ĐẠI HỌC QUỐC GIA THNH PHỐ H CH MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN NGỌC NHƯ BĂNG THU NHẬN TẾ BÀO GỐC TỪ MÔ NHUNG HƯƠU SAO VIT NAM (Cervus nippon pseudaxis) Chuyên ngành: SINH L ĐNG VT M s: 60 42 30 LUN VĂN THẠC S SINH HỌC NGƯI HƯNG DN KHOA HỌC: 1. TS. Trn Hong Dng 2. TS. Lê Thanh Hưng THNH PHỐ H CH MINH – 2010 LỜI CẢM ƠN Trong sut thi gian hc tp v nghiên cu, tôi đ nhn đưc nhiu s quan tâm, gip đ t gia đnh, thy cô v bn b. Để có đưc kết quả như ngày hôm nay, tôi xin gửi li cảm ơn chân thnh v sâu sắc đến: B Mẹ v gia đình đ luôn l chỗ da vững chắc cho tôi, luôn ở bên, động viên và ủng hộ tôi. Thy Trn Hong Dng v Thy Lê Thanh Hưng l những ngưi đã đ ịnh hướng và tn tình chỉ dẫn, động viên tôi trong sut quá trình thc hiện lun văn, luôn to mi điu kiện tt nhất gip tôi hon thnh tt công việc. Thy Phan Kim Ngc, ngưi luôn cho tôi những li khuyên cùng kinh nghiệm quí báu. Riêng Thy là một tấm gương cho s say mê và nhiệt huyết của ngưi nghiên cu khoa hc. Các thy cô trong Khoa Sinh hc đã dy dỗ và truyn đt cho tôi những kiến thc bổ ích trong sut qu trnh thc hiện nghiên cu. Các anh chị và các bn trong Bộ môn Sinh l hc – Công nghệ sinh hc động vt v Phng th nghiệm Nghiên cu v ng dng Tế bo gc đ luôn động viên, chia sẻ v gip đ tôi hết lòng. Một ln nữa tôi xin chân thành cảm ơn mi ngưi đã hết lòng giúp đ  tôi hoàn tất lun văn ny! TP. Hồ Ch Minh, thng 07 năm 2010 Nguyễn Ngc Như Băng Mc lc i Nguyn Ngc Như Băng MC LC Trang MC LC i DANH MC CC CÔNG TRNH CA TC GI iv DANH MC CC CH VIT TT v DANH MC BNG vii DANH MC HNH V, Đ TH viii M ĐU 1 Chương 1. TNG QUAN 1.1. Khi qut v nhung hươu 3 1.1.1. Sơ lưc v hươu sao Vit Nam 3 1.1.2. Sinh hc nhung hươu 4 1.1.2.1. Khi nim 4 1.1.2.2. Cc giai đon pht trin ca sng hươu 4 1.1.2.3. Thnh phn ha hc chnh trong nhung hươu 6 1.1.3. Mt s tc dng dưc l ca nhung hươu 6 1.2. Tnh hnh nghiên cu nhung hươu trong v ngoi nưc 8 1.2.1. Cc nghiên cu v nhung hươu thc hin  Vit Nam 8 1.2.2. Cc nghiên cu v nhung hươu thc hin trên th gii 10 1.3. T bo gc nhung hươu v tim năng ng dng ca t bo 12 1.3.1. Khi qut v t bo gc 12 1.3.2. T bo gc nhung hươu – lưc s nghiên cu v 13 Mc lc ii Nguyn Ngc Như Băng Chương 2. VT LIU – PHƯƠNG PHP 2.1. Vt liu nghiên cu v tin trnh nghiên cu 19 2.1.1. Vt liu nghiên cu 19 2.1.2. Tin trnh nghiên cu 19 2.2. Dng c v thit b 20 2.3. Hóa chất 21 2.4. Các phương php thc nghim 25 2.4.1. Phương php thu nhn mẫu mô nhung hươu 25 2.4.2. Thu nhn t bo đơn từ mẫu mô nhung hươu 26 2.4.3. Nuôi cấy t bo đơn 28 2.4.4. Phương php nuôi cấy tăng sinh t bo v cấy chuyn 28 2.4.4.1. Quy trình cấy chuyền t bo 28 2.4.4.2. Phương php xc định các