khảo sát quy trình thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học từ việc nuôi cấy tế bào hai

burmanii Vahl Nội dung nghiên cứu: thiết lập quy trình vi nhân giống 2 loài Drosera được thu hái ở Việt Nam; sàng lọc, thu nhận, xác định một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-o0o -

QUÁCH NGƠ DIỄM PHƯƠNG

KHẢO SÁT QUY TRÌNH THU NHẬN CÁC HỢP CHẤT

CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VIỆC NUƠI CẤY TẾ

BÀO HAI LỒI DROSERA

Chuyên ngành: Sinh hĩa

Mã số: 62 42 30 15

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Tp Hồ Chí Minh, năm 2011

Công trình được hoàn thành tại: Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, TP.HCM

Người hướng dẫn khoa học: NGƯT PGS TS BÙI VĂN LỆ

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp tại

vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

(ghi tên các thư viện nộp luận án)

MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của luận án: Drosera có giá trị dược tính trong điều

trị các căn bệnh như: lao, ung thư, HIV, tim mạch, ho gà, hen

suyễn…kể cả những căn bệnh do đột biến [Samaj J., 1999] Drosera

trong tự nhiên tương đối hiếm, là loài có nguy cơ tuyệt chủng, nhiều quốc gia đã ban hành luật để bảo vệ chúng [Blehova A, 1995],

[Bonnet M, 1984] Ở Việt Nam, có 3 loài Drosera [Phạm Hoàng Hộ,

1995]; chưa loài nào được nghiên cứu về thành phần hóa học, dược tính [Đỗ Tất Lợi] Đề tài đã ra đời với nhu cầu thiết yếu của nó

Mục tiêu đề tài: Bảo tồn nguồn cây Drosera vốn khan hiếm; khai

thác tiềm năng dược tính 1 loài cây hoang dại ở Việt Nam; đáp ứng nhu cầu thực vật cũng như về dược chất 1 cách chủ động

Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu:

Đối tượng: cây bắt ruồi D indica L và D burmanii Vahl

Nội dung nghiên cứu: thiết lập quy trình vi nhân giống 2 loài

Drosera được thu hái ở Việt Nam; sàng lọc, thu nhận, xác định một

số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn nguyên liệu in vitro của 2 loài Drosera này; khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng

năng suất thu nhận hoạt chất có tiềm năng trên hệ thống nuôi cấy tế

bào in vitro Drosera (cây con, dịch huyền phù): lựa chọn điều kiện

nuôi cấy thích hợp; bổ sung tiền chất; sử dụng những nhân tố cảm ứng con đường sinh tổng hợp (elicitor, stress)

Bố cục của luận án: luận án gồm 150 trang, bao gồm: Mở đầu 2

trang, Tổng quan tài liệu 32 trang, Vật liệu phương pháp 28 trang, Kết thào luận 82 trang, Kết luận và đề nghị 3 trang, với 54 bảng, 76 hình Tài liệu tham khảo gồm 11 tài liệu tiếng Việt, 108 tài liệu tiếng

Anh, 11 tài liệu từ internet

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Dịch chiết từ Drosera được chứng minh là có nhiều dược tính và

những hoạt tính có giá trị ứng dụng khác [Samaj J., 1999] Cho đến

nay, Drosera vẫn còn đang là đối tượng thu hút các nhà khoa học về

giá trị trị liệu của chúng Tháng 5/2009, V.Madhavan và các cộng sự (2009) vừa chứng minh được cả dịch chiết alcohol và dịch chiết nước

của D burmanii đều có khả năng chống thụ thai trên chuột Tháng 10/2009, Hema B và cộng sự (2009) đã khẳng định có thể sử dụng D

burmanii để điều chế thuốc điều trị chứng co giật, động kinh với giá

thành rẻ mà hạn chế tác dụng phụ hơn so với thuốc tổng hợp Do nhu

cầu của Drosera trên thế giới ngày càng tăng cao mà cây trong tự

nhiên lại đang trong tình trạng bị đe dọa tuyệt chủng nên nhiều công

trình trên thế giới đã tập trung nghiên cứu nuôi cấy in vitro cũng như thu nhận dược chất bằng công nghệ nuôi cấy tế bào Drosera và đã

thu được một số kết quả khả quan [Hook L.(2001), Nahalka J.(1996), Putalun W.(2010), Krolicka A.(2008)] Thế nhưng cho đến nay chưa thấy tài liệu nào công bố những nghiên cứu trên đối tượng này ở Việt Nam

