ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM MINH DUY SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN DREB1 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG Ở MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM MINH DUY SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN DREB1 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG Ở MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN VŨ THANH THANH LỜI CAM ĐOAN Thái Nguyên - 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi thực Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Thái Nguyên, ngày tháng năm 2011 Tác giả Phạm Minh Duy Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn kỹ thuật viên Bộ môn Sinh học phân tử Công nghệ gen - Viện Khoa học sống – Đại học Thái Nguyên Tôi xin bày tỏ lịng cảm ơn đến gia đình, bạn bè động viên khuyến khích giúp đỡ tơi suốt q trình học tập làm luận văn Cơng trình thực với tài trợ kinh phí dự án TRIG Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Tác giả luận văn Phạm Minh Duy Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHƯNG CHƯ VIÊT TĂT ̃ ̃ ́ ́ ABA Abscisic Acid (Axit abxisic) DNA Axit deoxyribonucleic (Deoxyribonucleic acid) ASTT Áp suất thẩm thâu ́ bp Base pair (Căp base) ̣ CTAB Cetyltrimethyl – amonium bromide DREB Dehydration- Responsive Element Binding cs Cộng HSP Heat shock protein (Protein sôc nhiêt) ́ ̣ LEA Late embryogenesis abundant protein (Protein tí ch luy vơi sô ̃ ́ ́ lương lơn giai đoan cuôi cua qua trì nh hì nh phôi) ̣ ́ ̉ ̣ ́ ̉ ́ ̀ LTP Lipid transfer protein (Protein vân chuyên lipid) ̣ ̉ MGPT Môi giơi phân tư (Molecular chaperone) ́ ̉ PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) TAE Tris Acetate EDTA Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MUC CAC BẢNG ̣ ́ Bảng Tên cac bang luân văn ́ ̉ ̣ Trang 1.1 Diện tích sản lượng đậu tương số quốc gia giới 1.2 Năng suất đậu tương số quốc gia giới 1.3 Môt sô trì nh tư gen ̣ ́ ̣ DREB1 đa đăng ky rên Ngân hang gen ̃ ́ t ̀ (NCBI) 24 2.1 Tên nguồn gốc giống đậu tương nghiên cứu 25 2.2 Danh muc cac thiêt bị sư dung ̣ ́ ́ ̉ ̣ 27 2.3 Môi nhân gen DREB1 ̀ 29 2.4 Thành phần phản ứng nhân gen DREB1 29 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector 31 2.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp 32 3.1 Phở hấp thụ DNA bước sóng 260nm 280nm giống đậu tương VNS, CPB, CYS 35 3.2 Vị trí khác biệt trình tự nucleotide gen DREB1 CYS, CPB VNS 40 3.3 3.4 3.5 Vị trí sai khác trình tự amino acid protein DREB1 hai nhóm chịu hạn khác So sanh mưc đô tương đông trì nh tư nucleotide cua gen ́ ́ ̣ ̀ ̣ ̉ DREB1 giống đậu tương CYS, CPB VNS vơi ́ FR822736 Hệ số tương đồng amino acid protein DREB1 CPB, CYS, VNS, FJ965342, AY802779 FR822736 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 43 45 http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên cac hì nh luân văn ́ ̣ Trang 1.1 Cơ chế phân tử q trình tăng cường tính chịu hạn thực vật 19 2.1 Hạt giông hat đâu tương đị a phương nghiên ́ ̣ ̣ cưu ́ 25 2.2 Hình ảnh vector pTZ57R/T 26 3.1 Hình ảnh điện di DNA tởng số giơng đâu tương ́ ̣ VNS, CPB, CYS 34 3.2 Kết điên di san phâm PCR nhân gen ̣ ̉ ̉ DREB1 giông đâu tươngVNS, CPB, CYS ́ ̣ 36 3.3 Tế bào khả biên E.coli chủng DH5α