i LỜI CẢM ƠN Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nha Trang. Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Phạm Thu Thủy, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, TP. Nha Trang - Khánh Hòa. Cô đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện để hoàn thành đồ án này. Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi được sử dụng trang thiết bị, hóa chất và các dụng cụ thí nghiệm. ThS. Trương Thị Thu Thủy, cán bộ tổ nghiên cứu và thầy Ứng Trọng Thuấn, Bộ môn Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi về kỹ thuật. Các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nha Trang. Các bạn trong lớp 48CNSH, Trường Đại học Nha Trang. Cuối cùng xin kính chúc mọi người sức khoẻ, hạnh phúc và thành công. Nha Trang, tháng 6 năm 2010 Sinh viên thực hiện Nguyễn Tiến Lâm ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH iv LỜI NÓI ĐẦU 1 Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Khái quát về ốc cối 4 1.1.1. Phân loại 4 1.1.2. Đặc điểm chung 4 1.2. Sử dụng chỉ thị phân tử trong phân loại và xây dựng cây phát sinh chủng loại các động vật thân mềm 12 1.2.1. Chỉ thị ty thể 12 1.2.2. Chỉ thị nhân 13 1.3. Tình hình nghiên cứu phân loại ốc cối 14 1.3.1. Trên thế giới 14 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 18 Chương II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Nguyên vật liệu 20 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2. Hoá chất 20 2.1.3. Thiết bị chuyên dụng 21 2.2. Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số 22 2.2.2. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 24 2.2.3. Điện di gel agarose 27 Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1. Tách chiết DNA tổng số ốc cối 29 3.2. Nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA và trình tự ITS2 của các mẫu ốc cối bằng kỹ thuật PCR 32 iii KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 iv DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH Danh mục bảng: Bảng 1.1: Các siêu họ gen mã hóa peptide độc tố ốc Conus 12 Bảng 1.2: Các peptide độc tố được thử nghiệm lâm sàng và cận lâm sàng 13 Bảng 3.1: Danh sách các loài ốc cối Conus đã tách chiết được DNA 32 Bảng 3.2: Các thông số của mồi 33 Bảng 3.3: Danh sách các loài ốc cối đã nhân gen 36 Bảng 3.4: Danh sách các loài ốc cối đã giải trình tự đoạn gen 16S rDNA 36 Danh mục hình: Hình 1.1: Ảnh minh họa các loài ốc cối Conus 09 Hình 1.2: Bản đồ địa lý về sự phân bố ốc cối Conus tại các vùng biển Việt Nam 10 Hình 1.3: Cấu trúc tổng quát đoạn chèn ITS2 16 Hình 1.4: Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile 19 Hình 2.1: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 26 Hình 3.1: Ảnh minh họa vị trí lấy mẫu mô tách chiết DNA 30 Hình 3.2: Ảnh điện di DNA tổng số của các mẫu ốc cối 32 Hình 3.3: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các mẫu ốc cối 35 1 LỜI NÓI ĐẦU Loài ốc cối Conus sống tại vùng biển nhiệt đới vốn nổi tiếng là nguồn nguyên liệu sản xuất "thần dược" chữa các cơn đau mạn tính, ung thư và nhiều bệnh khác. Các nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng cho thấy độc tố