BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  PHẠM VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ðƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN ROI CỦA VI KHUẨN SALMONELLA LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI        PHẠM VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ðƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN ROI CỦA VI KHUẨN SALMONELLA Chuyên ngành: CHĂN NUÔI Mã số: 60.62.01.05 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. ðỖ THỊ THẢO 2. PGS.TS. NGUYỄN BÁ MÙI HÀ NỘI, 2014 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam đoan rằng nội dung, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được sử dụng trong bất kỳ nghiên cứu nào. Tôi cũng xin cam đoan chắc chắn rằng mọi sự hướng dẫn, giúp đỡ cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Tôi xin khẳng định luận văn này là nỗ lực phấn đấu nghiên cứu, kết quả làm việc của cá nhân tôi. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả luận văn Phạm Văn Thành Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận văn này, tôi đã nhận được sự chỉ bảo, hướng dẫn tận tình của các thầy, cô giáo và sự giúp đỡ của bạn bè, đồng nghiệp cũng như của gia đình. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng sâu sắc và vô cùng biết ơn tới TS. Đỗ Thị Thảo, Phòng thực nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Bá Mùi, Bộ môn Sinh lý - Tập tính động vật, Khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng thủy sản cùng toàn thể Ban lãnh đạo và các thầy cô giáo Khoa Sau đại học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp, đặc biệt là những người thân trong gia đình đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên Phạm Văn Thành Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ðẦU 1 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3 3. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 3 4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. MIỄN DỊCH HỌC VÀ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG 4 1.1.1. Miễn dịch và đáp ứng miễn dịch 4 1.1.2. Hệ thống cơ quan và tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch 6 1.1.3. Kháng nguyên 10 1.1.4. Kháng thể và phản ứng kháng thể - kháng nguyên 12 1.1.5. Kháng thể đơn dòng 18 1.2. GIỐNG VI KHUẨN SALMONELLA VÀ BỆNH DO CHÚNG GÂY NÊN 21 1.2.1. Giống vi khuẩn Salmonella 21 1.2.2. Các yếu tố gây bệnh 23 1.2.3. Bệnh do Salmonella gây ra 25 1.2.4. Kháng nguyên roi tái tổ hợp H:1.2 của vi khuẩn Salmonella typhimurium 26 1.2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn Salmonella 26 Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1. NGUYÊN LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 28 2.1.1. Nguyên liệu 28 2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28 2.1.3. Các thiết bị thí nghiệm 28 2.1.4. Các hóa chất thí nghiệm 28 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 29 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.3.1. Nguyên tắc sản xuất kháng thể đơn dòng 30 2.3.2. Gây miễn dịch cho chuột 31 2.3.3. Phương pháp lấy đại thực bào 32 2.3.4. Phương pháp đếm tế bào 33 2.3.5. Phương pháp lấy tế bào lympho B của chuột 33 2.3.6. Nuôi cấy tế bào Myeloma dòng Sp2/0 và P3X 34 2.3.7. Dung hợp tế bào