chưa vector tai ́ ́ ́ tô hơp mang gen DREB1 phân lập từ giống VNS ̉ ̣ 37 3.4 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp BamHI EcoRI 38 3.5 So sánh trình tự nucleotide gen DREB1 ba giống đậu tương đị a phương CYS , CPB VNS 39 3.6 So sánh trình tự amino acid protein DREB1 ba giống đậu tương CYS, CPB VNS 41 3.7 Mối quan hệ di truyền giống đậu tương dựa phân tích trình tự nucleotide gen DREB1 44 3.8 Mối quan hệ di truyền giống đậu tương dựa phân tích trình tự amino acid protein DREB1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Cây đậu tƣơng Glycine max (L.) Merrill loại họ Đậu có vị trí quan trọng cấu trồng nông nghiệp nƣớc ta Hạt đậu tƣơng có hàm lƣợng protein cao từ 30% - 56%, 19% - 25% lipid 20% glucid Trong protein thực vật, protein đậu tƣơng có phẩm chất tốt, dễ tan chứa hầu hết loại amino acid, đặc biệt loại amino acid không thay Lipid đậu tƣơng chứa tỷ lệ lớn axit béo chƣa no, có hệ số đồng hố lớn (98%), số iốt cao (120 – 137) có tác dụng phòng chống bệnh bƣớu cổ cho ngƣời Sử dụng protein lipid đậu tƣơng cịn có tác dụng phịng chữa bệnh đái tháo đƣờng, béo phì, huyết áp cao, chảy máu não…Rễ đậu tƣơng có nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm Việt Nam nƣớc nông nghiệp nhiệt đới trồng đậu tƣơng với ba mục đích giải vấn đề thiếu protein cho ngƣời gia súc, xuất cải tạo đất Cả nƣớc hình thành vùng sản xuất đậu tƣơng: Vùng Nam Bộ, miền núi Bắc Bộ, Đồng sông Hồng, Đồng sông Cửu Long, Đồng ven biển miền Trung Tây Nguyên Tuy nhiên, sản lƣợng đậu tƣơng nƣớc ta thấp phải nhập từ nƣớc để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng làm thức ăn cho gia súc [5] Cây đậu tƣơng thuộc nhóm chịu hạn kém, bên cạnh yếu tố nhƣ kỹ thuật canh tác, ảnh hƣởng sâu bệnh yếu tố hạn hán hay không chủ động đƣợc nguồn nƣớc trình canh tác đậu tƣơng nguyên nhân làm cho suất sản lƣợng đậu tƣơng nƣớc ta thấp Nghiên cứu tăng cƣờng khả chịu hạn đậu tƣơng biện pháp công nghệ sinh học đƣợc quan tâm yêu cầu từ thực tiễn sản xuất đậu tƣơng nƣớc ta [11] Một nguyên nhân làm hạn chế phát triển đậu tƣơng nƣớc ta giống địa phƣơng bị thoái hoá kỹ thuật canh tác tác động xấu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn biến đổi môi trƣờng Do vậy, vấn đề cải tạo giống đậu tƣơng có nguồn gốc địa phƣơng trồng lâu năm địa phƣơng, tạo giống thích nghi với điều kiện sinh thái vùng, bảo tồn phát triển nguồn gen yêu cầu thực tiễn đặt cho ngành chọn giống đậu tƣơng [11] Cây đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) trở thành trồng quan trọng không Việt Nam mà nhiều quốc gia giới Hạt đậu tƣơng đƣợc dùng làm nguồn thức ăn giàu đạm cho ngƣời nguồn nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp Đậu tƣơng loại trồng ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao sử dụng làm thƣơng phẩm đƣợc sử dụng cho mục đích cải tạo đất, bên cạnh đậu tƣơng dễ canh tác thích nghi với nhiều vùng sinh thái Tại Việt Nam, đậu tƣơng giữ vai trò quan trọng cấu trồng nhiều địa phƣơng với sản lƣợng trung bình từ 2001 – 2009 239,1 nghìn Theo thống kê năm 2009 cho thấy đậu tƣơng đƣợc canh tác diện tích 146,2 nghìn 28 tỉnh thành trải từ Bắc vào Nam, tập trung chủ yếu miền Bắc với sản lƣợng 213,6 nghìn [64] Trong khu vực ASEAN, suất đậu tƣơng