ốc cối (conotoxin) có hiệu quả giảm đau cao gấp 10.000 lần so với morphine mà không gây nghiện hoặc các phản ứng phụ - điều khó tránh khỏi với tất cả các loại thuốc giảm đau hiện nay. Vì vậy, trong vòng 20 năm qua, đã có hơn 2.600 cuộc nghiên cứu được tiến hành nhằm đánh giá một cách chính xác về đóng góp quan trọng của các độc tố chiết xuất từ loài ốc cối đối với ngành dược và sinh học tế bào. Tuy nhiên cho đến nay, các nhà khoa học chỉ mới chiết xuất và phân tích được khoảng 100 độc tố từ nguồn tiềm năng chứa tới 70.000 độc tố của ốc cối. Do vậy, các nghiên cứu sâu hơn về ốc cối và độc tố ốc cối vẫn đang và sẽ được tiếp tục tiến hành trong đó có các nghiên cứu phát sinh chủng loại ốc cối. Hơn thế nữa, các loài ốc cối có quan hệ di truyền gần nhau thường chứa các peptide độc tố giống nhau hơn là các loài có mối quan hệ xa nhau. Do vậy, các nghiên cứu phát sinh chủng loại các loài ốc cối không chỉ làm cơ sở cho việc phát hiện các loài ốc cối mới, mà còn góp phần quan trọng vào quá trình nghiên cứu các conotoxin mới, nhằm phát huy hết tiềm năng vốn có của chúng. Bên cạnh giá trị đối với y học, các loài ốc cối còn có giá trị kinh tế cao. Do có màu sắc và hoa văn đẹp, vỏ của các loài ốc cối thường được khai thác để làm đồ trang sức, mỹ nghệ và các vật phẩm lưu niệm. Tình trạng khai thác một cách bừa bãi các loài ốc cối đòi hỏi các nhà khoa học phải có các nghiên cứu bảo tồn một cách hợp lý và đúng đắn nguồn tài nguyên này. 2 Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự đa dạng loài của ốc cối. Tuy nhiên, ở Việt Nam, các nghiên cứu về ốc cối mới chỉ dừng lại ở mức độ thống kê các loài đặc hữu và mô tả các đặc điểm hình thái giải phẫu. Hiện chưa có một nghiên cứu nào về ốc cối ở mức độ phân tử. Vì vậy, nghiên cứu phát sinh chủng loại các loài ốc cối Việt Nam bằng các phương pháp sinh học phân tử là điều rất cần thiết. Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA và trình tự ITS2 của các loài ốc cối Conus bằng kỹ thuật PCR”, làm cơ sở cho việc xây dựng cây phát sinh chủng loại và tìm kiếm các loài ốc cối mới ở Việt Nam. Đề tài này nhằm các mục tiêu chính sau đây:  Tách chiết DNA tổng số của các loài ốc cối Việt Nam thu thập tại hai khu vực: Đảo Lý Sơn, Quảng Ngãi và Cù Lao Chàm, Quảng Nam.  Nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA và trình tự ITS2 của các loài ốc cối bằng kỹ thuật PCR, làm cơ sở cho việc giải trình tự gen nhằm xác định loài và xây dựng cây phát sinh chủng loại. Sự thành công của đề tài này sẽ góp phần quan trọng vào công tác bảo tồn và khai thác hợp lý nguồn gen các loài ốc cối Việt Nam. 3 Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Khái quát về ốc cối 1.1.1. Phân loại Họ ốc cối Conidae thuộc liên họ Conoidea, bộ Sorbeoconcha, là một trong những họ có số lượng loài lớn trong ngành động vật thân mềm. Cho đến nay, trên thế giới người ta đã xác định được khoảng 700 loài, trong đó chủ yếu thuộc chi Conus. Ngành: Mollusca (Linnaeus, 1758) Lớp: Gastropoda (Cuvier, 1795) Bộ: Sorbeoconcha (Ponder & Lindberg, 1997) Liên họ: Conoidea (Fleming, 1822) Họ: Conidae (Rafinesque, 1815) Chi: Conus (Linnaeus, 