2 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP

Nguyên liệu nuôi cấy: trái chứa hạt của 2 loài Drosera được thu thập

từ khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu – Phước Bửu (tỉnh Bà Rịa–Vũng Tàu) Việc định danh mẫu thu hái được tiến hành bởi BM Thực vật học (nay là BM Sinh thái và Sinh học tiến hóa) của Trường

nghiệm quy trình nuôi cấy hai bước trong việc cải thiện hệ số nhân chồi [Christoph W.,2009]; tạo rễ và phát triển cây con hoàn chỉnh Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu tạo chồi, số chồi/ 1 mẫu, chiều cao chồi

2.2 Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học

từ nguồn nguyên liệu in vitro của Drosera

Các bước tiến hành sàng lọc để cô lập hoạt chất từ nguồn nguyên liệu

in vitro của hai loài Drosera

Xử lý mẫu: cây trưởng thành in vitro sau 8-10 tuần nuôi cấy của hai loài Drosera được rửa sạch, phơi hay sấy khô ở nhiệt độ 500C đến trọng lượng không đổi, xay nhuyễn tạo bột cây khô

Điều chế các loại cao chiết: bột cây khô được chiết kiệt với lần

lượt 4 loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethyl acetate, ethanol bằng phương pháp ngâm dầm trong 48 giờ, ở nhiệt độ thường [Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007]

Sàng lọc các cao chiết có hoạt tính sinh học mạnh: tiến hành khảo

sát và chọn phân đoạn cao có hoạt tính sinh học cao nhất ở mỗi định hướng: (1)tìm hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh bằng thử nghiệm năng lực khử của các phân đoạn cao có độ phân cực khác nhau bằng phương pháp Yen và Duh (1993); (2)tìm hợp chất có khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư ruột kết DLD-1 của các phân đoạn cao có độ phân cực khác nhau bằng phương pháp Sulforhodamine B (SRB) [Rubinstein L.V.,1990]

Cô lập hoạt chất từ các phân đoạn đã sàng lọc: sắc ký cột silica

gel, sắc ký lọc gel Sephadex LH-20, sắc ký lớp mỏng điều chế với bảng sắc ký tráng sẵn

Kiểm tra hoạt tính sinh học của hợp chất cô lập: (1) sử dụng

phương pháp TBA (thiobarbituric acid) và phương pháp FTC (ferric thyocyante) để kiểm tra hoạt tính kháng oxy hóa [Zin Z M.,2002];

(2) khảo sát ảnh hưởng của hoạt chất lên sự tăng sinh và phát triển tế bào ung thư ruột kết DLD-1 bằng phương pháp đếm tế bào trên máy Coulter counter và ảnh hưởng của hoạt chất lên sự sinh tổng hợp protein và biểu hiện của protein mTOR (mammalian target of rapamycin) [Sarbassov D D.,2005], một protein kinase thiết yếu cho

sự tăng sinh và phát triển tế bào động vật, bằng phương pháp điện di miễn dịch Western Blot

2.2.1 Xác định cấu trúc và hàm lượng hoạt chất

Xác định cấu trúc: kết hợp các phương pháp hóa lý hiện đại như

khối phổ MS, cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D (1H-, 13C-, NMR, COSY, HMQC, HMBC)

DEPT-Xác định hàm lượng: phổ tử ngoại (UV), sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 2.2.2 Lựa chọn hợp chất có tiềm năng làm hợp chất đích cho

mục tiêu nghiên cứu tăng năng suất thu nhận trên đối tượng này

Các hợp chất có hoạt tính sinh học sau khi cô lập và xác định cấu

trúc, được xác định hàm lượng trong hai loài Drosera nuôi cấy in

vitro bằng phương pháp HPLC

2.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất

thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh

Khảo sát vòng đời in vitro để xác định các giai đoạn tăng trưởng ở Drosera: theo dõi và ghi nhận thời gian của từng giai đoạn ở mỗi cá

thể trong một quần thể có cùng điều kiện nuôi cấy và trên cùng thành phần môi trường như đã cố định từ khi hạt được gieo trong điều kiện

nuôi cấy in vitro cho đến khi cây bắt đầu có phát hoa từ đỉnh sinh

trưởn, nhằm tìm thời điểm thích hợp cho việc nuôi cấy cũng như tác động tăng sinh hoạt chất

Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất của cây con: lựa chọn các điều kiện nuôi cấy như hàm

lượng khoáng đa lượng, ánh sáng, pH môi trường, mật độ cá thể nuôi cấy ban đầu

Khảo sát một số tác nhân tác động lên sự tích lũy hoạt chất của cây con: chất điều hòa tăng trưởng NAA, bổ sung tiền chất

(phenyalanine, tyrosine), sử dụng chất cảm ứng (acid salicylic, cao nấm men), gây stress nitrogen

Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh của các tác nhân đã khảo sát

2.4 Khảo sát ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào

2.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào

Tạo mô sẹo: tìm nền khoáng và nồng độ đường thích hợp cho sự

sống của lớp mỏng tế bào, trên nền khoáng và nồng độ đường đó tìm

sự kết hợp 3 loại hormone tăng trưởng 2,4-D, NAA, KN thích hợp nhất

Tạo dịch huyền phù tế bào từ mô sẹo: 20-30 mẫu mô sẹo tạo thành

được chuyển vào một erlen có thể tích 125ml chứa 15ml môi trường lỏng có cùng thành phần với môi trường tạo sẹo trước đó, erlen được đặt trong điều kiện nuôi đã cố định, trên máy lắc 125 vòng/phút

Thử nghiệm tạo dịch huyền phù tế bào trực tiếp từ lớp mỏng tế bào: thử nghiệm nuôi lỏng lắc 20-30 mẫu lớp mỏng tế bào thân và rễ

trong điều kiện nuôi tương tự như tạo dịch huyền phù từ mô sẹo

Kiểm tra khả năng sống của tế bào trong các dịch huyền phù tế bào tạo thành bằng phương pháp nhuộm TTC: tế bào chết không có

màu trong khi tế bào sống có màu hồng do hoạt động hô hấp của tế

bào tạo ra những hợp chất có khả năng kết hợp với triphenyltetrazolium chloride (TTC) tạo phức chất formanzan màu hồng [Victor M., 2006]

2,3,5-Lựa chọn dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ loại mô có khả năng tích lũy hoạt chất cao hơn làm nguồn vật liệu đầu cho các thí nghiệm tăng sinh: xác định hàm lượng plumbagin trong mô lá, mô rễ

thu hoạch từ cùng các cá thể cây in vitro có độ tuổi 8-10 tuần

2.4.2 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt

chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào

Khảo sát đường cong tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào có mật độ tế bào nuôi ban đầu khác nhau: kết hợp khảo sát đường

cong tăng trưởng và mật độ nuôi cấy tế bào ban đầu thích hợp Theo dõi và ghi nhận thời gian của mỗi pha trong dịch huyền phù tế bào bằng phương pháp đếm tế bào trong buồng đếm có khả năng giữ lượng thể tích cố định dịch huyền phù tế bào trên một diện tích đã biết để xác định mật độ tế bào nuôi cấy cứ 4 ngày một lần

Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất: ánh sáng, tốc độ lắc

Khảo sát một số tác nhân tác động lên sự tích lũy hoạt chất của dịch huyền phù: chất điều hòa tăng trưởng 2,4-D; bổ sung tiền chất

(phenylalanine, tyrosine), sử dụng chất cảm ứng (acid salicylic) Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ

thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào Drosera của các tác nhân đã

khảo sát bằng phương pháp HPLC

2.5 Xử lý thống kê

Số liệu thu được từ kết quả của các thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS phiên bản 16.0 với Duncan, Dunnett test, độ tin cậy 95%

3 KẾT QUẢ -THẢO LUẬN

3.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu

khởi đầu

Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy: quy trình khử trùng có bước cải

tiến hơn là xử lý hạt với giberelin 1% trong 24 giờ, giúp rút ngắn rất

nhiều thời gian nẩy mầm thông thường của hạt Drosera (từ 21 ngày

xuống còn 15 ngày), với tỷ lệ hạt vô trùng và nẩy mầm đạt 93-95%

Nhân giống bằng chồi bên: nồng độ thích hợp để nhân chồi bên từ

đốt thân D indica là (0,5 mg/l), và D burmanii là (2mg/l)

Nhân giống bằng tạo chồi bất định từ lớp mỏng tế bào: các bộ phận

lóng thân, lá, cuống lá, cuống hoa của cây con Drosera đều được thử

nghiệm Tuy nhiên, sau 5 tuần nuôi cấy, chỉ có lớp tế bào ở đoạn ngọn phát hoa là có khả năng tái sinh chồi bất định dưới tác động của

BA Trong đó, nồng độ thích hợp để tạo chồi bất định từ lớp tế bào

của đoạn ngọn phát hoa của D indica là (1 mg/l), và D burmanii là (2mg/l) Kết quả này được xem là 1 thành công trong việc nhân nhanh giống cho Drosera, đặc biệt ở D burmanii: cá thể có 1 đốt

thân rất ngắn nhưng có thể có từ 2-4 phát hoa dài; khi phát hoa được cắt đi, lập tức phát hoa khác sẽ được tái sinh và nếu cắt liên tục phát hoa non, cây có thể kéo dài đời sống hơn bình thường

Thử nghiệm quy trình nuôi cấy hai bước trong việc cải thiện khả năng nhân chồi và phát triển thành cây con hoàn chỉnh: đốt thân

hay chồi con được tiến hành nhân giống theo hai bước: (1) nuôi cấy trên môi trường MS (rắn, lỏng) với nồng độ BA thích hợp đã xác

định (0,5mg/l cho D indica; 2mg/l cho D burmanii) nhưng chỉ trong

2 tuần; (2) sau đó các mẫu cấy đã được cảm ứng nhân chồi bên được lập tức chuyển sang môi trường MS (rắn, lỏng) bổ sung đầy đủ các thành phần ngoại trừ BA trong 3 tuần tiếp theo Sau 5 tuần nuôi cấy,

so sánh với mẫu đối chứng không áp dụng quy trình nuôi cấy lỏng 2 bước Kết quả cho thấy việc nuôi cấy hai bước theo quy trình của

Christoph Wawrosch (2009) áp dụng trên cả hai loài Drosera đều đạt

hiệu quả cao, trong đó NT2 (2 tuần đầu cảm ứng tạo chồi bằng MS rắn bổ sung BA, 3 tuần sau chuyển mẫu đã cảm ứng sang môi trường

MS lỏng không bổ sung hormone) là thích hợp nhất cho việc cải thiện khả năng nhân chồi và phát triển cây con với tỷ lệ tạo chồi cao

nhất (100%) và số chồi trên một mẫu cao hơn (D indica: cao gấp 1,58 lần; D burmanii cao gấp 2,03 lần) so với đối chứng

Tạo rễ và phát triển cây con hoàn chỉnh: chồi con tách ra từ cụm

chồi mẹ sau 6-8 tuần nuôi cấy có thể phát triển thành cây con hoàn chỉnh trên môi trường MS với đầy đủ các bộ phận kể cả việc tạo rễ

mà không cần bổ sung auxin

3.2 Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học

từ nguồn nguyên liệu in vitro của Drosera

3.2.1 Sàng lọc và cô lập hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa

Định tính phân đoạn chứa phenolic: chọn được 5 phân đoạn (1, 2,

5, 6, 9) trong 9 phân đoạn

Kết quả sàng lọc lần 2: phân đoạn 6 ( 2g cao) có hoạt tính kháng

oxy hóa cao nhất

Sắc ký lọc gel Sephadex LH-20, giải ly với hệ dung môi chloroform-methanol (1:1) phân đoạn 6 cho phép cô lập được một

hợp chất A (m= 49mg) có dạng tinh thể hình kim mịn, vàng ánh sau khi được kết tinh trong hệ dung môi chloroform-ethyl acetate (3: 7)

3.2.1.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất cô lập

Kết quả ở cả hai phương pháp (FTC và TBA) đều cho khả năng ức chế quá trình peroxide hóa lipid của hợp chất A rất cao, xếp cùng nhóm với Vitamin E và BHA khi thống kê (bảng 3.11)

Bảng 3.1 % hoạt tính kháng oxy hóa AI (%) của A

Chứng âm Vitamin E BHA Hợp chất A

AI (% ± SE)

(phương pháp TBA) 0,00 ± 0,00a 76,31± 5,34b* 90,06±1,89b* 81,21± 9,17b*

AI (% ± SE)

(phương pháp FTC) 0,00 ± 0,00a 12,79 ± 2,64ab 23,33±5,25b* 28,59 ± 6,53b*

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, * chỉ sự khác biệt giữa các nghiệm thức với đối chứng, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05

3.2.1.3 Xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất A

Hợp chất được xác định có cấu trúc là C15H10O7; M=302,226, danh pháp hóa học 2-(3,4-dihydrophenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-

one, tên thương mại là quercetin

3.2.2 Sàng lọc và cô lập hợp chất có khả năng ức chế tăng sinh

Kết quả định tính phân đoạn cao chứa hợp chất phenolic: chọn ra

4 phân đoạn (2, 3, 4, 8) từ 8 phân đoạn sau sắc ký cột

Kết quả sàng lọc lần 2: trong 4 phân đoạn khảo sát, phân đoạn thứ

3 cho tỷ lệ ức chế tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 cao nhất Do đó, phân đoạn 3(3,48g) được chọn đem cô lập hợp chất có

khả năng ức chế tăng sinh tế bào Sắc ký cột silica gel phân đoạn đã chọn, giải ly bằng hệ dung môi (ether dầu hỏa:chloroform) với độ phân cực tăng dần từ 20% chloroform cho đến 50% chloroform trong ether dầu hỏa cho một phân đọan chứa hợp chất có dạng tinh thể hình kim, màu cam đỏ

Phân đoạn này được tinh chế nhiều lần bằng sắc ký lớp mỏng điều chế với hệ dung môi ether dầu hỏa-chloroform (8:2) cho đến khi sản phẩm thu được chỉ còn 1 vết tròn rõ có Rf = 0,48 Kết quả cho phép

cô lập được một hợp chất B (m=65mg)

3.2.2.2 Khảo sát hoạt tính của hợp chất cô lập được theo định

hướng có khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư ruột kết ở người DLD-1

Kết quả từ các thí nghiệm đếm tế bào bằng máy đếm và xác định kích thước tế bào Coulter counter cho thấy hợp chất B có khả năng ức chế mạnh sự tăng sinh tế bào (IC50=3,53µM sau 48 giờ cảm ứng) Trong

đó, khi ở nồng độ cao (2,5-5µM), hợp chất B làm giảm kích thước tế bào dần dần cho đến khi tế bào mất khả năng bám dính rồi chết So với resveratrol, một hợp chất ly trích từ vỏ trái nho đang được nghiên cứu sử dụng như một dược chất điều trị ung thư, tác dụng ức chế tăng sinh và phát triển của hợp chất B trên dòng tế bào DLD-1 khác hẳn: res cũng ức chế sự tăng sinh tế bào nhưng làm tăng kích thước tế bào trong 48 giờ đầu cảm ứng [AzizMH,2003], [Kristoffersen P.K., 2006] Nhưng so với rapamycin, một chất kháng sinh được công nhận về khả năng ức chế con đường truyền tín hiệu của protein mTOR, protein giữ vai trò chính trong việc tăng sinh và phát triển tế bào, thì tác dụng của hợp chất B lên DLD-1 có phần tương tự: ức chế

và làm giảm kích thước tế bào dần dần cho đến khi mất khả năng bám dính ngay sau 2 giờ cảm ứng [Noriko O., 2004] Do vậy, với kết

quả đếm tế bào, hợp chất B có thể sẽ là một hợp chất có tiềm năng sử dụng tương tự như rapamycin Cũng vì lý do này, phương pháp điện

