ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VƯƠNG CÁT KHÁNH XÂY DỰNG QUY TRÌNH THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH rhG-CSF (Recombinant Human GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR) VÀ MÔ HÌNH KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA rhG-CSF THEO PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ Chuyên ngành: DI TRUYỀN Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐẶNG THỊ PHƯƠNG THẢO TP. Hồ Chí Minh – Năm 2011 i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC HÌNH iii DANH MỤC CÁC BẢNG v LỜI MỞ ĐẦU 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Nhân tố kích thích tạo dòng bạch cầu hạt G-CSF 4 1.1.1. Giới thiệu 4 1.1.2. Chức năng của protein G-CSF 4 1.1.3. Ứng dụng của protein G-CSF trong trị liệu 6 1.1.4. Một số sản phẩm G-CSF thương mại 8 1.2. Thử nghiệm sinh học G-CSF 10 1.2.1. Thử nghiệm sinh học in vitro 10 1.2.2. Thử nghiệm sinh học in vivo 11 1.3. Phương pháp thử nghiệm sinh học G-CSF in vitro 13 1.3.1. Các dòng tế bào được sử dụng cho thử nghiệm sinh học G-CSF in vitro 13 1.3.2. Phương pháp phân tích kết quả thử nghiệm in vitro 14 1.3.3. Ưu - khuyết điểm của thử nghiệm hoạt tính in vitro 18 1.4. Phương pháp thử nghiệm sinh học G-CSF in vivo 18 1.4.1. Các mô hình động vật được sử dụng 18 1.4.2. Các thử nghiệm tác động của G-CSF trên mô hình động vật 20 1.4.3. Phương pháp phân tích kết quả thử nghiệm G-CSF in vivo 21 1.4.4. Ưu - khuyết điểm của thử nghiệm hoạt tính in vivo 22 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 2.1. Vật liệu 24 2.1.1. Dụng cụ và thiết bị 24 2.1.2. Hóa chất 24 2.1.3. Môi trường 28 2.1.4. Nguyên vật liệu 30 2.2. Phương pháp 31 ii 2.2.1. Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF in vitro 31 2.2.2. Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF in vivo 35 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 40 3.1. Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF in vitro 41 3.1.1. Quan sát hình thái và mật độ tế bào M-NFS-60 dưới tác động của protein G-CSF 41 3.1.2. Khảo sát mối tuơng quan giữa khả năng tăng trưởng của tế bào và nồng độ G-CSF 42 3.1.3. Khảo sát mật độ tế bào tiến hành thử nghiệm sinh học 43 3.1.4. Khảo sát thời gian tiến hành thử nghiệm sinh học 45 3.1.4. Đề xuất quy trình xác định hoạt tính G-CSF 47 3.1.5. Đánh giá quy trình xác định hoạt tính G-CSF 50 3.2. Áp dụng quy trình để xác định hoạt tính G-CSF tái tổ hợp 52 3.2.1. Mẫu protein trước tinh chế 53 3.2.2. Mẫu protein sau tinh chế 57 3.2.3. Mẫu protein đông khô 58 3.3. Khảo sát xây dựng quy trình thử nghiệm hoạt tính G-CSF in vivo 60 3.3.1. Khảo sát xây dựng mô hình chuột suy giảm miễn dịch bằng thuốc Cyclophosphamide (CPA) 60 3.3.2. Khảo sát nồng độ G-CSF tối ưu dùng cho thử nghiệm hoạt tính in vivo . 64 3.3.3. Xây dựng mô hình đánh giá tác động của G-CSF theo phác đồ điều trị . 67 3.4. Áp dụng quy trình để đánh giá hoạt tính G-CSF tái tổ hợp in vivo 69 3.4.1. Đánh giá hoạt tính G-CSF tái tổ hợp 69 3.4.2. Đánh giá tác động G-CSF tái tổ hợp theo phác đồ điều trị 71 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 73 4.1. Kết luận 74 4.2. Đề nghị 75 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 PHỤ LỤC 81 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Chế độ điều chỉnh liều G-CSF 7 Bảng 3.2. Giá trị Hill slope và biên độ dao động của các mẫu 44 Bảng 3.3. Giá trị Hill slope và biên độ dao động của các mẫu 46 Bảng 3.4. Kết quả tính LU và IU mẫu G-CSF chuẩn và mẫu G-CSF kiểm tra 51 Bảng 3.5. Kết quả đo OD450 –OD595 các mẫu thử nghiệm 55 Bảng 