Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ m ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐINH THỊ HƢNG SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN GmDREB2 PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƢƠNG TRỒNG PHỔ BIẾN Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐINH THỊ HƢNG SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN GmDREB2 PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƢƠNG TRỒNG PHỔ BIẾN Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên – 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những nội dung trình bày trong luận văn là do tôi tìm hiểu dƣới sự hƣớng dẫn của GS.TS. Chu Hoàng Mậu . Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Đinh Thị Hƣng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành Bản luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. , ThS. các thầy cô Bộ môn Di truyền học & Sinh học hiện đại, khoa Sinh – K , Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện . Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Trƣởng khoa- Khoa Khoa học sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên TS. đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. - - . Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua. Tác giả Đinh Thị Hƣng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt vi Danh mục các bảng vii Danh mục các hình viii MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƢƠNG 3 1.1.1. Cây đậu tƣơng 3 1.1.2. Tác động của hạn đến cây đậu tƣơng 11 1.1.3. Đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng 4 1.1.4. Giá trị kinh tế của cây đậu tƣơng 6 1.1.5. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và ở Việt Nam 7 1.2. GEN DREB VÀ DREB2 Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG 13 1.2.1. Gen DREB 13 1.2.2. DREB2 và gen GmDREB2 16 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 21 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 21 2.1.2. Hoá chất và thiết bị 22 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu 22 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv 2.2.1. Các phƣơng pháp sinh học phân tử 22 2.2.2. Phƣơng pháp phân tích xử lý trình tự gen 30 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. KẾT QUẢ 2 TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG CBD và DVN5 31 3.1.1. Kết quả nhân gen DREB2 31 ả GmDREB2 32 3.2. SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN DREB2 VÀ TRÌNH TỰ 36 GmDREB2 36 3.2.2. So sánh trình tự ống đậu tƣơng CBD, DVN5 vớ ố AAY89658 40 3.2.3. Kết quả so sánh vùng AP2 của protein DREB2 ở một số giống đậu tƣơng nghiên cứu 41 3.3. SO SÁNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO 42 3.3.1. Kết quả so sánh trình tự gen DREB2 giữa một số giống đậu tƣơng Việ 054363 42 3.3.2. So sánh trình tự amino acid suy diễn của một số giống đậu tƣơng Việ 89658 45 3.3.3. Kết quả so sánh vùng AP2 của protein DREB2 ở ống đậu tƣơng CBD, DVN5, BG, 89658 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 1. KẾT LUẬN 48 2. ĐỀ NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisis acid bp Cặp base Cs Cộng sự cDNA Complementary DNA( Sợi DNA bổ sung đƣợc tổng hợp từ RNA thông tin nhờ enzym phiên mã ngƣợc) DREB Dehydration- Responsive Element Binding EDTA Ethyen Diamin Tetraacetic Acid kb Kilo base PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RNA Ribonucleic Acid TAE Tris acetat EDTA CBD Cao Bằng Đen DVN5 Giống ĐVN5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bả , ản lƣợng đậ ệ 9 Bảng 2.1. Nguồn gốc của các giống đậu tƣơng nghiên cứu 21 2.2. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 24 Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR nhân gen DREB2 25 Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen DREB2 25 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng colony – PCR 28 Bảng 2.7. Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR 29 Bảng 3.1. Các vị trí sai khác giữa trình tự đoạn gen GmDREB2 của hai giống đậu tƣơng CBD và DVN5 với gen GmDREB2 có mã số DQ054363 39 Bả ữa trình tự 89658 41 Bả ữa trình tự 89658 42 Gm 42 Bả ữa trình tự đoạn genGmDREB2 của các giống đậu tƣơng Việ ự có mã số DQ054363 44 Bảng 3.6. ữa trình tự amin 89658 46 Bảng 3.7. ữa trình tự tƣơng Việ 89658 47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ mô tả gen và vùng mã hóa của gen GmDREB2 ở cây đậu tƣơng 18 Hình 1.2. Sơ đồ mô tả protein DREB2 ở đậu tƣơng 19 Hình 1.3. Trình tự amino acid của vùng AP2 trong protein DREB2 ở đậu tƣơng 19 Hình 2.1. Hạt của hai giống đậu tƣơng nghiên cứu 21 ệ ản phẩ Gm i giống đậ 32 ệ ản phẩm PCR tinh sạch 33 34 Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony- PCR từ khuẩn lạc 35 Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen GmDREB2 36 Hình 3.6. Trình tự đoạn gen DREB2 của hai giống đậu tƣơng nghiên cứu và giống đậu tƣơng trên GenBank có mã số DQ054363 38 Hình 3.7. tƣơng nghiên cứ 89658 . 40 89658 . 41 Hình 3.9. Gm 054363 44 Hình 3.10. 89658 45 89658 47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill ) là loại cây trồng thuộc họ đậu, một trong các loại cây công nghiệp ngắn ngày có vai trò quan trọng không chỉ về mặt kinh tế và dinh dƣỡng mà còn trong việc cải tạo đất. Hạt đậu tƣơng có hàm lƣợng protein cao, từ 20-45%, dễ tan và chứa hầu hết các loại acid amin, đặc biệt là các loại amino acid không thay thế. Ngoài ra, ở rễ cây đậu tƣơng có các nốt sần, đó là kết quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ tạo khả năng cố định nitơ trong không khí. Vì vậy, đậu tƣơng là loại cây trồng có tác dụng cải tạo đất, làm cây trồng vụ sau phát triển tốt hơn, góp phần phá vỡ chu kỳ sâu bệnh, chống ô nhiễm môi trƣờng do lạm dụng phân bón và thuốc trừ sâu [6]. Việt Nam là nƣớc nông nghiệp nhiệt đới, cây đậu tƣơng đƣợc trồng với ba mục đích giải quyết vấn đề thiếu protein cho ngƣời và gia súc, xuất khẩu và cải tạo đất. Trong những năm gần đây do biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán xảy ra thƣờng xuyên làm cho đất nông nghiệp bị hoang hóa, tác động xấu đến sự sinh trƣởng, phát triển, làm giảm năng suất và sản lƣợng cây trồng. Đặc biệt đậu tƣơng là loại cây trồng thuộc nhóm cây chịu hạn kém. Bên cạnh kỹ thuật canh tác, ảnh hƣởng của sâu bệnh và giống thì hạn hán xảy ra là một trong những nguyên nhân làm giảm khả năng sinh trƣởng, phát triển, giảm năng suất, chất lƣợng hạt, vì vậy chọn giống đậu tƣơng theo định hƣớng về tăng cƣờng khả năng chịu hạn cao hoặc cải thiện đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng là yêu cầu thực tiễn đặt ra cho ngành nông nghiệp nói chung và ngành sản xuất đậu tƣơng nói riêng. Đặc tính chịu hạn của là tính trạng đa gen, trong đó có nhóm gen mà sản phẩm của chúng liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện của [...]... giống đậu tƣơng trồng phổ biến ở miền Bắc Việt Nam 2 Mục tiêu nghiên cứu Xác định đƣợc sự sai khác trong trình tự gen DREB2 và protein suy diễn phân lập từ một số giống đậu tƣơng trồng ở miền Bắc Việt Nam 3 Nội dung nghiên cứu (i) Nhân gen, tách dòng và xác định trình tự gen GmDREB2 từ hai mẫu đậu tƣơng nghiên cứu; (ii) So sánh trình tự gen GmDREB2 đã phân lập, trình tự amino acid suy diễn và vùng AP2... cứu và phân lập gen GmDREB2 từ 2 giống đậu tƣơng Bắc Sơn mã số HG965101 [20] và Bắc Giang mã số HG965100 [21] đƣợc công bố trên NCBI với kích thƣớc 480 bp ở 1380 bp [29] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 16 Nhƣ vậy, có rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu phân lập về gen DREB nói chung và gen GmDREB2 nói riêng ở cây đậu tƣơng 1.3.2 DREB2 và gen GmDREB2 Đậu tƣơng là một cây trồng. .. lƣợng đậu tƣơng đứng đầu là: Mỹ, Brazil, Argentina và Trung Quốc Đậu tƣơng là nguồn cung cấp dầu và