năm 2009 Việt Nam đứng thứ số nƣớc trồng đậu tƣơng Campuchia, Lào, Myanmar, Philipines, Thái Lan Việt Nam Khi so sánh số liệu với suất trung tâm sản xuất đậu tƣơng giới Argentina, Brazil Hoa Kỳ thấp [65] Do khơng đáp ứng đủ nhu cầu nƣớc nên phải nhập đậu tƣơng với số lƣợng lớn từ quốc gia bên ngồi Khơ hạn yếu tố làm giảm suất đậu tƣơng Hiện ngƣời ta tập trung vào đối tƣợng khô hạn mặn, hai dạng gây stress phi sinh học quan trọng đến sản xuất đậu tƣơng đặt mục tiêu hƣớng tới cải tiến Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn giống đậu tƣơng tồn cầu Khơ hạn làm giảm 70% suất trồng nói chung [16] Bơi vây , viêc nghiên cƣu gen liên quan đên kha ̉ ̣ ̣ ́ ́ ̉ chịu hạn đậ u tƣơng góp phần tạo đậu tƣơng chịu hạn tốt la yêu ̀ câu câp thiêt Protein DREB nhân tố phiên mã kích hoạt số gen liên ̀ ́ ́ quan đến tính chịu hạn thực vật nói chung đậu tƣơng nói riêng Nghiên cƣu xác định trình tự gen DREB1 đa đƣơ c công bô bơi Chen ́ ̃ ̣ ́ ̉ cs (2004) [20] Năm 2010, Nguyễn Thị Minh Hồng cs phân lập gen DREB1 giống đậu tƣơng Xanh lơ Ba Bể [29] Để xác định thị phân tử liên quan đến khả chịu hạn dựa trình tự gen DREB1, chúng tơi tiến hành đề tài “So sánh trình tự gen DREB1 liên quan đến khả chịu hạn số giống đậu tƣơng miền núi phía Bắc Việt Nam” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU So sánh trình tự nucleotide gen DREB1 số giống đậu tƣơng có khả chịu hạn khác nhằm xác định thị phân tử liên quan đến khả chịu hạn NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Tách DNA tổng số giống đậu tƣơng Vàng Ngân Sơn (Ngân Sơn Bắc Kạn), Cúc Lơng Phú Bình (Phú Bình – Thái Nguyên), Cúc Vàng Yên Sơn (Yên Sơn – Tuyên Quang) Tách dòng gen DREB1 giống đậu tƣơng Vàng Ngân Sơn, Cúc Lơng Phú Bình, Cúc Vàng n Sơn Xác định trình tự gen DREB1 máy xác định trình tự nucleotide tự động So sánh trình tự gen DREB1 giống đậu tƣơng với so sánh với số trình tự gen Ngân hàng gen quốc tế NCBI Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn FR822736, CPB VNS; nhóm có mẫu CYS giống đậu tƣơng chịu hạn CPB VNS thuộc nhóm 1, giống đậu tƣơng chịu hạn tốt (CYS) thuộc nhóm Sự khác biệt trình tự nucleotide trình tự amino acid nói sở để mở rộng nghiên cứu gen DREB1 giống đậu tƣơng có khả chịu hạn khác nhằm xác định thị phân tử phục vụ cho công tác chọn tạo giống đậu tƣơng chịu hạn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 http://www.lrc-tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I KẾT LUẬN Đã tách dòng gen DREB1 liên quan đến khả chịu hạn giống đậu tƣơng có khả chịu hạn khác CYS, CPB, VNS với kích thƣớc khoảng 717 bp Trình tự nucleotide ba mẫu nghiên cứu có độ tƣơng đồng cao với hệ số tƣơng đồng 99,4% đến 99,9% Trong đó, trình tự nucleotide giống đậu tƣơng CYS CPB sai khác vị trí lần lƣợt 60, 627, 634, 678 700; trình tự nucleotide giống đậu tƣơng CYS VNS sai khác vị trí lần lƣợt 627, 634, 678 700; trình tự nucleotide giống đậu tƣơng CPB VNS sai khác vị trí 60 Sự khác biệt trình tự nucleotide giống CYS, CPB, VNS với số giống Ngân hàng gen quốc tế (NCBI) cho thấy trình tự gen DREB1 ba giơng đâu tƣơng CYS, CPB VNS vơi FR822736 có độ tƣơng đồng cao ́ ̣ ́ (99,1 - 100%) Sự khác biệt trình tự amino acid giống CYS, CPB, VNS với số giống Ngân hàng gen quốc tế (NCBI) cho thấy hệ số trƣơng đồng amino acid protein DREB1 tƣơng đối cao (97% -100%), CPB VNS có tỷ lệ tƣơng đồng 100% so với FJ965342 II ĐỀ NGHỊ Cần tiếp tục xác định trình tự gen DREB1 số giống đậu tƣơng chịu hạn tốt khác để xác định xác thị phân tử liên quan đến khả chịu hạn gen DREB1 Thiết kế vector mang gen DREB1 tạo đậu tƣơng chuyển gen DREB1 có khả chịu hạn tốt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 http://www.lrc-tnu.edu.vn CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Phạm Minh Duy, Hồng Văn Mạnh, 2011, So sánh trình tự gen GmDREB1 hai giống đậu tƣơng địa phƣơng Cúc vàng Yên Sơn Cúc lơng Phú Bình, Tạp chí Khoa học Công nghệ - Đại học Thái Nguyên Tập 85, số 09/(2), 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trân Bì nh, Lê Thị Muôi, (1998), Phân lâ p gen va chon dong chông ̀ ̣ ̣ ̀ ̣ ̀ ́ chịu ngoại cảnh bất lợi lúa , NXB Đai Hoc Quôc gia , Hà Nội, tr ̣ ̣ ́ 92-98 Ngô Thê Dân, (1999), Cây đâu tương, NXB Nông Nghiêp ́ ̣ ̣ Nguyên Thu Hiên , Chu Hoang Mâu , Nguyên Phu Hung , Lê Thị Thanh ̃ ̀ ̀ ̣ ̃ ́ ̀ Hƣơng, (2005), Nghiên cƣu đăc điêm hì nh thai , hóa sinh nhân gene ́ ̣ ̉ ́ dehydrin môt sô giông đâu tƣơng đị a phƣơng vung nui phí a Băc Viêt ̣ ́ ́ ̣ ̀ ́ ́ ̣ Nam, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc – Nghiên cưu ban ́ ̉ khoa hoc sư sông – ĐH Y Ha Nôi, tr 1224-1227 ̣ ̣ ́ ̀ ̣ Nguyên Thị Thuy Hƣơng , Chu Hoang Mâu, Lê Văn Sơn , Nguyên Hƣu ̃ ́ ̀ ̀ ̣ ̃ ̃ Cƣơng, Lê Trân Bì nh , Chu Hoang Ha , (2008), Đanh gia kha c hịu ̀ ̀ ̀ ̀ ́ ́ ̉ hạn phân lập gen P 5CS số giống đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill), Tạp chí công nghê sinh hoc, (4), tr 459–466 ̣ ̣ Trân Văn Lâm (2010), Cây đâu tương đông vung đông băng sông ̀ ̣ ̉ ̀ ̀ ̀ Hông, www.vaas.org.vn ̀ Trân Thị Phƣơng Liên , Nguyên Huy Hoang , Đinh Duy Khang , Nông ̀ ̃ ̀ ́ Văn Hai , Lê Thị Mu ội, (1998), Phân lâp gen chaperon in giông đâu ̉ ̣ ̉ ́ ̣ tƣơng chị u nong M103, Tạp chí Công nghê sinh học, sô 36, tr 8-14 ́ ̣ ́ Trân Thị Phƣơng Liên , (1999), Nghiên cưu đăc tí nh hoa sinh va sinh ̀ ́ ̣ ́ ̀ học phân tử của mợt số giống đậu tương có khả n ăng chị u nong , chịu ́ hạn Việt Nam, Luân an tiên sĩ sinh hoc, Viên Công nghê sinh hoc, Hà ̣ ́ ́ ̣ ̣ ̣ ̣ Nơi, tr 22-34 ̣ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 http://www.lrc-tnu.edu.vn Trân Thị Phƣơng Liên , (1999), Phân lâp gen dehydrin liên quan đên ̀ ̣ ́ khả chịu hạn đậu tƣơng , Hôi nghị Công nghê sinh hoc ̣ ̣ ̣ toàn quốc, Hà Nội, tr 1348-1349 Trân Đì nh Long, (1991), Nhưng nghiên cưu mơi vê chon tao giông đâu ̀ ̃ ́ ́ ̀ ̣ ̣ ́ ̣ đô, NXB Nông nghiêp, Hà Nội, tr 1-10 ̃ ̣ 10 Trân Đì nh Long, (1999), Cây đâu tương, NXB Nông Nghiêp ̀ ̣ ̣ 11 Chu Hoang Mâu, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, ̀ ̣ Chu Hoàng Hà, (2011), Gen và đặc tính chịu hạn của đậu tương, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội 12 Hà Tiến Sỹ , (2008) Đanh gia kha n ăng chị u han va nhân gen P 5CS ́ ́ ̉ ̣ ̀ của một số giống đậu tương địa phương của t ỉnh Cao Bằng , Luân văn ̣ thạc sỹ sinh học, Trƣơng ĐH Sƣ pham – ĐH Thai Nguyên ̀ ̣ ́ 13 Hoàng Thị Thu Yến, Chu Hoang Mâu, Nghiêm Ngoc Minh, Nơng Văn ̀ ̣ ̣ Hải, Trịnh Đình Đạt, (2003), Phân lâp gen chaperonin cac dong đâu ̣ ̉ ́ ̀ ̣ tương đôt biên