3.6. Kết quả tính LU và IU mẫu G-CSF chuẩn và mẫu trước tinh chế 57 Bảng 3.7. Kết quả tính LU và IU mẫu G-CSF chuẩn và mẫu sau tinh chế 58 Bảng 3.8. Kết quả tính LU và IU mẫu G-CSF chuẩn và mẫu đông khô 60 Bảng 3.9. Tương quan giữa lượng bạch cầu tổng (%) và nồng độ CPA 61 Bảng 3.10. Tương quan giữa lượng bạch cầu tổng (%) và chế độ tiêm CPA 63 Bảng 3.11. Tương quan giữa % tăng bạch cầu trung tính và nồng độ G-CSF 65 Bảng 3.12. Sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính (%) sau khi tiêm Leukocim theo phác đồ điều trị 68 Bảng 3.13. Lượng bạch cầu trung tính (%) ở các mẫu thử nghiệm 70 Bảng 3.14. Lượng bạch cầu trung tính (%) tương ứng với các mẫu thử nghiệm sau khi tiêm theo phác đồ điều trị. 71 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Vai trò kích thích tạo máu của các nhân tố tăng trưởng 5 Hình 1.2. Một số sản phẩm G-CSF thương mại 8 Hình 1.3. Nguyên tắc chung của phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro 11 Hình 1.4. Quy trình phát triển thuốc tại Mỹ 12 Hình 1.5. Giá trị Hill slope chuẩn trong thử nghiệm sinh học kích thích 15 Hình 1.6. Đường cong tương quan giữa nồng độ mẫu và mức đáp ứng của tế bào .16 Hình 1.7. Giá trị ED99, ED90, ED50 biểu thị trên đường cong tương quan giữa sự tăng trưởng tế bào và nồng độ mẫu 17 Hình 1.8. Các động vật được sử dụng làm mô hình thí nghiệm 19 Hình 2.9. Phản ứng dehydrogenase ở tế bào sống biến đổi WTS-8 thành sản phẩm màu (formazan) 27 Hình 2.10. Đường cong tăng trưởng tế bào trong nuôi cấy in vitro 33 Hình 2.11. Quy trình tiêm thuốc và khảo sát số lượng bạch cầu ở chế độ tiêm một lần. 36 Hình 2.12. Quy trình tiêm thuốc và khảo sát số lượng bạch cầu ở chế độ tiêm liên tục. 37 Hình 2.13. Quy trình tiêm thuốc và khảo sát số lượng bạch cầu ở chế độ tiêm không liên tục 37 Hình 3.14. Tác động kích thích tăng sinh dòng tế bào M-NFS-60 của các mẫu 41 Hình 3.15. Xác định mật độ tế bào bằng CCK-8 42 Hình 3.16. Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa khả năng tăng trưởng tế bào và nồng độ G-CSF 43 Hình 3.17. Đồ thị thể hiện sự tăng trưởng của dòng tế bào M-NFS-60 tương ứng dãy nồng độ G-CSF với mật độ tế bào ban đầu là 5.10 4 , 10 5 , và 5.10 5 tế bào/ml 44 Hình 3.18. Đồ thị thể hiện tác động của thời gian tiến hành thử nghiệm sinh học lên dòng tế bào M-NFS-60 46 iv Hình 3.6. Tác động của các mẫu đến hình thái và mật độ tế bào 50 Hình 3.7.A. Đường cong tương quan giữa mức độ tăng sinh tế bào và nồng độ mẫu protein 51 Hình 3.7.B. So sánh tác động kích thích tăng sinh tế bào giữa các mẫu BSA, Neupogen và mẫu chuẩn Leukocim 51 Hình 3.8. Tác động của các mẫu G-CSF đến hình thái và mật độ tế bào 54 Hình 3.9. Kết quả kiểm tra mẫu D 54 Hình 3.10. Kết quả định tính mẫu G-CSF 55 Hình 3.11. Đường cong tương quan giữa mức độ tăng sinh tế bào và nồng độ mẫu G-CSF 56 Hình 3.12. Đường cong tương quan giữa mức độ tăng sinh tế bào và nồng độ mẫu G-CSF chuẩn và nồng độ mẫu sau tinh chế 58 Hình 3.13. Đường cong tương quan giữa mức độ tăng sinh tế bào với nồng độ mẫu G-CSF chuẩn và mẫu đông khô 59 Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu tổng theo nồng độ CPA 62 Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn sự thay đ ổi sốlượng bạch cầu tổng theo chế độ tiêm CPA 64 Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính tương ứng với nồng độ G-CSF 66 Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính sau khi tiêm Leukocim theo phác đồ điều trị 68 Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính tương ứng với các mẫu thử nghiệm 70 Hình 3.19. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính sau khi tiêm theo phác đồ điều trị tương ứng với các mẫu thử nghiệm 72 Trang 1 Lời mở đầu Luận văn Thạc sĩ Sinh học LỜI MỞ ĐẦU Neutropenia là hiện tượng suy giảm bạch cầu trung tính, gây suy yếu hệ thống miễn dịch của cơ thể. Trong số các nguyên nhân gây neutropenia, hóa trị và xạ trị ung thư là nguyên nhân chủ yếu nhất. Hiện nay, ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Tỷ lệ mắc bệnh ung thư đang có xu hướng gia tăng dẫn đến con số bệnh nhân mắc phải neutropenia sẽ tăng cao đột biến trong tương lai sắp tới. Ngoài những tác hại chủ yếu như làm suy giảm hệ thống miễn dịch của cơ thể, khiến cho bệnh nhân dễ dàng bị nhiễm khuẩn, mắc phải các căn bệnh cơ hội, neutropenia còn gây ảnh hưởng không nhỏ đến việc điều trị ung thư. Trước tiên neutropenia làm gián đoạn phác đồ trị liệu ung thư, kéo dài thời gian bệnh. Sau đó, sẽ làm tăng chi phí chữa trị, nhất là chi phí nằm viện. Trong các phương pháp điều trị neutropenia như cấy ghép tủy, sử dụng kháng sinh…, việc sử dụng nhân tố kích thích tạo dòng bạch cầu hạt G-CSF đang là một liệu pháp hữu hiệu và phổ biến với các ưu điểm: chi phí thấp, tác dụng tốt, thời gian trị bệnh ngắn. G-CSF là một cytokine có bản chất glycoprotein có chức năng chính trong sự điều hoà sản xuất bạch cầu hạt trung tính thông qua kích thích tăng sinh và biệt hoá của các tế bào tiền thân bạch cầu hạt trung tính. Vì thế, việc sử dụng G-CSF trong phòng bệnh cũng như trị liệu neutropenia đang được phát triển mạnh. Các sản phẩm thuốc G-CSF có khả năng làm giảm nguy cơ bệnh neutropenia đến 50%. Ngoài khả năng kích thích sản xuất giúp phục hồi số lượng bạch cầu hạt trung tính, G-CSF còn tác động lên chức năng của bạch cầu hạt trung tính như tăng cường hoạt tính thực bào, khả năng diệt vi khuẩn do đó gián tiếp giúp cơ thể chống lại nguy cơ nhiễm. Các chế phẩm G-CSF sẽ là triển vọng cho điều trị neutropenia, đặc biệt là kết hợp trong hoá trị liệu ung thư. Hiện nay thuốc G-CSF được lưu hành tại Việt Nam chủ yếu là nhập từ nước ngoài có giá khá cao so với thu nhập của người dân nên gây hạn chế trong việc sử dụng điều trị rộng rãi. Việc bản quyền sản xuất G-CSF của công ty Amgen đã hết hạn vào tháng 3/2006 đã mở ra cơ hội lớn cho các nước đang phát triển trong đó có Trang 2 Lời mở đầu Luận văn Thạc sĩ Sinh học Việt Nam tiếp cận và nghiên cứu sản xuất G-CSF phục vụ cho nhu cầu trong nước với giá thành thấp. Trước tình hình thực tiễn này, Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử A, trường ĐH Khoa học Tự nhiên đã tiến hành đề tài nghiên cứu sản xuất protein G-CSF tái tổ hợp. Với đặc tính là một protein trị liệu sử dụng trên người, theo các quy định của dược điển, sản phẩm tạo ra phải đáp ứng các chỉ tiêu như: hàm lượng, cấu trúc, độ tinh sạch, hoạt tính sinh học… Trong đó hoạt tính sinh học là một chỉ tiêu quan trọng đảm bảo chất lượng sản phẩm trước khi thương mại hóa. Đây là điều kiện tiên quyết trong các quá trình sản xuất thuốc cho người. Nằm trong khuôn khổ của đề tài, luận văn này được thực hiện với mục đích xây dựng các quy trình thử nghiệm hoạt tính G-CSF tái tổ hợp nhằm phục vụ cho việc kiểm soát chất lượng sản phẩm G-CSF trong các giai đoạn của quy trình sản xuất thuốc. Với mục tiêu trên, chúng tôi thực hiện luận văn gồm các nội dung sau: - Khảo sát xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF in vitro. - Áp dụng quy trình để đánh giá hoạt tính G-CSF tái tổ hợp trong các giai đoạn sản xuất. - Khảo sát xây dựng mô hình chuột suy giảm miễn dịch dùng cho thử nghiệm in vivo. - Khảo xát xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF in vivo và mô hình đánh giá tác dụng điều trị bệnh của G-CSF. - Áp dụng quy trình để đánh giá hoạt tính và tác dụng điều trị bệnh của thuốc trên cơ thể động vật. CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang 4 Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học 1.1. Nhân tố kích thích tạo dòng bạch cầu hạt G-CSF 1.1.1. Giới thiệu Tất cả các tế bào máu trong cơ thể đều được hình thành từ tế bào gốc tạo máu ở tủy xương thông qua quá trình tạo máu. Quá trình này được điều hòa chặt chẽ bởi nhiều loại cytokine như interleukin, erythropoietin và các CSF (Colony stimulating factors) [11]. Các CSF có bản chất là glycoprotein, có vai trò tương tác với các thụ thể chuyên biệt trên các tế bào gốc tạo máu để điều hòa sự tồn tại, tăng sinh, biệt hóa và hoạt hóa chức năng của các tế bào này. Các CSF được chia thành ba loại: - G-CSF (Granulocyte-colony stimulating factor) - GM-CSF (Granulocyte macrophage-colony stimulating factor) - M-CSF (Macrophage-colony stimulating factor) Trong đó, G-CSF là một cytokine được sản xuất bởi các bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, nguyên bào sợi và các tế bào nội mô. G-CSF đảm nhận nhiều chức năng trong quá trình kích thích tạo máu như điều hòa sản xuất bạch cầu trung tính và giải phóng chúng từ tủy xương, tăng sinh và biệt hóa các tế bào tiền thân của bạch cầu trung tính cũng như hoạt hóa chức năng của chúng [10]. 1.1.2. Chức năng của protein G-CSF G-CSF là nhân tố duy nhất có khả năng kích thích sự tăng sinh và trưởng thành cuối cùng của các tế bào tủy tiền thân. Đối tượng tác động của G-CSF gồm nhiều tế bào khác nhau như các tế bào tiền thân tạo máu, tế bào bạch cầu tủy, tế bào bạch cầu hạt trung tính, và một số loại tế bào không tạo máu khác. Trong quá trình kích thích tạo máu Thành phần tế bào của máu gồm 3 nhóm: hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu, bắt nguồn từ tế bào gốc trải qua các quá trình biệt hoá để tạo thành các tế bào máu. G- CSF được xác định là nhân tố kích thích sự tăng trưởng của dòng bạch cầu hạt trung tính, giúp cho sự tồn tại, kích thích sự phát triển và đẩy mạnh sự biệt hóa của các tế bào tiền thân thành tế bào bạch cầu hạt trung tính (Hình 1.1). [...]... tinh và gen người là tương đồng với nhau Bước cuối cùng của giai đoạn thử nghiệm in vivo chính là trên cơ thể các bệnh nhân tình nguyện 1.4.2 Các thử nghiệm tác động của G -CSF trên mô hình động vật Thử nghiệm tác động của G -CSF trong điều kiện in vivo bao gồm nhiều thử nghiệm khác nhau: Thử nghiệm tính gây độc Với bản chất là một loại protein được sản xuất bởi hệ thống biểu hiện là E.coli, G -CSF có... khuyết điểm của thử nghiệm hoạt tính in vivo 1.4.4.1 Ưu điểm Quá trình tạo máu là một quá trình xảy ra trong cơ thể động vật, chịu ảnh hưởng của nhiều tác nhân Do đó nếu chỉ khảo sát ở mức độ in vitro, các tác động của thuốc vẫn chưa được đánh giá hết Sử dụng thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật có thể đánh giá những tác động của thuốc khi tiêm vào cơ thể bệnh nhân cũng như tương tác của thuốc với... sử dụng thuốc thử, các chất đồng vị phóng xạ [28] 1.2.2 Thử nghiệm sinh học in vivo Để thu được thông tin cụ thể và chính xác về tác động cytokine đối với cơ thể, người ta thực hiện thử nghiệm sinh học in vivo Trong phương pháp này, người ta thực hiện tiêm trực tiếp cytokine vào cơ thể người hay động vật thí nghiệm và khảo sát tác động sinh học của nó Thử nghiệm hoạt tính G -CSF trong điều kiện in vivo... nghiệm sinh học định tính hoặc đo đạc khả năng đáp ứng sinh học, so sánh