1758) (http://zipcodezoo.com/Key/Animalia/Conus_Genus.asp) 1.1.2. Đặc điểm chung Ốc cối có vỏ dạng hình thoi, tháp vỏ thấp, tầng thân lớn, miệng vỏ hẹp dài, trục vỏ thẳng, không có nếp uốn vặn, với màu sắc sặc sỡ, hoa văn đa dạng, mép trong và mép ngoài miệng vỏ đơn giản, nắp vỏ bằng chất sừng, da vỏ có vân màu, kích thước rất khác nhau tùy theo loài (loài lớn nhất có thể dài đến 23 cm) (Ngô Anh Tuấn, 2009) (Hình 1.1). Chúng phân bố chủ yếu ở các vùng biển nhiệt đới và vùng biển ấm như Philíppin, Indonesia, Australia, Mexico, Florida, Hawaii…Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng cho thấy một số loài có thể thích ứng với sự thay đổi của điều kiện môi trường như ở vùng biển nóng mũi Cape, Nam Phi hay vùng biển lạnh phía tây Califonia, Hoa Kỳ. Hầu hết các loài ốc Conus nhiệt đới sống trong hoặc gần các rạn san hô, trong khi các loài cận nhiệt đới 5 được tìm thấy chủ yếu tại vùng dưới triều ở độ sâu từ 10-30m và dưới các tảng đá ở vùng triều nông (Stewart và Gilly, 2005). Hình 1.1: Ảnh minh họa các loài ốc cối Conus (http://www.conidae.info) Tại Việt Nam, ốc cối phân bố chủ yếu ở các vùng ven biển thuộc khu vực Nam Trung Bộ từ Đà Nẵng đến Kiên Giang và quanh các hải đảo (như Trường 6 Sa, Hoàng Sa, Côn Đảo, ) (Hình 1.2). Các loài phổ biến là ốc cối địa lý (Conus geographus) và ốc cối hoa lưới (Conus textile). [...]... Trong đó, các gen mã hóa protein ty thể bao gồm: các gen coxI-III mã hóa cho cytochrome oxidase 1-3; các gen atp6 và atp8 mã hóa cho các tiểu đơn vị 6 và 8 của ATPase; các gen nad1-6 và nad 4L mã hóa cho các tiểu đơn vị 1-6 và 4L của NADH dehydrogenase; gen cob mã hóa cho cytochrome b Các gen khác bao gồm 2 gen mã hóa rRNA (gen rrnS mã hóa 12S rRNA và gen rrnL mã hóa cho 16S rRNA) và 22 gen mã hóa các tRNA... quercinus Conus magus -400C -400C 11 12 13 Conus arenatus Conus tessulatus Conus marmoreus -400C -400C -400C 3.2 Nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA và trình tự ITS2 của các mẫu ốc cối bằng kỹ thuật PCR Đoạn gen mã hóa 16S rRNA và đoạn chèn ITS2 của các loài ốc cối được khuếch đại sử dụng hai cặp mồi tham khảo 16S (Espiritu và cs, 2001) và ITS2 (Nam và cs, 2009), tương ứng Trước hết, các thành phần và điều kiện của. .. (Duda và cs, 2001) Duda và Kohn, 2005 đã sử dụng gen mã hóa 16S rRNA (ty thể) và protein calmodulin (gen nhân) để nghiên cứu phát sinh chủng loại của 138 loài ốc cối Conus thu thập tại các vùng biển Ấn Độ - Thái Bình Dương, Đông Thái Bình Dương, Đại Tây Dương (Duda và Kohn, 2005) 16 Duda và cs, 2008 đã sử dụng các gen ty thể (mã hóa 16S rRNA và cytochrome oxidase) và một gen nhân để phân định và mô... 2005, Duda và Rolan đã sử dụng gen mã hóa cytochrome oxidase I để phân tích phát sinh chủng loại của 90 loài ốc cối Conus, trong đó có 30 loài đặc hữu của Cape Verde Kết quả cho thấy, các loài này được phân làm 2 nhánh (Duda và Rolan, 2005) 15 Cũng trong năm này, Cunha và cs đã sử dụng các gen ty thể (gen mã hóa 12S rRNA, 16S rRNA, tRNA-Val, cytochrome b) kết hợp với một gen nhân (gen mã hóa một lipoprotein... lượng dNTP cũng như chất lượng của enzyme DNA polymerase, mồi bị giảm rõ rệt, phản