chỉ số t bào 29 2.4.5. Chng minh cc t bo thu nhn từ mẫu mô 30 2.4.5.1. Kim chng kh năng tăng sinh di hn – kh năng 30 2.4.5.2. Kim chng kh năng bit ha 30 Chương 3. KT QU – BIN LUN 3.1. Kt quả thu nhn mẫu mô nhung hươu 34 3.2. Kt quả thu nhn t bo đơn từ mẫu mô nhung hươu 35 3.3. Kt quả nuôi cấy sơ cấp t bo nhung hươu 37 3.4. Kt quả cấy chuyn và nuôi cấy tăng sinh t bo nhung hươu 43 3.5. Kt quả chng minh tnh gc ca cc t bo 50 3.5.1. Kh năng tăng sinh di hn – kh năng t lm mi 50 Mc lc iii Nguyn Ngc Như Băng 3.5.2. Kh năng bit hóa 51 3.5.2.1. Kt qu bit hóa thành t bào to xương 51 3.5.2.2. Kt qu bit hóa thành t bào to mỡ 54 3.6. Bin lun chung 57 Chương 4. KT LUN – Đ NGH 4.1. Kt lun 64 4.2. Đ ngh 65 TI LIU THAM KHO 66 Danh mc cc hnh v, đ th viii Nguyn Ngc Như Băng DANH MC CC HNH V, Đ TH Hình 1.1. Hươu sao v nhung hươu 3 Hình 1.2. Mt ct vng đnh đang tăng trưng ca nhung hươu 14 Hình 1.3. Các tế bo STRO – 1 + trong những vng khác nhau ca cuống 17 Hình 2.1. Sơ đ mô t các ni dung nghiên cu 19 Hình 2.2. Mẫu mô nhung hươu sao 20 Hình 2.3. Phn ngn ca nhung hươu 25 Hình 2.4. Quy trình đông lạnh mẫu mô nhung hươu 26 Hình 2.5. Quy trình thu nhận tế bo đơn từ mẫu mô nhung hươu 27 Hình 2.6. Quy trình nuôi cấy tế bo đơn 28 Hình 2.7. Quy trình cấy chuyền tế bo 29 Hình 2.8. Quy trình biệt hóa tế bo 30 Hình 2.9. Quy trình nhum Alizarin Red S 31 Hình 2.10. Quy trình nhum Oil Red O 33 Hình 3.1. Phn ngn ca nhung hươu 34 Hình 3.2. Mẫu mô nhung hươu được ct thành những mnh nhỏ 34 Hình 3.3. Các mnh mô nhung hươu có kích thước 2 – 4 mm 2 35 Hình 3.4. Các tế bo đơn thu nhận từ mô nhung hươu 37 Hình 3.5. Tế bo nhung hươu sau 24 giờ nuôi cấy 38 Hình 3.6. Tế bo nhung hươu sau 48 giờ nuôi cấy 39 Hình 3.7. Tế bào nhung hươu sau 72 giờ nuôi cấy 40 Hình 3.8. Tế bo nhung hươu sau 4 ngày nuôi cấy 41 Hình 3.9. Tế bo nhung hươu sau 7 ngy nuôi cấy 41 Danh mc cc hnh v, đ th ix Nguyn Ngc Như Băng Hình 3.10. Tế bo nhung hươu sau 10 ngy nuôi cấy 42 Hình 3.11. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền 0 giờ 44 Hình 3.12. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền 24 giờ 45 Hình 3.13. Tế bo nhung hươu sau khi cấy chuyền ngày 7 45 Hình 3.14. Tế bo nhung hươu qua 2 ln cấy chuyền 46 Hình 3.15. Tế bo nhung hươu qua 3 ln cấy chuyền 46 Hình 3.16. Tế bo nhung hươu qua 4 ln cấy chuyền 47 Hình 3.17. Tế bo nhung hươu qua 5 ln cấy chuyền 47 Hình 3.18. Các tế bo nhung hươu trước khi bt đu cm ng biệt hóa 51 Hình 3.19. Các tế bo nhung hươu sau 15 ngy 52 Hình 3.20. Các tế bo nhung hươu sau 20 ngy 52 Hình 3.21. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày 53 Hình 3.22. Các tế bo nhung hươu tích tụ git mỡ 55 Hình 3.23. Các tế bo nhung hươu sau 20 ngày 55 Hình 3.24. Các git mỡ tích tụ trong tế bo chất 56 Hình 3.25. Các tế bo nhung hươu sau 20 ngày 56 Hình 3.26. Tế bo nhung hươu 58 Hình 3.27. Tế bo nhung hươu 58 Hình 3.28. Tế bo nhung hươu sau khi cm ng biệt hóa tạo xương 60 Hình 3.29. Tế bo nhung hươu sau khi cm ng biệt hóa tạo mỡ 61 Hình 3.30. Tế bo nhung hươu 62 Đ thị 3.1. Sự tăng trưng ca tế bo nhung hươu 48 Đ thị 3.2. Đường cong tăng trưng ca tế bào nhung hươu dựa trên 49 Danh mc cc bng vii Nguyn Ngc Như Băng DANH MC CC BNG Bng 2.1. Danh mc cc dng c s dng trong đ ti 20 Bng 2.2. Danh mc cc thit b s dng trong đ ti 21 Bng 2.3. Danh mc cc ha cht s dng trong đ ti 21 Bng 3.1. Kt qu thu nhận t bo đơn từ mẫu mô nhung hươu tươi 36 Bng 3.2. Kt qu thu nhận t bo đơn từ mẫu mô nhung hươu đông lạnh 36 Bng 3.3. Số lượng mẫu nuôi sơ cp 38 Bng 3.4. Kt qu nuôi cy sơ cp t bo thu nhận từ nhung hươu 42 Bng 3.5. Kt qu nuôi tăng sinh t bo nhung hươu 48 Danh mc cc công trnh ca tc gi iv Nguyn Ngc Như Băng DANH MC CC CÔNG TRNH CA TC GI 1. Lê Quang Hưng, Nguyễn Ngọc Như Băng, Trần Lê Bảo Hà, Phan Kim Ngọc (2006), Khảo sát sự tăng trưởng của tế bào sừng người trong điều kiện in vitro, Hội nghị Khoa hc lần thứ 5, Trường Đại hc Khoa hc Tự nhiên, Tiu ban Sinh hc – Công ngh sinh hc. 2. Nguyễn Tiến Bằng, Nguyễn Ngọc Như Băng, Bùi Thị Ngọc Ánh, Phan Kim Ngọc (2008), Khảo sát hoạt tính kháng phân bào của cao chiết trái ớt (Capsicum frutescens) lên dòng tế bào ung thư gan Hep G2, Tp tm tt bo cáo, Hội nghị Khoa hc lần thứ 6, Trường Đại hc Khoa hc Tự nhiên, Tiu ban Sinh hc – Công ngh sinh hc, 295. 3. Lê Thanh Hưng, Nguyễn Ngọc Như Băng , Nguyễn Tiến Bằng (2009), Nghiên cu s dng hn hp mui sodium lactate và sodium acetate trong bảo quản chả la, Tuyn tp Hội nghị Công ngh sinh hc ton quc Khu vực pha Nam, 781 – 786. 4. Nguyễn Ngọc Như Băng , Trần Hoàng Dng , Lê Thanh Hưng (2010), Th nghiệm s dng nhung hươu sao (Cervus nippon pseudaxis) tạo mt s dạng thực phm chc năng, Tạp ch Khoa hc v Công ngh, 48 (2A), 615 – 622. Danh mc cc hnh v, đ th viii Nguyn Ngc Như Băng DANH MC CC HNH V, Đ TH Hình 1.1. Hươu sao v nhung hươu 3 Hình 1.2. Mt ct vng đnh đang tăng trưng ca nhung hươu 14 Hình 1.3. Các tế bo STRO – 1 + trong những vng khác nhau ca cuống 17 Hình 2.1. Sơ đ mô t các ni dung nghiên cu 19 Hình 2.2. Mẫu mô nhung hươu sao 20 Hình 2.3. Phn ngn ca nhung hươu 25 Hình 2.4. Quy trình đông lạnh mẫu mô nhung hươu 26 Hình 2.5. Quy trình thu nhận tế bo đơn từ mẫu mô nhung hươu 27 Hình 2.6. Quy trình nuôi cấy tế bo đơn 28 Hình 2.7. Quy trình cấy chuyền tế bo 29 