ML 10, ML48 và ML61, Nhưng vân đê nghiên cưu ̣ ́ ̃ ́ ̀ ́ ban khoa hoc sư sông , NXB Khoa hoc va Ky thuât , tr 1073̉ ̣ ̣ ́ ̣ ̀ ̃ ̣ 1076 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14 Armengaud P., Thiery L., Buhot N., Grenier-de March G., Savoures A., (2004), Transcriptional regulation of proline biosynthesis in Medicago truncatula reveals developmental and environmental specific features Physiologia plantarum, 120 (3), pp 442-450 15 Bray E.A., (1997), Plant responses to water deficit, Trend plant Sci,2, pp 47–54 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 http://www.lrc-tnu.edu.vn 16 CAO Xin-You., You-Zhi M., (2008), Isolation and Identification of a GmGβ1 Interacting Protein with GmDREB5 Protein in Soybean (Glycine max), Acta agronomica sinica, 34 (10), pp 1688−1695 17 Charlson D.V., Hu X., Okimoto B., Purcell L.C., (2009), Glycine max cultivar Jackson drought responsive element binding NCBI, Accession FJ965342, Http://www.ncbi.nlm.nih.gov 18 Chen F., Chen S.Y., Liu Q., (2002), Isolation of a rice cDNA encoding DREB-like protein induced by stresses NCBI, Accession AY064403, Http://www.ncbi.nlm.nih.gov 19 Chen M., Wang Q.Y., Cheng X.G., Xu Z.S., Li L C, Ye X G, Xia L Q, Ma Y Z., (2007), GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants, Biochem Biophys Res Commun, 353(2), pp 299 - 305 20 Chen Y., Chen P., de los Reyes B.G., (2004), Analysis of the expression of DREB1 gene orthologs in cultivated and wild species of soybean NCBI, Accession, AY802779, Http://www.ncbi.nlm.nih.gov 21 Close T.J., (1996), Dehydrin: Emergence biochemical role family plant dehydrin proteins, Physiol Plant, 97, pp 795 – 803 22 Fujita Y., Fujita M., Satoh R., Maruyama K., Parvez M M., Seki M., Hiratsu K., Ohme-Takagi M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K., (2005), AREB1 is a transcription activator of novel ABRE-dependent ABA signaling that enhances drought stress tolerance in Arabidopsis, Plant Cel, 17(12), pp 3470-88 23 Gaiyun Zhang, Ming Chen, Liancheng Li, Zhaoshi Xu, Xueping Chen, JiamingGuo and Youzhi Ma, (2009), Overexpression of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increased Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn tolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco, Journal of Experimental Botany, 60(13), pp 3781-3796 24 Gawel N.J., Jarret R.L., 1991, Genmic DNA isolation, Http:// www.igd.carnell.edu/pretoria % 20 lad % 20 mannual.doc 25 Hartl F.U., (1996), Molecular chaperones in cellular protein folding, Nature, 381, pp 571 – 580 26 Huang B., Jin L., Liu J., (2007), Molecular cloning and functional characterization of a DREB1/CBF-like gene (GhDREB1L) from cotton, Life Sci, 50 (1), pp 7-14 27 Huang N., Stebbins G.L., Rodriguez R.L., (1992), Classification and evolution of alpha – amylase genes in plants, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 89 (16), pp 7526–7530 28 Hsu T.F., Tsai F.Y., Hsing Y.I., Chow T.Y., (1997), Glycine max dehydrin (GmPM12) mRNA, complete cds, Institute of Botany, Academia Sinica, Taipei, Taiwan 11529, Republic of China 29 Nguyen, T.V.T., Chu, M.H., Hoang, M.V., Nguyen, H.T.M., (2011), Glycine max cv Xanhlo-Babe DREB1 gene for drought