tử lượng thấp

Chitosan phân tử lượng thấp được tạo nên từ chitosan phân tử lượng trung bình theo phương pháp của Moghaddam và cs [61], gồm các bước sau:

• Hòa tan 1 g chitosan phân tử lượng trung bình (400 kDa) trong 50 ml dung dịch acid acetic 6%, để thu được dung dịch chitosan 2% trong acid acetic

• Bổ sung thêm 10ml dung dịch NaNO2 (7mg/ml), khuấy trong 1h ở nhiệt

độ phòng

• Chuẩn về pH=9,0 bằng dung dịch NaOH 4N

• Ly tâm 5000 vòng trong 10 phút, loại dịch, thu phần cặn màu trắng vàng

• Rửa cặn 3 lần với acetone, hòa tan cặn trong một lượng nhỏ acid acetic 0,1N

• Làm sạch sản phẩm bằng cách thẩm tích với nước khử ion, kích thước lỗ màng thẩm tích 12 kDa, thời gian thẩm tích 24h, sau 4-6 h thay nước 1 lần

• Sản phẩm sau thẩm tích được đông khô trong thời gian khoảng 10-12h Sản phẩm thu được có màu vàng là chitosan phân tử lượng thấp, được bảo quản ở 4oC cho đến khi sử dụng

2.2.2 Phương pháp tạo hạt nano chitosan

Chitosan là một polysaccharide polycationic, dạng thẳng, thu được bởi deacetyl hóa đầu N của chitin Với sự xuất hiện của các nhóm amin tự do trong cấu trúc dạng thẳng của chúng, chitosan có bản chất cationic và có thể tương tác với nhiều chất tạo liên kết ngang để hình thành nên các hạt nano Nhược điểm của việc sử dụng các chất tạo liên kết ngang có bản chất hóa học