Hình 2.8. Quy trình biệt hóa tế bo 30 Hình 2.9. Quy trình nhum Alizarin Red S 31 Hình 2.10. Quy trình nhum Oil Red O 33 Hình 3.1. Phn ngn ca nhung hươu 34 Hình 3.2. Mẫu mô nhung hươu được ct thành những mnh nhỏ 34 Hình 3.3. Các mnh mô nhung hươu có kích thước 2 – 4 mm 2 35 Hình 3.4. Các tế bo đơn thu nhận từ mô nhung hươu 37 Hình 3.5. Tế bo nhung hươu sau 24 giờ nuôi cấy 38 Hình 3.6. Tế bo nhung hươu sau 48 giờ nuôi cấy 39 Hình 3.7. Tế bào nhung hươu sau 72 giờ nuôi cấy 40 Hình 3.8. Tế bo nhung hươu sau 4 ngày nuôi cấy 41 Hình 3.9. Tế bo nhung hươu sau 7 ngy nuôi cấy 41 [...]... ix Hình 3.10 Tế bào nhung hươu sau 10 ngày nuôi cấy 42 Hình 3.11 Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền 0 giờ 44 Hình 3.12 Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền 24 giờ 45 Hình 3.13 Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền ngày 7 45 Hình 3.14 Tế bào nhung hươu qua 2 lần cấy chuyền 46 Hình 3.15 Tế bào nhung hươu qua 3 lần cấy chuyền 46 Hình 3.16 Tế bào nhung hươu qua 4 lần... 47 Hình 3.17 Tế bào nhung hươu qua 5 lần cấy chuyền 47 Hình 3.18 Các tế bào nhung hươu trước khi bắt đầu cảm ứng biệt hóa 51 Hình 3.19 Các tế bào nhung hươu sau 15 ngày 52 Hình 3.20 Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày 52 Hình 3.21 Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày 53 Hình 3.22 Các tế bào nhung hươu tích tụ giọt mỡ 55 Hình 3.23 Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày... sâu hơn được thực hiện 1.3 Tế bào gốc nhung hươu và tiềm năng ứng dụng của tế bào gốc nhung hươu 1.3.1 Khái quát về tế bào gốc Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa của cơ thể Những tế bào này có khả năng tự làm mới và biệt hóa thành các tế bào chuyên hóa với các chức năng riêng biệt [8], [16], [18], [46], [76] Khác với các loại tế bào khác của cơ thể, tất cả các tế bào gốc nói chung đều có hai đặc... từ vùng mô đang tăng trưởng của nhung hươu sao Việt Nam 2 Thu nhận các tế bào gốc ứng viên từ các các tế bào đơn nhung hươu được nuôi cấy dài hạn 3 Chứng minh các tế bào gốc ứng viên thu nhận được biểu hiện đặc điểm của tế bào gốc Nguyễn Ngọc Như Băng từ mô nhung hươu Tổng quan 3 1.1 Khái quát về nhung hươu 1.1.1 Sơ lược về hươu sao Việt Nam Tên thông thường: Hươu sao. .. tôi đưa ra đề tài Thu nhận tế bào gốc từ mô nhung hươu sao Việt Nam (Cervus nippon pseudaxis) Ở Việt Nam , nhung hươu đã đư ợc sử dụng từ rất lâu đời, nhưng các nghiên cứu in vitro về tế bào nhung hươu vẫn còn là một lĩnh vực khá mới mẻ Với mục đích chính là bước đầu tiếp cận nghiên cứu in vitro tế bào nhung hươu, đề tài này được tiến hành với các mục tiêu như sau: 1 Thu nhận và nuôi... sinh ở sừng hươu liên quan đến sự biệt hóa tế bào Nghiên cứu này cho rằng sự tái sinh sừng hươu là một hiện tượng dựa vào tế bào gốc, và phụ thu c vào sự hoạt động theo chu kỳ của các tế bào gốc nằm trong màng xương của cuống Cũng trong năm 2007, Berg D.K và cộng sự đã tiến hành nhân bản hươu đỏ từ tế bào gốc nhung hươu và các tế nào con cháu của chúng [17] Dòng tế bào cho được phân lập từ màng xương... điều hòa bởi tế bào gốc Tuy nhiên, cơ chế của nó vẫn chưa được hiểu rõ [34], [49], [69] Các nghiên cứu về tế bào gốc nhung hươu bắt đầu bằng việc nuôi cấy các tế bào được thu nhận từ vùng mô đang tăng sinh, khảo sát tác động của các nhân tố tăng trưởng lên sự phát triển của các tế bào này trong điều kiện in vitro [37] Bên cạnh đó, các nghiên cứu mô học của nhung hươu được tiến hành để từ đó tìm ra... thường: Hươu sao Việt Nam Tên khoa học: Cervus nippon pseudaxis Loài: Cervus nippon Giống: Cervus Họ: Cervidae Bộ: Artiodactyla Lớp: Mammalia Ngành: Chordata Giới: Animalia Hình 1.1 Hươu sao và nhung hươu Nguyễn Ngọc Như Băng Tổng quan 4 Hươu sao (còn được biết với tên gọi là hươu Nhật Bản) có nguồn gốc từ các nước Đông Á Hiện nay, hươu sao được chia thành 12 loài phụ Hươu sao Việt Nam là một trong... hoàn toàn phù hợp với giả thuyết sự tái sinh sừng được xây dựng từ các tế bào gốc hoặc tế bào tiền thân trung mô nằm ở lớp trong màng xương của sừng Các tác giả này cho rằng ổ tế bào gốc nằm ở lớp trong màng xương của sừng và sự tái sinh sừng phụ thu c vào sự hoạt động có tính chu kỳ của các tế bào gốc đó Trong cuống sừng, các tế bào STRO – 1+ cũng luôn nằm cạnh các sợi mô cơ (mô cơ xương trán) Trong... 56 Hình 3.25 Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày 56 Hình 3.26 Tế bào nhung hươu 58 Hình 3.27 Tế bào nhung hươu 58 Hình 3.28 Tế bào nhung hươu sau khi cảm ứng biệt hóa tạo xương 60 Hình 3.29 Tế bào nhung hươu sau khi cảm ứng biệt hóa tạo mỡ 61 Hình 3.30 Tế bào nhung hươu 62 Đồ thị 3.1 Sự tăng trưởng của tế bào nhung hươu 48 Đồ thị . Hình 2.2. Mẫu mô nhung hươu sao 20 Hình 2.3. Phn ngn ca nhung hươu 25 Hình 2.4. Quy trình đông lạnh mẫu mô nhung hươu 26 Hình 2.5. Quy trình thu nhận tế bo đơn từ mẫu mô nhung hươu 27 Hình. Hình 2.2. Mẫu mô nhung hươu sao 20 Hình 2.3. Phn ngn ca nhung hươu 25 Hình 2.4. Quy trình đông lạnh mẫu mô nhung hươu 26 Hình 2.5. Quy trình thu nhận tế bo đơn từ mẫu mô nhung hươu 27 Hình. ca nhung hươu 34 Hình 3.2. Mẫu mô nhung hươu được ct thành những mnh nhỏ 34 Hình 3.3. Các mnh mô nhung hươu có kích thước 2 – 4 mm 2 35 Hình 3.4. Các tế bo đơn thu nhận từ mô nhung hươu