và ước tính nồng độ, hoạt độ của chất gọi là thử nghiệm sinh học định lượng Thử nghiệm sinh học có thể được phân loại dựa trên điều kiện thực hiện thử nghiệm Thử nghiệm sinh học in vitro thực hiện ở phòng thí nghiệm, cô lập và nuôi cấy tế bào không nằm trong điều kiện và vi môi trường tự nhiên của nó và thử nghiệm sinh học in vivo... điểm của thử nghiệm hoạt tính in vitro 1.3.3.1 Ưu điểm Thử nghiệm hoạt tính in vitro là một phương pháp đơn giản, ít tốn kém và hiệu quả để xác định hoạt tính của thuốc Điều kiện tiến hành thử nghiệm dễ dàng, nhanh chóng, có thể tiến hành cùng lúc một số lượng mẫu lớn Do tiến hành trên từng dòng tế bào nên thuận lợi trong việc phân tích đánh giá kết quả thử nghiệm cũng như kiểm soát và điều chỉnh quy trình. .. thể khảo sát ảnh hưởng của thuốc qua các thế hệ khác nhau - Bộ gen của chuột và người có mức độ tương đồng cao, khoảng 85%, tương ứng với 20.000 – 25.000 gen - Có nhiều vị trí khác nhau trên cơ thể để thu nhận nguồn máu, thực hiện các xét nghiệm khác nhau Việc lựa chọn mô hình động vật thử nghiệm còn phụ thuộc vào mục đích của thử nghiệm Quá trình thử nghiệm thuốc trong điều kiện in vivo phải tuân theo. .. Đối tượng thử nghiệm là dòng tế bào nên không thể đánh giá được tác động của thuốc bên trong cơ thể cũng như hiệu quả điều trị, các tác dụng phụ của thuốc Chỉ có thể xác định thông số duy nhất là đơn vị hoạt tính mà không thể xác định được các đặc tính sinh học khác của thuốc như các thông số dược động học, tính gây độc 1.4 Phương pháp thử nghiệm sinh học G -CSF in vivo 1.4.1 Các mô hình động vật được... (intraperitoneal – IP) Thử nghiệm tác động của thuốc lên số lượng và chức năng của bạch cầu hạt trung tính Để thực hiện được thử nghiệm này cần phải có mô hình động vật suy giảm miễn dịch Từ những mô hình này, tiến hành sử dụng G -CSF như thuốc phục hồi miễn dịch Các động vật được lựa chọn để sử dụng cho thử nghiệm này đều có thành phần máu và tỷ lệ % các loại tế bào máu tương đối giống người Vì vậy, dựa vào sự tăng... Phương pháp thử nghiệm hoạt tính G -CSF in vivo được tiến hành trên cơ thể các động vật thí nghiệm dựa trên cơ sở chính là chức năng của G -CSF, trong đó chức năng quan trọng nhất là kích thích tăng sinh số lượng bạch cầu trung tính Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trang 19 Do đó, bước đầu tiên trong quá trình thử nghiệm chính là xây dựng mô hình động vật bị bệnh Neutropenia hoặc mô hình động vật... hành trên cơ thể động vật nên có thể khảo sát một số đặc tính của thuốc như thời gian lưu trong máu, thời gian bán rã của thuốc trong huyết thanh, quá trình hấp thụ thuốc ở ruột, quá trình lọc và tích tụ thuốc ở gan và thận Từ đó tiến đến khảo sát đưa ra phác đồ điều trị hiệu quả trên các bệnh nhân khác nhau 1.4.4.2 Khuyết điểm Phải thực hiện trên quy mô số lượng lớn động vật thí nghiệm Điều này gây khó . KHÁNH XÂY DỰNG QUY TRÌNH THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH rhG-CSF (Recombinant Human GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR) VÀ MÔ HÌNH KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA rhG-CSF THEO PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ Chuyên. điểm của thử nghiệm hoạt tính in vitro 18 1.4. Phương pháp thử nghiệm sinh học G-CSF in vivo 18 1.4.1. Các mô hình động vật được sử dụng 18 1.4.2. Các thử nghiệm tác động của G-CSF trên mô hình. giá hoạt tính G-CSF tái tổ hợp trong các giai đoạn sản xuất. - Khảo sát xây dựng mô hình chuột suy giảm miễn dịch dùng cho thử nghiệm in vivo. - Khảo xát xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính