Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  LÊ THỊ HỒNG TRANG TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN CPi CỦA HAI LOÀI SMV VÀ BYMV LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  LÊ THỊ HỒNG TRANG TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN CPi CỦA HAI LOÀI SMV VÀ BYMV LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.42.01.21 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS. TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, một số kết quả cộ . Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên Tạp chí Khoa học-Công nghệ đồng tác giả, phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Thu Hiền, Trƣờng Đại học Y-Dƣợ ững ý kiến quý báu và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình tiến hành thí nghiệ ề tài luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh-KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm –Đại học Thái Nguyên; xin cảm ơn chị Trần Thị Hồng – KTV phòng Công nghệ tế bào thực vật, đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện các thí nghiệm của đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu K & Nhân văn miền núi đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong học tập và hoàn thành khoá học. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến bố mẹ, anh chị cùng bạn bè đã động viên, khuyến khích, giúp đỡ tôi, luôn quan tâm và là chỗ dựa cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. - - . Tác giả Lê Thị Hồng Trang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN………………………………………………………… i LỜI CAM ĐOAN………………………………………………………. ii MỤC LỤC……………………………………………………………… iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT …………… ………………… v DANH MỤC CÁC BẢNG…………………………………………… vii DANH MỤC CÁC HÌNH……………………………………………… viii MỞ ĐẦU…………………………………………………………… 1 . 1 . 2 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………… 3 1.1. Cây đậu tƣơng……………………………………………………… 3 1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm nông sinh học của đậu tƣơng…………… 3 1.1.2. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và trong nƣớc……… 7 1.2. Bệnh khảm và virus gây bệnh khảm SMV, BYMV……………… 10 1.2.1. Bệnh khảm đậu tƣơng……………………………………………. 10 1.2.2. Virus gây bệnh khảm SMV và BYMV………………………… 11 1.3. Kỹ thuật RNAi…………………………………………………… 12 1.3.1. Cơ chế ức chế gen của kỹ thuật RNAi…………………………… 12 … 14 ………… 16 1.4.1. Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen vào mô đích………… 16 1.4.2. Chuyển gen gián tiếp thông qua A. tumefaciens ………………… 17 1.4.3. Hệ thống tái sinh và hệ thống chọn lọ ………. 19 1.4.4. 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP………………………… 24 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ………………………… 24 24 .…………………………………………………………. 25 2.1.3. Thi 25 25 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………. 26 2.2.1. Phƣơng pháp tạo vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp……………. 26 2.2.2. Phƣơng pháp gây tổn thƣơng nách lá mầm………………………. 27 2.2.3. Phƣơng pháp tái sinh cây đậu tƣơng từ nách lá mầm……………. 28 2.2.4. Phƣơng pháp lây nhiễm và tạo cây đậu tƣơng chuyển gen………. 28 2.2.5. Phân tích cây đậu tƣơng chuyển gen…………………………… 32 2.2.6. Phƣơng pháp xác định hiệu suất chuyển gen……………………. 34 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1. KẾT QUẢ TẠO A. TUMEFACIENS MANG VECTOR CHUYỂN GEN pK7GW-CPi (SMV-BYMV)…………………………………… 35 3.2. …… 37 3.3. TƢƠNG 41 3.3.1. Tái sinh in vitro và chuyể - giống đậu tƣơng ĐT12 và DT2008 41 3.3.2. 