di miễn dịch được tiến hành nhằm khảo sát xem cơ chế tác dụng của

hợp chất B trong việc ức chế tăng sinh và phát triển của tế bào in

vitro thông qua sự biểu hiện của protein mTOR, một protein kinase

giữa vai trò thiết yếu cho sự tăng sinh và phát triển tế bào động vật,

và con đường truyền tín hiệu của nó giống hay khác với cơ chế tác dụng của rapamycin Kết quả cho thấy hợp chất B có ảnh hưởng lên

sự biểu hiện của mTOR và pmTOR nhưng cơ chế ảnh hưởng hoàn toàn khác với rapamycin vì protein đích của hợp chất B không phải S6K, một protein downstream của mTOR giữ vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp protein, như ở rapamycin

3.2.2.3 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất B

Hợp chất được xác định có cấu trúc là C11H8O3, danh pháp hóa học methyl-5-hydroxy-1,4-naphthoquinone, tên thương mại plumbagin

2-3.2.3 Lựa chọn hợp chất có tiềm năng làm hợp chất đích cho

mục tiêu nghiên cứu tăng năng suất thu nhận trên đối tượng này

Trong giới hạn của luận án, để nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật

tăng sinh thu nhận hoạt chất trên Drosera, kết quả định lượng bằng

HPLC giúp chọn 1 hoạt chất đích là plumbagin và đối tượng nghiên

cứu được chọn trong hai loài là D burmanii

3.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con

3.3.1 Khảo sát vòng đời in vitro để xác định các giai đoạn tăng

trưởng của D burmanii

Kết quả theo dõi và ghi nhận vòng đời của D burmanii nuôi cấy in

vitro giúp lựa chọn được thời gian thích hợp để thu hoạch nguyên

liệu: khi thu hoạch cây để cấy chuyền (cây đang trong giai đoạn tăng trưởng), thời gian thích hợp nhất là khi cây 4-6 tuần tuổi; khi thu hoạch để thu nhận hợp chất (cây đã bước vào giai đoạn trưởng thành), thời gian thích hợp nhất là khi cây 8-10 tuần tuổi; và thời điểm thích hợp để cảm ứng việc tăng sinh tổng hợp hoạt chất (cây bắt đầu giảm tăng trưởng) là khi cây 6 tuần tuổi

3.3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng

và sự tích lũy plumbagin trong cây con tái sinh

Hàm lượng khoáng đa lượng: MS1/2 vừa giúp cây tăng trưởng và

tích lũy hàm lượng hoạt chất không kém MS, vừa giảm giá thành kinh tế hơn so với MS

Ảnh hưởng của ánh sáng: khi được nuôi trong điều kiện có chiếu

sáng 16 giờ/ ngày: cây tăng trưởng mạnh, trọng lượng tươi nhiều hơn

và phiến lá nở rộng hơn so với khi không được chiếu sáng Tuy nhiên, sự tích lũy plumbagin lại trái ngược với sự tăng trưởng của cây dưới ảnh hưởng của ánh sáng: ánh sáng ức chế khả năng tích lũy plumbagin trong cây, khi cây được ủ tối hoàn toàn, hàm lượng plumbagin trong 1g sinh khối cây tăng lên cao hơn so với khi có chiếu sáng Điều này có thể được lý giải là do plumbagin cũng như những hợp chất có nhóm chức hoạt động khác, chúng thường dễ tham gia phản ứng và không ổn định trong điều kiện nuôi có ánh sáng Tóm lại, để sử dụng điều kiện chiếu sáng thích hợp trong nuôi

cấy cây con D burmanii cho mục tiêu thu nhận plumbagin, có thể

cần tác động theo hai giai đoạn khác nhau: trong giai đoạn tăng trưởng, cây cần được chiếu sáng đầy đủ để có thể nhân sinh khối tối

đa dưới sự hỗ trợ của ánh sáng; nhưng sau đó khi cây bước vào giai đoạn trưởng thành, có thể cần ngắt nguồn cung cấp ánh sáng để hạn chế yếu tố làm chuyển hóa hợp chất plumbagin