responsive, NCBI, Accession FR822736 30 Nguyen H.T.T., Chu M.H., Le S.V., Nguyen C.H., Chu H.H., 2009, Glycine max mRNA for hypothetical protein (P5CS gene), isolate Song Ma-Son La (SL5), Accession FM999729 31 Ian B.T., Alan B., Andrew J.T., (2000), Control of Absicisic acid synthesis, Journal of Experimental Botany, 51(350), pp 292 – 295 32 Javad K A., Sasan M., Hassan M., (2009), Isolation and Characterization of Partial DREB Gene from Four Iranian, Triticum Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 http://www.lrc-tnu.edu.vn aestivum Cultivars World Journal of Agricultural Sciences, (5), pp 561-566 33 Keder J.C., (1996), Lipid transfer proteins in plant, Annual review of Plant Physiology and Plant moculelar Biology, 47, pp 627 – 654 34 Lei T., Wang Q.Y., Zhai Y., Wang Y., Li J.W., Yan F., Su L.T., (2011), Characterization of a GmHSP70 Gene in Soybean, NCBI, Http://www.ncbi.nlm.nih.gov 35 Lee D.K., Ahn J.H., Song S.K., Choi Y.D., Lee J.S., 2011, Expression of an expansin gene is correlated with root elongation in soybean, Plant Physiol, 131 (3), pp 985-997 36 Liao Y., Zou H.F., Wang H.W., Zhang W.K., Ma B., Zhang J.S., Chen S.Y., (2008), Soybean GmMYB76, GmMYB92, and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants, Cell Res, 18(10), pp 1047–1060 37 Li X.P., Tian A.G., Luo G.Z., Gong Z.Z., Zhang J.S., Chen S.Y., (2005), Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses, Theor Appl Genet, 110(8), pp 1355-62 38 Lin R., Zhao W., Meng X., Wang M., Peng Y., (2007), Rice gene OsNAC19 encodes a novel NAC-domain transcription factor and responds to infection by Magnaporthe grisea, Plant Sci, 172 (1), pp 120-130 39 Liu K.H., Lin T.Y., (2004), Vigna radiata lipid trasfer protein I (ltp 1) mRNA, complete cds, EMBL GenBank, Accession AY300806 40 Liu K.H., Lin T.Y., (2004), Vigna radiata lipid trasfer protein II (ltp 2) mRNA, complete cds, EMBL Gen Bank, Accession AY300807 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 http://www.lrc-tnu.edu.vn 41 Liu Q., Sakuma Y., Abe H., Kasuga M., Miura S., YamaguchiShinozai K., Shinozaki K., (1998), Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain, separate two cellular signal transduction pathways in drought-and low temperatureresponsive gene expression, respectively, in Arabidopsis, Plant Cell, 10, pp 1391-1406 42 Liu W., Feng F., (2008), Nicotiana tabacum DREB4 mRNA, complete cds, College of Life Science, Henan Agricultural University, Wenhua Road, Zhengzhou, Henan 450002, P.R China 43 Lucas S., Hammon N., Glavina del Rio T., Detter J., Dalin E., Tice H., Pitluck S., Tuskan G., Chapman J., Putnam N.H., (2005), Populus trichocarpa AP2/ERF domain-containing transcription factor (DREB11), mRNA, US DOE Joint Genome Institute, 2800, Mitchell Drive B100, Walnut Creek, CA 94598-1698, USA 44 Maitra N., Cushman J.C., (1994), Isolation and characterization adrought – induced soybean cDNA encoding aD95 family late – embryogeneis – abudant protein, Plant Physiol, 106, pp 805 – 806 45 Ming C., Qiao-Yan W., Xian-Guo C., Zhao-Shi X., Lian-Cheng L., Xing-Guo Y., Lan-Qin X., You-Zhi M., (2006), GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants, Plant Mol Biol, 5(1), pp 20 46 Mukai T., Sakaki