protein quan trọng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 8 1.1.5.2 Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam Ở Việt Nam, đậu tƣơng đƣợc trồng từ rất lâu, trƣớc cây đậu xanh và các cây họ đậu khác Các giống đậu tƣơng ở nƣớc ta bao gồm các giống đậu tƣơng nhập nội, giống lai tạo, giống đậu. .. gen liên quan đến khả năng chịu hạn của cây Ch nh vì vậy, phân lập và nghiên cứu đặc điểm của gen DREB sẽ cung cấp thông tin và tạo nguyên liệu phục vụ tạo cây chuyển gen nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tƣơng là vấn đề đang đƣợc quan tâm nghiên cứu Từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: So sánh trình tự gen GmDREB2 phân lập từ một số giống đậu tƣơng trồng phổ biến ở. .. (2011) đã nghiên cứu phân lập gen GmDREB5 ở giống đậu tƣơng Vàng Ngân Sơn với kích thƣớc 924 bp mã hóa cho 307 amino acid [31] Nguyễn Vũ Thanh Thanh và cs (2012) đã nghiên cứu phân lập gen DREB5 ở giống đậu tƣơng Xanh Ba Bể đăng ký trên NCBI với mã số HE648567, kích thƣớc 924 bp [32] DREB4 ở 644 bp [28] Arumingtyas và cs (2011) đã nghiên cứu phân lập gen GmDREB2 từ mRNA ở giống đậu tƣơng với kích thƣớc... các trình tự công bố (iii) So sánh trình tự GmDREB2 đã phân lập, trình tự amino acid suy diễn và vùng AP2 của protein DREB2 vớ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu ố http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG 1.1.1 Cây đậu tƣơng Cây đậu tƣơng, là loại cây trồng có lịch sử lâu đời nhất Nhiều bằng chứng về lịch sử và khảo cổ học cho thấy đậu. .. http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 18 thấp GmDREB2A còn cải thiện sốc nhiệt và cải thiện chịu hạn ở cây Arabidopsis biến đổi gen Trong ngân hàng gen quốc tế (GenBank) trình tự gen GmDREB2 đã đƣợc công bố, đó là trình tự gen GmDREB2 của Chen và cs công bố năm 2007 có kích thƣớc 480 bp mã hóa 159 amino acid, mã số trên NCBI là DQ208968 Trình tự gene GmDREB2 của Wang và cs công bố năm 2006 có kích thƣớc 480 bp, mã số trên NCBI là... DQ054363 Thông tin về gen GmDREB2 cho thấy trình tự nucleotide của gen GmDREB2 có số lƣợng nucleotide 480 bp [39], từ vị trí nucleotide thứ 1 đến 480, mã hóa cho 159 amino acid, từ vị trí số 1 đến vị trí amino acid thứ 159 Sơ đồ về gen GmDREB2 đƣợc biểu diễn ở Hình 1.1 Hình 1.1 Sơ đồ mô tả gen và vùng mã hóa của gen GmDREB2 ở cây đậu tƣơng Sơ đồ về protein DREB2 của cây đậu tƣơng ở Hình 1.2 cho thấy... kích hoạt gen DREB2 lúa mì (wDREB2) trong thuốc lá chuyển gen Tạo ra cây thuốc lá biến đổi gen biểu hiện wDREB2, wDREB2 biểu hiện tăng khả năng chịu lạnh và thẩm thấu trong cây thuốc lá [22] Chen và cs (2007), đã phân lập gen GmDREB2 từ đậu tƣơng và dựa trên sự giống nhau về miền AP2, gen GmDREB2 xếp vào phân họ A5 trong nhóm gen DREB Sự biểu hiện của gen GmDREB2 trong môi trƣờng có xử lý bởi hạn hán,... (2007) đã nghiên cứu phân lập gen DREB1 ở cây Địa lan với kích thƣớc 1265 bp đƣợc công bố trên NCBI với mã số EF654657 [25] Lui và cs (2005) đã nghiên cứu phân lập gen DREB3 từ mRNA ở cây đậu tƣơng với kích thƣớc 819bp mã hóa cho 272 acid amin đƣợc công bố trên NCBI với mã số DQ055133 [26] Chen và cs (2013) nghiên cứu phân lập gen GmDREB3 ở cây đậu tƣơng đƣợc công bố trên NCBI với mã số NM001250024 với . lập từ một số giống đậu tƣơng trồng phổ biến ở miền Bắc Việt Nam . 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định đƣợc sự sai khác trong trình tự gen DREB2 và protein suy diễn phân lập từ một số giống đậu. ĐINH THỊ HƢNG SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN GmDREB2 PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƢƠNG TRỒNG PHỔ BIẾN Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN. quả so sánh vùng AP2 của protein DREB2 ở một số giống đậu tƣơng nghiên cứu 41 3.3. SO SÁNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO 42 3.3.1. Kết quả so sánh trình tự gen DREB2 giữa một số giống