BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN COL1A1 GÂY BỆNH TẠO XƯƠNG BẤT TOÀN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHãA 2008 - 2012 HÀ NỘI – 2012 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN COL1A1 GÂY BỆNH TẠO XƯƠNG BẤT TOÀN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHãA 2008 - 2012 Giáo viên hướng dẫn: GS.TS. TẠ THÀNH VĂN HÀ NỘI – 2012 2 Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự do – Hạnh phúc *** LỜI CAM ĐOAN Kính gửi: Phòng Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, tất cả các số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác. Hà nội, ngày 27 tháng 06 năm 2012 Người viết khóa luận Nguyễn Thị Huyền Trang 3 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh xương bất toàn có tên tiếng Anh là Osteogenesis Imperfecta, viết tắt là OI, còn gọi là bệnh xương thủy tinh hay bệnh giòn xương. Đây là bệnh phổ biến nhất trong các rối loạn di truyền về xương. Tần suất mắc bệnh khoảng 1/15.000 – 1/25.000 trẻ sinh ra và chủ yếu là di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường [5]. Đặc điểm điển hình của bệnh là hệ xương không được hình thành một cách hoàn chỉnh. Nguyên nhân chính là do đột biến gen tổng hợp collagen týp I dẫn đến thiếu hụt hoặc bất thường cấu trúc phân tử collagen týp I, làm xương giòn và dễ gãy khi có va chạm như ho, hắt hơi hoặc ngay cả khi không có sang chấn. Bệnh không chỉ biểu hiện bất thường ở xương mà còn bất thường ở các tổ chức khác như: da, dây chằng, củng mạc mắt, răng… Trên lâm sàng, bệnh được chia làm 4 týp khác nhau tùy thuộc vào mức độ nặng nhẹ. Tuy nhiên, giòn xương, gãy nhiều xương, biến dạng xương là triệu chứng phổ biến của tất cả các týp [5]. Các nhà khoa học đã phát hiện có khoảng trên 90% các trường hợp bệnh tạo xương bất toàn gây nên do đột biến gen COL1A1 (Collagen týp I alpha 1) và COL1A2 (Collagen týp I alpha 2). Đây là hai gen mã hóa cho sự tổng hợp collagen týp I, một loại protein chiếm ưu thế trong chất cơ bản ngoại bào của hầu hết các mô [33]. Cũng như nhiều bệnh lý di truyền khác, bệnh xương bất toàn là một gánh nặng lâu dài với bản thân người bệnh, gia đình và xã hội. Việc điều trị đòi hỏi thời gian dài và còn tùy thuộc vào mức độ nặng nhẹ của bệnh. Cho đến nay bệnh vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu mà chỉ dừng lại ở các biện pháp điều trị hỗ trợ và điều trị triệu chứng: giảm đau, giảm gãy xương tái phát nhằm giảm tới mức tối đa tỷ lệ tàn tật và suy giảm chức năng khác. Bởi vậy, chẩn đoán xác định bệnh bằng phương pháp phân tích gen tìm 4 đột biến trên bệnh nhân mắc bệnh xương bất toàn là cần thiết cho việc phát hiện sớm, để có những can thiệp, hỗ trợ kịp thời, nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân, động thời giảm bớt gánh nặng cho gia đình. Ngoài ra, một mục tiêu quan trọng nữa của việc phát hiện đột biến đó là xác định người lành mang gen bệnh, tạo tiền đề quan trọng giúp chẩn đoán trước sinh đối với những đối tượng có nguy cơ cao sinh con bị bệnh, để đưa ra những lời khuyên cần thiết. Với những ý nghĩa trên, đề tài “Nghiên cứu phát hiện đột biến gen COL1A1 gây bệnh tạo xương bất toàn” được thực hiện nhằm mục tiêu: Phát hiện đột biến gen COL1A1 trên bệnh nhân tạo xương bất toàn bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen. 5 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh OI 1.1.1. Trên thế giới Theo nghiên cứu của Lowenstein E.J. ở Ai Cập thì bệnh OI đã xuất hiện từ 1000 năm trước công nguyên [21]. Tuy nhiên đến năm 1788 những mô tả khoa học đầu tiên về bệnh OI mới được Olaus Jakob Ekman đưa ra. Trong thế kỷ 20, những biến đổi lâm sàng đáng kể với mức độ nghiêm trọng khác nhau của bệnh OI được xác định. Looser đã tiến hành phân loại bệnh OI đầu tiên năm 1906, sau đó là Silence đề xuất phân loại OI thành 4 týp năm 1979. Tuy đã được chỉnh sửa nhiều lần nhưng cách phân loại này vẫn được áp dụng tới ngày nay [36]. Về mặt dịch tễ, tỷ lệ mắc bệnh OI vào khoảng 6-7/100,000. Tỷ lệ này khác nhau ở các týp khác nhau: týp I và týp IV chiếm hơn một nửa trong số tất cả các trường hợp. Với týp II, tỷ lệ mắc là 1-2/100,000 và đều tử vong sớm. Týp III có tỷ lệ mắc tương đương týp II, còn týp IV là loại hiếm gặp [36]. Năm 1974, những bất thường trong collagen của xương lần đầu tiên được nhìn thấy trên kính hiển vi điện tử. Ba năm sau, báo cáo của Sykes đã chỉ ra mối quan hệ tương tác giữa hai loại collagen trong sự tiêu biến của pepsin trên da những bệnh nhân OI bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide [36]. Đột biến gen mã hóa collagen týp I lần đầu tiên được mô tả bởi Chu và cộng sự năm 1983 là đột biến xóa đoạn dài khoảng 0.5 kb trong 1 alen của chuỗi procollagen - α1. Phát hiện này đánh dấu sự khởi đầu làm sáng tỏ quá trình sinh tổng hợp collagen và cơ chế bệnh học phân tử của OI [5], [36]. 6 1.1.2. Ở Việt Nam Do tình hình bệnh tạo xương bất toàn ở Việt Nam vẫn còn rất ít và có duy nhất một trung tâm nghiên cứu về bệnh học phân tử: trung tâm nghiên cứu gen - protein tại Trường Đại học Y Hà Nội - Đống Đa - Hà Nội; còn lại chủ yếu nghiên cứu về mặt lâm sàng (viện nhi Trung ương); nên số lượng nghiên cứu về OI ở Việt Nam chưa nhiều, thông tin còn hạn chế. Một vài nghiên cứu được công bố gần đây đều được thực hiện tại trung tâm duy nhất này [1], [4]. 1.2. Đặc điểm của bệnh OI 1.2.1. Đặc điểm lâm sàng Năm 1979, Silence đã đề xuất phân loại OI thành 4 týp dựa trên đặc điểm lâm sàng và đặc điểm di truyền trên những bệnh nhân đã xác định chắc chắn là mắc bệnh OI tại Victoria, Autralia [36]. - Týp I: Là thể nhẹ nhất và hay gặp nhất, đặc trưng bởi mắt có màu xanh ở tất cả các độ tuổi, trẻ bắt đầu gãy xương từ khi tuổi còn nhỏ nhưng tần suất gãy xương thấp, không có biến dạng hoặc biến dạng xương ít, giảm thính lực hoặc điếc. Hầu hết tiền sử gia đình bệnh nhân có người điếc, dây chằng lỏng lẻo gây sai khớp. Đa số bệnh nhân không có tạo răng bất toàn. - Týp II: Là thể nặng nhất. Bệnh nhân thường chết ngay trong tử cung do gãy nhiều xương hoặc ngay sau khi sinh do rối loạn chức năng hô hấp (thiểu sản phổi, gãy xương sườn). Hiện nay OI týp II được chia làm hai loại là OI týp II-A và II-B. - Týp III: Là thể tương đối nặng, chỉ đứng sau týp II, trẻ thường sinh ra đã có gãy xương, biến dạng tiến triển xương dài, xương sọ, cột sống… Gãy xương tái phát nhiều lần gây hậu quả là chi ngắn và biến dạng tăng dần, mặt hình tam giác và có bướu trán. Củng mạc mắt thường quá trắng hoặc có màu xám, màu xanh, giảm chức năng hô hấp, giảm thính lực và bất thường về răng. 7 - Týp IV: Là thể trung gian giữa týp I và III. Gãy xương xuất hiện ở tuổi nhỏ, các biến dạng xương ở mức nhẹ đến trung bình, tần suất gãy xương thay đổi. Củng mạc mắt có thể bình thường hoặc xám; có hoặc không có tạo răng bất toàn; thường giảm thính lực ở tuổi trưởng thành và tiền sử gia đình có người điếc [5]. Xếp theo thứ tự từ nhẹ đến nặng sẽ là týp I, týp IV, týp III, týp II. Một số nghiên cứu mới đã phân loại thêm týp V, VI, VII, VIII. Bảng 1.1. Đặc điểm lâm sàng của bệnh OI [36] Týp Đặc điểm I II-A II-B III IV Di truyền Trội trên NST thường Trội trên NST thường Trội/Lặn trên NST thường Trội/Lặn trên NST thường Trội/Lặn trên NST thường Mức độ nghiêm trọng Nhẹ Tử vong trước sinh Nghiêm trọng Nhẹ vừa Vừa Gãy xương bẩm sinh Không Có Có Thường xuyên Hiếm gặp Biến dạng xương Hiếm gặp Rất nặng Nặng Nặng vừa Nhẹ vừa Tròng mắt Xanh Đen Đen Xanh/ Xám/ Trắng Bình thường Tầm vóc Bình thường Đặc biệt nhỏ Đặc biệt nhỏ Rất nhỏ Nhỏ có thay đổi Sự dịch chuyển khớp Có Có Có Có Có thể Mất chức năng nghe 60% các trường hợp Chưa rõ Chưa rõ Phổ biến 42% các trường hợp Tạo răng bất toàn Có thể Chưa rõ Chưa rõ Có Có thể Biến chứng hô hấp Không Có Có Có Không Biến chứng thần kinh Không Chưa rõ Chưa rõ Có Không 8 1.2.2. Chẩn đoán Hiện nay, siêu âm trước sinh là lựa chọn đầu tiên để phát hiện bệnh lý của thai nhi trong đó có OI. Siêu âm trước sinh có thể chẩn đoán chính xác bệnh OI tới 89%. Siêu âm hai chiều là kỹ thuật hình ảnh đáng tin cậy trong OI týp II và III. Việc chẩn đoán có thể được thực hiện sớm nhất ở tuần 17 của thai kỳ với OI týp I và tuần 13 với OI týp II. Đối với OI týp III, chiều dài chi thường bắt đầu biến đổi sớm nhất ở khoảng tuần 17 đến 18 của thai kỳ. OI týp III hoặc týp IV có thể có hoặc không có gãy xương, biến dạng xương hay giảm khoáng hoá xương; nếu có thì sự biến đổi chỉ nhìn thấy được ở 3 tháng cuối thai kì. Vì vậy cần siêu âm định kỳ khi có nghi ngờ OI týp III hoặc týp IV [14]. Chẩn đoán bệnh OI ở người trưởng thành dựa vào: biểu hiện lâm sàng, phim chụp X quang, tiền sử gãy xương và tiền sử gia đình.Với những trường hợp không có tiền sử gia đình hoặc gãy xương không có kết hợp với những bất thường ngoài xương thì chẩn đoán cần kết hợp thêm xét nghiệm số lượng và cấu trúc phân tử collagen týp I qua nuôi cấy nguyên bào sợi từ da bệnh nhân và kết hợp phân tích gen [5]. 9 Hình 1.1. Sơ đồ chẩn đoán phân loại bệnh OI. [36] 1.2.3. Điều trị Hiện nay, chưa có phương pháp thay thế cấu trúc collagen bị tổn thương hay kích thích cho cơ thể tăng tổng hợp số lượng collagen, vì vậy chứng bất toàn trong tạo sinh xương vẫn được xem là một rối loạn di truyền không thể chữa khỏi được. Liệu pháp tác động lên gen và tế bào chỉ có tác dụng hỗ trợ [17]. Các phương pháp chính điều trị OI gồm: Hóa dược trị liệu, vật lý trị liệu (phục hồi chức năng), phẫu thuật chỉnh hình, điều trị răng, điều trị điếc [2], [36]. 10 [...]... lặp, đột biến cắt nối, đột biến mất, đột biến thêm nucleotide Trong đó dạng đột biến thay thế là phổ biến nhất, chiếm khoảng 82% các đột biến trên gen COL1A1 (Hình 1.6) Hình 1.6 Tỉ lệ các đột biến trên gen COL1A1 gây bệnh OI (https://oi.gene.le.ac.uk) 17 Hầu hết các đột biến xảy ra trên exon, chiếm 83% tổng số đột biến trên gen COL1A1 Trong đó đột biến thay thế là phổ biến nhất ở cả hai vị trí đột biến. .. là do đột biến gen trội nằm trên gen COL1A1 hoặc COL1A2; còn lại 10% gây nên bởi các đột biến gen lặn trên một trong các gen hiện nay đã biết (CRTAP, LEPRE1, PPIB, SERPINH1, FKBP10, PLOD2, SP7, SERPINF1) hoặc trên các gen chưa đươc phát hiện [36], [39] 16 Hình 1.5 Tỷ lệ các gen đột biến gây bệnh OI (https://oi.gene.le.ac.uk) Các đột biến trên gen COL1A1 gây bệnh OI gồm: đột biến thay thế, đột biến. .. của gen COL1A1: chiếm 87% các đột biến trên exon, 81% các đột biến trên intron (Hình 1.7) Trong các đột biến thay thế thì phổ biến nhất là đột biến thay thế glycin bằng một acid amin khác Hiện nay có hơn 700 đột biến thay thế glycin được phát hiện trên bệnh nhân OI và tổng hơp lại trên dữ liệu các đột biến gen COL1A1 [5], [15], [36] Hình 1.7 Tỷ lệ các đột biến gây bệnh OI trên gen COL1A1 (https://oi.gene.le.ac.uk)... thúc [36] 21 1.4 Các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen COL1A1 Các đột biến trên gen COL1A1 chủ yếu là đột biến điểm do đó kỹ thuật PCR và giải trình tự trực tiếp được sử dụng để phát hiện đột biến Trong trường hợp các đột biến nằm trong vùng mã hoá axít amin (exon) như: đột biến sai nghĩa (missense), đột biến vô nghĩa (nonsense), đột biến gây lệch khung dịch mã (frameshift) thì chỉ cần... IV: hiện nay đã có hơn 1000 biến thể khác nhau trên gen COL1A1 và COL1A2 được phát hiện là gây bệnh OI (https://oi.gene.le.ac.uk) Các loại đột biến cũng như vị trí xuất hiện ảnh hưởng tới kiểu hình người bệnh OI týp I là phổ biến nhất, đặc trưng bởi sự giảm 50% lượng collagen týp I, thường là kết quả của những đột biến trên một alen của gen COL1A1, đôi khi là do xóa hoàn toàn một alen hoặc thay thế... trực tiếp tìm đột biến Nếu đột biến cùng intron (không mã hoá axit amin) nhưng ảnh hưởng đến vị trí bám của các hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucloeprotein) thì cần thêm bước khuếch đại sản phẩm cDNA bằng phương pháp RT-PCR đế biết exon nào bị mất từ mRNA Tuy nhiên mẫu bệnh phẩm phải được lấy ở vùng có sự biểu hiện protein collagen týp I (da, xương) Như vậy để phát hiện đột biến trên gen COL1A1 cần... tử collagen týp I trong OI, bệnh biểu hiện ở nhiều mô và cơ quan [5] 1.3.2 Vị trí, cấu trúc, chức năng của gen COL1A1: 1.3.2.1 Vị trí Gen COL1A1 nằm trên cánh dài NST 17 từ vị trí 21.3 đến 22 (17q21.3-q22) COL1A1 Hình 1.3 Vị trí của gen COL1A1 trên cánh dài NST 17 (http://ghr.nlm.nih.gov) 15 1.3.2.2 Cấu trúc và chức năng Gen COL1A1 gồm 51 exon với chiều dài 18kb, mã hóa 5kb cho chuỗi procollagen -α1... TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Nhóm chứng (n=1): Nhóm chứng được dùng như chứng dương bình thường chạy PCR, sequencing cùng với mẫu bệnh nhân - Nhóm nghiên cứu (n=5): Nhóm nghiên cứu gồm 5 bệnh nhân đã được chẩn đoán mắc bệnh OI dựa vào đặc điểm lâm sàng điển hình, triệu chứng X quang, tiền sử bệnh nhân bị gãy xương, tiền sử gia đình Những bệnh nhân không có tiền... rõ ràng được loại trừ khỏi nghiên cứu này Năm bệnh nhân này được lựa chọn trong số hơn 100 bệnh nhân OI đang được điều trị và trong danh sách quản lý của Khoa Nội tiết - Chuyển hoá Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: - Tiêu chuẩn lâm sàng gồm 4 tiêu chuẩn: + Loãng xương, gãy xương tự phát và/hoặc tái phát + Củng mạc mắt màu xanh + Tạo răng bất toàn + Giảm thính lực Chẩn... cả bệnh nhân đều có biểu hiện gẫy xương, biến dạng xương trên phim Xquang, các biểu hiện khác nhau tùy thuộc vào từng týp 31 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp phân tích bệnh chứng Thiết kế nghiên cứu: Bước 1: Thu mẫu Bước 2: Tách chiết DNA từ máu ngoại vi gồm 2 bước: - Tách chiết DNA - Đo mật độ quang (OD) xác định độ tinh sạch và nồng độ Bước 3: Thực hiện phản ứng PCR gồm 2 bước: - Thực hiện . nghĩa trên, đề tài Nghiên cứu phát hiện đột biến gen COL1A1 gây bệnh tạo xương bất toàn được thực hiện nhằm mục tiêu: Phát hiện đột biến gen COL1A1 trên bệnh nhân tạo xương bất toàn bằng kỹ thuật. lệ các gen đột biến gây bệnh OI. (https://oi.gene.le.ac.uk) Các đột biến trên gen COL1A1 gây bệnh OI gồm: đột biến thay thế, đột biến lặp, đột biến cắt nối, đột biến mất, đột biến thêm nucleotide khoa học đã phát hiện có khoảng trên 90% các trường hợp bệnh tạo xương bất toàn gây nên do đột biến gen COL1A1 (Collagen týp I alpha 1) và COL1A2 (Collagen týp I alpha 2). Đây là hai gen mã hóa