ứng khuếch đại được kết thúc Các cặp mồi được chọn để nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA (hệ gen ty thể) (Espiritu và cs, 2001) và đoạn chèn ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2) (hệ gen nhân) (Nam và cs, 2009) 26 a) Nhân đoạn gen mã hóa1 6S rRNA  Cặp mồi 16S: 16SF-5′-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3′ 16SR-5′-GTT TAC CAA AAA CAT... tiến hóa của các loài có mối quan hệ gần nhau Do vậy sử dụng kết hợp giữa marker nhân và marker ty thể trong nhiều trường hợp cho thấy mối quan hệ tiến hóa giữa các loài được rõ ràng hơn (Espiritu và cs, 2002) Một số marker nhân đã được khảo sát bao gồm các vùng gen mã hóa 18S rRNA, 28S rRNA, EF1-α, Histone H3, calmodulin và vùng không mã hóa như các đoạn chèn ITS1 (Internal Transcribed Spacer 1) và ITS2. .. dụng 16S rRNA ty thể Kết quả cho thấy các loài này được chia làm 3 nhánh riêng biệt Conus (Nam và cs, 2009) Năm 2008, trình tự DNA ty thể của Conus textile đã được giải mã hoàn toàn (hình 1.4) có chiều dài 15.562 nucleotide và có cấu trúc tương tự như DNA ty thể loài ốc L cerithiformis (Bandyopadhyay và cs, 2008) Hệ gen ty thể Conus textile bao gồm 15.562 nucleotide mã hóa cho 13 protein, 2 rRNA và 22... chủng loại của 49 loài ốc cối thuộc Cape Verde, trong đó có 3 loài chưa được định danh Kết quả một lần nữa khẳng định nghiên cứu trước đó của Duda và Rolan, các loài ốc cối này cũng được chia làm hai nhánh chính: nhánh thứ nhất bao gồm các loài ốc cối có vỏ lớn và nhánh thứ hai bao gồm các loài có kích thước nhỏ hơn Cả hai nhánh đều chứa các loài đặc hữu và di cư, điều này chứng tỏ tổ tiên của chúng... so với hệ gen ty thể của hai loài ốc Haliotis rubra, Katharina tunicate, và loài bạch tuộc Octopus vulgaris Trình tự DNA ty thể của L cerithiformis là cơ sở để các nhà nghiên cứu giải mã trình tự DNA ty thể và nghiên cứu phát sinh chủng loại các loài ốc độc khác 1.2.2 Chỉ thị nhân Trong nghiên cứu phát sinh chủng loại, do marker nhân có mức độ tiến hóa thấp hơn nhiều nên việc sử dụng marker nhân để bổ... thống kê loài (Nguyễn Anh Tuấn, 2009) cũng như các thông tin cảnh báo về loài ốc cối có thể gây ngộ độc cho con người Theo Đào Việt Hà và cs, ở Việt Nam hiện đã thống kê được 76 loài ốc cối, chủ yếu là ốc cối hoa lưới (C textile) và ốc cối địa lý (C geographus) Đây cũng chính hai loài ốc cối đã được Viện hải dương học Nha Trang xếp vào danh mục các loài hải sản độc hại gây chết người” (Đào Việt Hà và cs, . loài ốc cối Việt Nam thu thập tại hai khu vực: Đảo Lý Sơn, Quảng Ngãi và Cù Lao Chàm, Quảng Nam.  Nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA và trình tự ITS2 của các loài ốc cối bằng kỹ thuật PCR, làm. 6 và 8 của ATPase; các gen nad1-6 và nad 4L mã hóa cho các tiểu đơn vị 1-6 và 4L của NADH dehydrogenase; gen cob mã hóa cho cytochrome b. Các gen khác bao gồm 2 gen mã hóa rRNA (gen rrnS mã. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 24 2.2.3. Điện di gel agarose 27 Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1. Tách chiết DNA tổng số ốc cối 29 3.2. Nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA và trình tự ITS2 của