0 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 CÔNG 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyringone A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine Bp Base pair (cặp base) BYMV Bean yellow mosaic virus CCM Cocultivation medium CP Coat protein (protein vỏ) CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide cs Cộng sự ĐC Đối chứng EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ chức lƣơng thực và nông nghiệp liên hợp quốc) GA3 Gibberellic acid GM Môi trƣờng nảy mầm gus Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase hpRNA Hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc) IhpRNA Intron hairpin RNA (Cấu trúc kẹp tóc mang intron) IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3butyric acid Kb Kilo base Km Kanamycin Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LB Luria and Bertani MS Môi trƣờng cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) NAA α-Naphthaleneacetic acid PCR Polymerase chain reaction RISC RNA-inducing silencing complex RM Môi trƣờng ra rễ RNA Ribonucleic acid RNAi RNA interference SIM Môi trƣờng tạo chồi SEM Môi trƣờng kéo dài chồi siRNA Short interfering RNA SMV Soybean mosaic virus TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Ti- plasmid Plasmid tạo khối u T 0, T 1 Các thế hệ cây đậu tƣơng chuyển gen T 0 Cây đậu tƣơng chuyển gen tái sinh chồi T 1 Hạt của cây chuyển gen T 0 nảy mầm thành cây T 1 Vir Virulence Region v/p Vòng/phút YEP Yeast extract peptone Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới từ năm 2008 đến 2012…………………………………………………………. 8 Bảng 1.2. ậu tƣơng củ ố nƣớc đứng đầu thế giớ 2010, 2011, 2012 8 Bảng 1.3. Sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ 2007 – 2013……………. 9 Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trƣờng tái sinh in vitro……………… 29 Bảng 2.2. Thành phần đệm tách DNA tổng số………………………… 32 Bảng 2.3. Trình tự các cặp mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 33 Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR 33 Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của phƣơng thức gây tổn thƣơng nách lá mầm đến khả năng tạo đa chồi……………………………………. 38 Bảng 3.2. - - A. tumefaciens …………………………………………… 43 Bảng 3.3. Khả năng phát sinh chồi, kéo dài chồi và khả năng ra rễ của hai giống ĐT12 và DT2008 trong quá trình chuyển gen 44 Bảng 3.4 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của SMV………………………………… 11 Hình 1.2. Cơ chế RNA can thiệp……………………………………… 13 Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 26 Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tái sinh và chuyển gen vào cây đậu tƣơng… 30 Hình 3.1. Kết quả điệ ản phẩm colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc…………………………………………………… 36 Hình 3.2. 37 Hình 3.3. Kết quả gây tổn thƣơng, tạo đa chồi nách lá mầm bằng các phƣơng thức khác nhau ở hai giống ĐT12 và DT2008…… 39 Hình 3.4. Kết quả tái sinh và chuyển gen ở giống đậu tƣơng ĐT12 và DT2008 42 Hình 3.5. Kết quả tỷ lệ tạo đa chồi, kéo dài chồi và đƣa cây ra giá thể… 45 Hình 3.6. ổng số tách từ Đ 2008 46 Hình 3.7. ện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấ - ậu tƣơng chuyể 12 47 Hình 3.8. ện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trú - ậu tƣơng chuyể 2008 48 [...]... thuật chuyển gen RNAi trên các loại cây trồng quan trọng khác [55] lựa chọn đề tài: Tạo cây đậu Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của hai loài SMV và BYMV 2 Mục tiêu nghiên cứu 3 Nội dung nghiên cứu cấu trúc RNAi A tumefaciens vi khuẩn tái tổ hợp; 3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng của phƣơng thức gây tổn thƣơng nách lá mầm đạt hiệu quả tạo đa chồi và. .. Lim và cs (2007) nghiên cứu chuyển gen HC-pro vào cây đậu tƣơng đã nhận thấy rằng, cây chuyển gen khi bị lây nhiễm SMV sau 2 tuần triệu chứng nhiễm bệnh khảm lá do SMV biến mất và lƣợng SMV đã giảm đáng kể, tuy nhiên HC-Pro của SMV đã gây biến đổi hình thái lá và giảm sự tạo hạt ở các cây đậu tƣơng chuyển gen [28] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1.4 