và tách dòng 34 2.3.8. Phương pháp ELISA 35 2.3.9. Phương pháp cộng hợp kháng thể đơn dòng với hoseradish peroxidase (HRP) 35 2.3.10. Phương pháp Dot- blot 36 2.3.12. Phương pháp ELISA xác định Salmonella typhimurium trong mẫu 37 2.3.13. Phương pháp xử lý số liệu 37 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ GÂY ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA 38 3.2. KẾT QUẢ DUNG HỢP GIỮA TẾ BÀO LYMPHO B VÀ MYELOMA 39 3.2.1. Tế bào đại thực bào (macrophage còn gọi feeder cell) 39 3.2.2. Tế bào Myeloma 40 3.2.3. Tế bào lympho B mẫn cảm kháng nguyên roi H:1.2 41 3.2.3. Dung hợp tế bào 41 3.3. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN ROI H:1.2 43 3.4. KÊT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐỘ NHẠY CỦA 2 DÒNG TẾ BÀO 47 3.5. GÂY BÁNG CHO CHUỘT, CỘNG HỢP KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG VỚI HRP 49 3.6. ỨNG DỤNG CỦA KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG ĐỂ XÁC ĐỊNH SỰ CÓ MẶT CỦA VI KHUẨN SALMONELLA TYPHIMURIUM TRONG CÁC MẪU THỊT LỢN 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v DANH MỤC VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên cụ thể ACCT American Type Culture Collection BSA Bovine serum albumin DMEN Dulbeco Modifie Medium ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch ELISA Enzym Linked Immunosorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum FCA Freund Complex Adjuvant FIA Freund Incomplex Adjuvant HAT Hypoxanthine aminopterin thimidine HT Hypoxathine thimidine KTĐD Kháng thể đơn dòng AFP Alpha fetoprotein OD Optical density PEG Polyethylene glycol PBS Phosphat bufferd saline Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả gây đáp ứng miễn dịch cho chuột 38 Bảng 3.2. Tỷ lệ giếng có tế bào lai trên tổng số giếng thực hiện dung hợp 42 Bảng 3.3. Tổng hợp kết quả tách dòng để chọn dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên roi H:1.2 của vi khuẩn Salmonella 44 Bảng 3.4. Giá trị OD trong phản ứng ELISA của các giếng có tế bào lai dương tính 45 Bảng 3.5. Kiểm tra độ đặc hiệu của dịch nổi của các dòng tế bào 47 Bảng 3.6. Bảng đánh giá độ nhạy của 2 dòng tế bào 48 Bảng 3.7. Kết quả ứng dụng 51 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ các chuỗi của một kháng thể 14 Hình 1.2. Các độc tố của vi khuẩn bên cạnh một tế bào cơ thể 15 Hình 1.3. Các độc tố trên bị trung hòa bởi kháng thể 16 Hình 1.4. Phản ứng kháng thể - kháng nguyên 17 Hình 1.5. Các kháng thể đa dòng, mỗi kháng thể liên kết với một epitope khác nhau 19 Hình 1.6. Kháng thể đơn dòng, liên kết với một epitope đặc hiệu 19 Sơ đồ 2.1. Quy trình sản xuất KTĐD 31 Hình 3.1. Tế bào đại thực bào (độ phóng đại 10 x 20) 40 Hình 3.2. Tế bào Sp2/0 (bên trái) và tế bào P3X (bên phải) 41 Hình 3.3. Các cụm tế bào lai (clone) đang phát triển, độ phóng đại 10x 20 43 Hình 3.4. Kháng thể đơn dòng Sal_2 cộng hợp HRP được kiểm tra bằng Dot- blot với các nồng độ kháng nguyên roi H:1.2 của vi khuẩn Salmonella typhimurium khác nhau 50 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 1 MỞ ðẦU 1. ðẶT VẤN ðỀ Bệnh truyền qua thực phẩm đã và đang trở thành vấn đề sức khỏe toàn cầu. Hậu quả tác động đến kinh tế của bệnh truyền qua thực phẩm là rất lớn, ước tính thiệt hại kinh tế lên tới hàng trăm tỷ đô la Mỹ mỗi năm. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới, thiệt hại kinh tế do bệnh truyền qua thực phẩm tại Việt Nam bằng khoảng 2% GDP (WHO, 2011). Số liệu của Cục An toàn thực phẩm, Bộ Y tế cho thấy trong 5 năm từ 2006 – 2010, cả nước xảy ra 944 vụ ngộ độc thực phẩm, số người mắc là 33.168 người, làm chết 59 người (Viện Dinh dưỡng Quốc gia, 2011). Theo báo cáo tại diễn đàn “Thực trạng và giải pháp tăng cường quản lý vệ sinh an toàn thực phẩm các tỉnh phía Nam” do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tổ chức ngày 25/10/2013, vi khuẩn Salmonella có trong đồ nguội, trứng sống, nghêu sò là nguyên nhân của 70% vụ ngộ độc thực phẩm. Salmonella là vi khuẩn đường ruột, đa số sống hoại sinh ở trong đường tiêu hóa, một số sống trong tự nhiên, một số gây bệnh cho người và động vật. Salmonella có tới 3 loại độc tố chính gây bệnh là: Ngoại độc tố (exotoxin), nội độc tố (endotoxin), độc tố tế bào (cytotoxin) (Nguyễn Thị Oanh, 2003). Ở Việt Nam đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về thực trạng nhiễm vi khuẩn Salmonella trong thực phẩm, theo Vân Thị Thu Hảo (2007), tỷ lệ nhiễm Salmonella của các mẫu thịt lợn tại Thành phố Hồ Chí Minh là 62%; tại Huế, tỷ lệ nhiễm Salmonella của thịt lợn bán lẻ tại chợ khoảng 32,8% (Koichi, T., et all., 2009). Có nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến tình trạng này, một trong những nguyên nhân phải kể đến là quy trình giết mổ lợn vẫn thực hiện nhiều ở quy mô nhỏ lẻ trong dân, chiếm tỷ trọng 75-80% về số đầu con và 65-70% sản lượng thịt (Sở Công thương TP. Hà Nội, 2010). Mặc dù nhiều khu mổ tập trung đã được xây dựng và quy hoạch nhưng điều kiện vệ sinh giết mổ vẫn chưa được cải thiện đáng kể, nghiên cứu của Le Bas và cộng sự (2006) cho [...]... th ñơn dòng kháng ñ c hi u kháng nguyên roi c a vi khu n Salmonella 3 M C ðÍCH NGHIÊN C U - S d ng kháng nguyên roi c a vi khu n Salmonella làm kháng nguyên gây mi n d ch trên dòng chu t thu n ch ng BALB/c ñ có ñáp ng mi n d ch - Nuôi c y và ch n l c thành công t bào lai gi a t bào Myeloma và t bào lympho B s n sinh kháng th ñơn dòng kháng kháng nguyên roi c a vi khu n Salmonella - Tách dòng t bào s... vi khu n Salmonella nh m t o ra kháng th ñơn dòng có ñ ñ c hi u và ñ nh y cao, các k t qu c a nghiên c u s ñ m b o cho vi c t o KIT ñ nh lư ng Salmonella sau này Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 2 2 M C TIÊU NGHIÊN C U - T o ñư c các dòng t bào lai (hybridoma) sinh kháng th kháng kháng nguyên roi c a vi khu n Salmonella - Ch n l c ñư c dòng t bào lai sinh kháng. .. sinh kháng th ñơn dòng kháng ñ c hi u kháng nguyên roi c a vi khu n Salmonella 4 Ý NGHĨA KHOA H C VÀ TH C TI N C A ð TÀI - Ý nghĩa khoa h c: + Hoàn thành quy trình t o t bào lai s n xu t kháng th ñơn dòng ñ t ñó s n xu t ñư c s lư ng l n kháng th ñơn dòng; + S d ng kháng th ñơn dòng vào nhi u m c ñích như trong nghiên c u khoa h c cơ b n - Ý nghĩa th c ti n: + S n xu t kháng th ñơn dòng kháng kháng nguyên. .. u t kháng nguyên O và K ð c l c c a vi khu n Salmonella ñư c quy t b i ch t lư ng, thành ph n hóa h c và c u trúc c a kháng nguyên O - Kháng nguyên H: Kháng nguyên H không có ý nghĩa trong vi c t o ra mi n d ch phòng b nh, không có vai trò quy t ñ nh y u t ñ c l c