T., Akiyama T., 2003, Oryza sativa (japonica cultivar-group) lipid transfer protein-like protein (LTP2) mRNA, complete cds, Accession AY466109 47 Porcel R., Azcon R., Ruiz-Lozano J.M., (2005), Evaluation of the role of genes encoding for dehydrin proteins (LEA D-11) during drought Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn stress in arbuscular mycorrhizal Glycine max and Lactuca sativa plants, J Exp Bot, 56(417), pp 1933-1942 48 Porcel R., Azcon R., Ruiz-Lozano J.M., (2005), Evaluation of the role of genes encoding for dehydrin proteins (LEA D-11) during drought stress in arbuscular mycorrhizal Glycine max and Lactuca sativa plants NCBI, Accession AJ704824 49 Porcel R., Azcon R., Ruiz-Lozano J.M., (2005), Evaluation of the role of genes encoding for delta1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) during drought stress in arbuscular mycorrhizal Glycine max and Lactuca sativa plants, NCBI, Accession AJ715851 50 Qin F., Li J., Zhao J., Chen S.Y., Liu Q., (2002) Isolation of a maize cDNA encoding an DREB-like protein induced by stress, NCBI, Gen Bank, Accession AF448789 51 Tran Thi Phuong L., Cao Xuan H., Nong Van H., Le Thi M., (2003), Dehydrin gene sequences of Vietnamese soybean cultivars NCBI, Accession AJ583799, Http://www.ncbi.nlm.nih.gov 52 Riechmann J.L., J Heard, G Martin, L Reuber, C Jiang, J Keddie, L Adam, O Pineda, O.J Ratcliffe, R.R Samaha, R Creelman, M Pilgrim, P Broun, J.Z Zhang, D Ghandehari, B.K Sherman, and G Yu, (2000), Arabidopsis transcription factors: Genome-wide comparative analysis among eukaryotes, Science, 290, pp 2105–2110 53 Stolf-Moreira R., Medri M.E., Neumaier N., Lemos N.G., Brogin R.L., Marcelino F.C., de Oliveira M.C., Farias J.R., Abdelnoor R.V., Nepomuceno A.L., (2010), Cloning and quantitative expression analysis of drought-induced genes in soybean, Genet Mol Res, (2), pp 858-67 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 http://www.lrc-tnu.edu.vn 54 Tran L.S., Nakashima K., Sakuma Y., Osakabe Y., Qin F., Simopson S D., Maruyama K., Fujita Y., Shinozaki K., Yamaguchi – Shinozaki K., (2007), Co-expression of the stress-inducible zinc finger homeodomain ZFHD1 and NAC transcription factors enhances expression of the ERD1 gene in Arabidopsis Plant J, (1), pp 46-63 55 Tsui-Hung P., Guihua S., Hon-Ming L., (2008), Salt Tolerance in Soybean, Journal of Integrative Plant Biology 2008, 50 (10), pp 1196– 1212 56 Tsou C.H., Hsing Y.C., Hsu T.F., Chen Z.Y., Hsieh K.L., Hsieh J.S., Chow T.Y., (2011), Tissue- and stage-specific expression of a soybean (Glycine max) seed-maturation, biotinylated protein, Plant Mol Biol, 38 (3), pp 481-490 57 Wang P.R., Deng X.J., Gao X.L., Chen J., Wan J., Jiang H., Xu Z.J., (2006), Progress in the study on DREB transcription factor, Yi Chuan, 28(3), pp 369-74 58 Wangxia W., Basia V., Oded S., Arie A., (2004), Role of plant heat shock proteins and mocular chaperones in the abiotic stress response, Plant Science, 9(5), pp 244 – 252 59 Wang Y.M., He C.F., (2010), A cold-induced DREB gene in Aloe vera L, Plant Mol Biol Rep, 25, pp 121-132 60 Wang J., Wang J., Liu C., Hu G., Chen Q., (2010), Direct Submission NCBI, Accession FJ969431, Http://www.ncbi.nlm.nih.gov 61 Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki K., (1994), A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, low-temperature, or high-salt stress, Plant Cell, 6, pp 251264 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn 62 Yang K., Moon J.K., Jeong N., Back K., Kim H.M., Jeong S.C., (2008), Genome structure in soybean revealed by a genomewide genetic map constructed from a single population NCBI, Accession EU036414, Http://www.ncbi.nlm.nih.gov 63 Zhen Y., Ungerer M.C., (2008), Relaxed selection on the CBF/DREB1 regulatory genes and reduced freezing tolerance in the southern range of Arabidopsis thaliana, Mol Biol Evol, 25 (12), pp 2547-2555 Tài liệu trang Web 64 http://www.gso.gov.vn 65 http://faostat.fao.org 66 http://www.ncbi.nlm.nih.gov Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƢỢC VỀ CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.2 ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.2.1 Hạn ảnh hƣởng hạn trồng 1.2.2 Đặc tính chịu hạn đậu tƣơng 10 1.3 GEN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở ĐẬU TƢƠNG 12 1.3.1 Các gen chức 12 1.3.2 Các gen điều khiển phiên mã 18 1.3.3 Nghiên cứu gen DREB đậu tƣơng Glycine max (L.) Merrill 22 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 26 2.1 VẬT LIỆU 26 2.2 HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ 27 2.2.1 Các hoá chất sử dụng 27 2.2.2 Thiết bị 28 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 28 2.3.2 Định lƣợng kiểm tra độ tinh DNA tổng số 29 2.3.3 Kỹ thuật PCR 30 2.3.4 Tạo vector tái tổ hợp 31 2.3.5 Biến nạp nuôi cấy tế bào mang vector tái tổ hợp 32 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3.6 Phƣơng pháp tách plasmid tái tổ hợp 33 2.3.7 Giải trình tự xử lý số liệu 33 Chƣơng KÊT QUA VA THAO LUÂN 35 ́ ̉ ̀ ̉ ̣ Tách chiết DNA tổng số giống đậu tƣơng CYS, CPB VNS 35 Nhân gen DREB1 từ giống đậu tƣơng 36 Kết tách dòng gen DREB1 giống đậu tƣơng 37 Kết xác định so sánh trình tự gen DREB1 ba giống đậu tƣơng địa phƣơng CYS, CPB VNS 39 4.1 So sánh trình tự nucleotide gen DREB1 ba giống đậu tƣơng địa phƣơng CYS, CPB VNS 39 4.2 So sánh trình tự amino acid protein DREB1 ba giống đậu tƣơng địa phƣơng CYS, CPB VNS 42 4.3 So sánh trình tự nucleotide gen DREB1 ba giống đậu tƣơng địa phƣơng CYS, CPB VNS với số giống NCBI 45 4.4 So sánh trình tự amino acid protein DREB1 ba giống đậu tƣơng địa phƣơng CYS, CPB VNS với số giống NCBI 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 I KẾT LUẬN 49 II ĐỀ NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 http://www.lrc-tnu.edu.vn ... KHOA HỌC PHẠM MINH DUY SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN DREB1 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG Ở MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60 42 80 LUẬN VĂN... chịu hạn số giống đậu tƣơng miền núi phía Bắc Việt Nam? ?? MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU So sánh trình tự nucleotide gen DREB1 số giống đậu tƣơng có khả chịu hạn khác nhằm xác định thị phân tử liên quan đến. .. lập gen DREB1 giống đậu tƣơng Xanh lơ Ba Bể [29] Để xác định thị phân tử liên quan đến khả chịu hạn dựa trình tự gen DREB1, chúng tơi tiến hành đề tài ? ?So sánh trình tự gen DREB1 liên quan đến khả