CHUYỂN GEN Cây đậu tƣơng chuyển. .. tƣơng lai của can thiệp RNA trong y học, sinh học Dựa vào hoạt động của cơ chế RNAi, có thể thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng ức chế hoạt động của gen ngoại lai, nhằm tạo giống cây chuyển gen kháng bệnh virus hữu hiệu Vector mang gen là đoạn cDNA có nguồn gốc từ RNA của virus Chúng đƣợc đƣa vào tế bào vật chủ để khi virus xâm nhiễm, các đoạn cDNA này sẽ bắt cặp bổ sung và cắt... tái tổ hợp vào mô nách lá mầm và tạo cây đậu tƣơng chuyển gen; 3.4 Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm nông sinh học của đậu tƣơng Đậu tƣơng có bộ NST 2n = 40, tên khoa học là Glycine max (L) Merrill, thuộc chi Glycine, họ đậu (Fabaceae),... tumefaciens và tế bào thực vật Khi lây nhiễm vào tế bào thực vật, một phần nhỏ của Ti plasmid khoảng 25kb đƣợc gọi là T-DNA đƣợc chuyển và gắn vào hệ gen của thực vật Nhờ vậy đoạn T-DNA tồn tại trong hệ gen của thực vật mà nó gắn vào Trong Ti plasmid đoạn TDNA đƣợc giới hạn bằng bờ phải (R) và bờ trái (L) có các đoạn nucleotide tƣơng tự nhau Đoạn T-DNA chứa các gen tổng hợp auxin, cytokinin, đó là các gen. .. lớp tế bào nên chuyển gen bằng súng bắn gen vào mô phân sinh thƣờng mang thể khảm, do vậy việc tiếp nhận gen chuyển của thế hệ con cháu phụ thuộc vào sự biến đổi ở bên trong tế bào nhƣng đến năm 2008 Rech và cs đã kết hợp giữa bắn gen, gây cảm ứng và dùng hệ thống chọn lọc với thuốc diệt cỏ imazapyr đã thu đƣợc một kết quả khả quan trong tạo ra cây đậu tƣơng biến đổi gen [36] 1.4.2 Chuyển gen gián tiếp... qua hệ thống Agrobacterium với súng bắn gen bao gồm khả năng chuyển đoạn tƣơng đối lớn của DNA, tạo ra ít hơn các bản sao gen chuyển đƣợc tích hợp vào bộ gen thực vật, ít có sự sắp xếp lại gen chuyển, sự sắp xếp rải rác DNA của hệ gen với tần số thấp hơn và giảm biểu hiện bất thƣờng ở gen chuyển [20] Hơn nữa, hệ thống này bao gồm chi phí vận hành thấp và cách thức chuyển đổi đơn giản Tuy nhiên, thực vật... chuyển gen đƣợc tạo ra đầu tiên vào năm 1988 (Christou và cộng sự, 1988) Nhƣng sau hơn hai thập kỷ, việc chuyển gen ở đậu tƣơng vẫn còn gặp nhiều khó khăn do khả năng kết hợp giữa chuyển gen hiệu quả và kỹ thuật tái sinh Hai phƣơng pháp đã đƣợc sử dụng với thành công tƣơng đối để tạo ra thực vật chuyển gen có vai trò quan trọng trong khoa học cơ bản và ứng dụng trong nông nghiệp đó là: chuyển gen trực... chọn hoặc nhận biết tế bào chuyển gen 1.4.1 Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen vào mô đích Chuyển gen bằng súng bắn gen là phƣơng pháp sử dụng các hạt kim loại nặng đƣợc bao bọc bởi DNA và chuyển vào mô tế bào Các hạt di chuyển với tốc độ cao qua thành tế bào, vƣợt qua màng nhân để vào trong nhân, tại đây các đoạn DNA ngoại lai đƣợc giải thoát và có thể đƣợc tích hợp vào DNA nhiễm sắc thể thông... kỹ thuật RNAi (RNA interference) đƣợc biết đến là một kỹ thuật hiện đại và chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật Cấu trúc RNAi chứa trình tự gen lặp lại đảo chiều của Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ virus mục tiêu đƣợc sử dụng để chuyển vào cây, nó sẽ đƣợc biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen và kích thích cơ chế RNAi hoạt . HỌC SƢ PHẠM  LÊ THỊ HỒNG TRANG TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN CPi CỦA HAI LOÀI SMV VÀ BYMV LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC . ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  LÊ THỊ HỒNG TRANG TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN CPi CỦA HAI LOÀI SMV VÀ BYMV LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành:. chuyển gen RNAi trên các loại cây trồng quan trọng khác [55]. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn đề tài: Tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của