như kháng nguyên O nhưng l i có vai trò b o v vi khu n giúp chúng không b tiêu di t trong quá trình th c bào Kháng nguyên H còn giúp vi khu... nhi m salmonella nhanh chóng và d dàng như vi c s d ng các b KIT nh p kh u t nư c ngoài Trư c ñòi h i c a th c ti n, g n ñây ñã có m t s nghiên c u v v n ñ s n xu t kháng th ñơn dòng kháng kháng nguyên roi c a vi khu n Salmonella Tuy nhiên, các nghiên c u m i ch d ng l i ñánh giá tính ñ c hi u c a kháng th ñơn dòng do các dòng t bào sinh ra, chưa ti n hành gây báng cho chu t và tinh s ch ñ thu kháng. .. (trong trư ng h p mi n d ch t bào) Kháng nguyên nào thì kháng th như chìa khóa kh p v i y, kháng nguyên g n v i kháng th khóa Tính ñ c hi u c a kháng nguyên không ph i do toàn b c u trúc c a c phân t kháng nguyên quy t ñ nh mà do “nhóm quy t ñ nh” (epitope) c a kháng nguyên, ñó là nh ng ño n nh ho c m t b ph n nh n m trên b m t phân t kháng nguyên quy t ñ nh Nhóm quy t ñ nh kháng nguyên không nh ng quy t... ñư c kháng th ñơn dòng có tính ñăc hi u cao t các dòng t bào thư ng tr c b ng cách lai t bào u t y v i t bào s n xu t kháng th Thí nghi m này ñã dùng t bào lách c a chu t ñã ñư c mi n d ch v i h ng c u c u và lai v i t bào u t y c a chu t dòng P3-X63-Ag8 và dùng virus Sendai là ch t t o liên h p T bào lai thu ñư c có kh năng s n xu t kháng th ch ng h ng c u c u và có th nuôi c y dài ngày in vitro... ñơn dòng mong mu n ð c bi t, chưa ti n hành c ng h p kháng th ñơn dòng ñư c t o ra v i hoseradish peroxidase (HRP) Vì v y, c n ph i có nh ng nghiên c u sâu hơn ñ hư ng t i vi c t o ra ñư c b KIT s n xu t trong nư c xác ñ nh vi khu n Salmonella trên th c ph m Xu t phát t nh ng lý do trên, chúng tôi ti n hành th c hi n ñ tài: Nghiên c u dòng t bào lai s n xu t kháng th ñơn dòng kháng kháng nguyên roi. .. nh kháng th mong mu n v i tính ñ c hi u cao Hình 1.5 Các kháng th ña dòng, m i kháng th liên k t v i m t epitope khác nhau Hình 1.6 Kháng th ñơn dòng, liên k t v i m t epitope ñ c hi u Có th hi u kháng th ñơn dòng như sau: Khi m t kháng nguyên xâm nh p vào cơ th s ñư c ñ i th c bào ti p nh n phân chia thành các quy t ñ nh kháng nguyên (epitope) M t kháng nguyên có th có m t hay nhi u epitope Các t bào. .. nh kháng nguyên (epitope) và s n xu t ra m t lo i kháng th Các kháng th ñơn dòng ch nh n bi t m t epitope trên m t kháng nguyên cho s n Theo ñ nh nghĩa, t t c các kháng th ñơn dòng cùng m t dòng thì gi ng h t nhau và ñư c s n xu t cùng m t dòng tương bào Theo Nguy n Quang Th ch và cs (2004), kháng th ñơn dòng là t p h p c a các phân t kháng th ñ ng nh t v c u trúc và tính ch t 1.1.5.2 ng d ng c a kháng . thành công tế bào lai giữa tế bào Myeloma và tế bào lympho B sản sinh kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên roi của vi khuẩn Salmonella. - Tách dòng tế bào sản sinh kháng thể đơn dòng kháng đặc. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Tạo được các dòng tế bào lai (hybridoma) sinh kháng thể kháng kháng nguyên roi của vi khuẩn Salmonella. - Chọn lọc được dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng đặc. lớn kháng thể đơn dòng; + Sử dụng kháng thể đơn dòng vào nhiều mục đích như trong nghiên cứu khoa học cơ bản. - Ý nghĩa thực tiễn: + Sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên roi của vi