BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ðẠI HỌC Y HÀ NỘI ***************** LƯU THỊ VŨ NGA XÁC ðỊNH TỶ LỆ MANG GIEN PAP, AFA VÀ TÌNH HÌNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG E. COLI GÂY NHIỄM KHUẨN TIẾT NIỆU Chuyên nghành: Vi sinh vật Mã số : 60.72.68 LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học : PGS. TS. Lê Văn Phủng Hà Nội - 2008 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ðẠI HỌC Y HÀ NỘI ****************** LƯU THỊ VŨ NGA XÁC ðỊNH TỶ LỆ MANG GIEN PAP, AFA VÀ TÌNH HÌNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG E. COLI GÂY NHIỄM KHUẨN TIẾT NIỆU LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC HÀ NỘI - 2008 Phụ lục BỆNH VIỆN THANH NHÀN PHIẾU ðIỀU TRA BỆNH NHÂN Khoa Vi sinh - TDCN NHIỄM KHUẨN TIẾT NIỆU BN số:……… Số bện án:………… Mã BP Khoa phòng:………… 1. PHẦN HÀNH CHÍNH Họ tên bệnh nhân :…………………………………………Nam Nữ Tuổi:…………Nghề nghiệp: …………… ðịa chỉ:………………………………………………………………………………… Ngày vào viện:…………………… Ngày ra viện: …………………………………… 2. PHẦN LÂM SÀNG 2.1. Chẩn ñoán lâm sàng (khi chỉ ñịnh cấy nước tiểu): Cấp  Mạn  Tái phát  1. Viêm thận – bể thận  4. Sốt chưa rõ nguyên nhân  2. Viêm bàng quang  5. ðái máu chưa rõ nguyên nhân  3. Viêm ñường tiết niệu  6. Chẩn ñoán khác  3. PHẦN VI SINH: 3.1. Kết quả phân lập E. coli  Các VK họ ðR khác  Enterococcus spp  Klebsiella spp  P.aeruginosa  Acinetobacter  Proteus spp  S. aureus  Nấm  Enterobacter spp  S. saprophyticus  VK khác  3.1. Kết quả kháng sinh ñồ của E. coli (ñường kính vùng ức chế) AM CRO AN SXT AMC CTX NOR C SAM IMP CIP FT CXM … GM NA 3.3. Kết quả PCR của E. coli: * Ngày chạy PCR: * Các gien ñộc lực: Gien pap (+/-): Gien afa (+/-): Hà Nội, ngày tháng năm người theo dõi CHỮ VIẾT TẮT ASTS Antibiotic Susceptibility Test Study (chương trình quốc gia theo dõi tính kháng thuốc của vi khuẩn) CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute NKTN Nhiễu khuẩn tiết niệu WHO World Health Oganization (Tổ chức Y tế thế giới) VSV Vi sinh vật AM Ampicillin AMC Amoxicillin/ Acid.clavulanic SAM Ampicillin/ sulbactam CXM Cefuroxim CTX Cefotaxim CRO Ceftriazon IMP Imipenem GM Gentamicin AN Amikacin NOR Norfloxacin CIP Ciprofloxacin NA Nalidixic acid FT Nitrofurantoin C Cloramphenicol SXT Co-trimoxazol ESBLs Extended spectrum beta-lactamases (men β-lactamase phổ rộng) Lêi c¶m ¬n Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng ñào tạo sau ñại học - Trường ðH Y Hà Nội cho phép và tạo ñiều kiện thuận lợi cho em học tập và hoàn thành luận văn. Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới: - Các thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh ñã truyền dạy cho em những kiến thức quí báu. - PGS.TS Lê Văn Phủng – Phó chủ nhiệm phụ trách Bộ môn Vi sinh, Trường ðH Y Hà Nội, người thầy ñã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện ñề tài. Thầy ñã giành cho em sự giúp ñỡ quý báu, giúp em vượt qua những khó khăn trong học tập và nghiên cứu khoa học. - Ban giám ñốc Bệnh viện Thanh Nhàn, các phòng ban ñã tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ em trong quá trình công tác và học tập. - Tập thể cán bộ nhân viên Viện kiểm ñịnh Quốc gia vắc xin và sinh phẩm Y tế. Khoa Vi Sinh - TDCN Bệnh viện Thanh Nhàn, Khoa Vi Sinh - BV Bạch Mai ñã nhiệt tình giúp ñỡ em. - Gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp ñã ñộng viên, quan tâm, nhiệt tình giúp ñỡ em trong quá trình học tập nghiên cứu. Hà Nội, ngày 20 tháng10 năm 2008 Lưu Thị Vũ Nga 1 ðẶT VẤN ðỀ Nhiễm khuẩn tiết niệu (NKTN) là một trong những bệnh nhiễm khuẩn thường gặp không những ở Việt nam mà còn ở các nước phát triển, thường chỉ ñứng thứ hai hoặc thứ ba sau nhiễm khuẩn hô hấp và tiêu hoá [1, 66]. NKTN gặp ở mọi lứa tuổi, cả nam và nữ (40 - 50% phụ nữ và 12 % nam giới bị ít nhất một lần NKTN trong ñời [40, 79] và có tỷ lệ tái phát cao (20 - 50%) [35, 50]. Hơn nữa, NKTN có thể gây biến chứng nguy hiểm như nhiễm khuẩn huyết, suy thận. ðặc biệt ở trẻ nhỏ có thể dẫn ñến thận, chức năng thận kém phát triển, cao huyết áp và có nguy cơ bị sẹo thận [50], thậm chí có thể gây tử vong [77]. Hiện nay, ñiều trị NKTN cũng gặp khá nhiều khó khăn do mức ñộ kháng thuốc của vi khuẩn không ngừng tăng lên. NKTN có thể do nhiều loại vi khuẩn, vi rút, một số loại ký sinh trùng gây ra. Trong số vi khuẩn, E. coli là căn nguyên hay gặp nhất, chiếm 50% - 80% [1, 27, 64, 87], ñồng thời là loài có khả năng gây nhiều biến chứng như nhiễm khuẩn huyết, suy thận và hay gây tái phát (78% các trường hợp NKTN tái phát là do E. coli) ðể gây bệnh, vi khuẩn cần có ñủ ba yếu tố: ñộc lực, số lượng, ñường vào thích hợp. ðối với E. coli có nhiều yếu tố ñộc lực ñã ñược thừa nhận như: yếu tố bám dính (adhesin), enzym ngoại bào (hemolysin, cytotoxin), kháng nguyên K, aerobactin…[25, 87]. Blanco ñã xác ñịnh yếu tố tan máu và yếu tố bám vào tế bào biểu mô ñường niệu của E. coli hiện diện ở 88% số chủng gây viêm thận – bể thận. Trong khi E. coli phân lập ở phân người khỏe mạnh chỉ có 16% số chủng có các yếu tố này [21]. E. coli gây NKTN ở nhóm có triệu chứng có các yếu tố ñộc lực xuất hiện phổ biến hơn ở nhóm không có triệu chứng [69]. Như vậy khả năng gây bệnh của E. coli liên quan rất nhiều ñến ñộc lực của chúng. Trong ñó, yếu tố bám vào tế bào vật chủ là ñiều kiện ñầu 2 tiên ñể vi khuẩn cố ñịnh, xâm nhập vào mô gây nhiễm trùng và cũng là yếu tố quan trọng vì hầu hết NKTN do E. coli là nhiễm khuẩn ngược dòng [45]. Nhờ có khả năng này mà E. coli thắng ñược tác dụng rửa trôi của dòng nước tiểu. Nhiều bằng chứng từ nghiên cứu ñộng vật cho thấy sự tồn tại dai dẳng của E. coli ở thận, bàng quang liên quan tới khả năng bám vào tế bào biểu mô ñường niệu [48]. Các chủng phân lập ñược từ viêm thận - bể thận cấp và từ viêm bàng quang cấp bám tốt vào tế bào biểu mô ñường niệu hơn các chủng gây NKTN không triệu chứng hoặc từ ñại tràng [81, 82]. E. coli gây NKTN có các thành phần tham gia bám ñặc hiệu là: pili, fimbriae, afimbriae và một số protein màng ngoài. Hiện nay, với sự phát triển của công nghệ, trên thế giới ñã có nhiều nghiên cứu về dịch tễ, cơ chế tác ñộng, tầm quan trọng của gien mã hóa các yếu tố ñộc lực của E. coli mà 2 gien pap và afa ñang ñược nghiên cứu nhiều. Tuy nhiên, ở Việt nam nghiên cứu về vấn ñề này còn ít ñược ñề cập ñến. ðể hiểu rõ hơn về tỷ lệ các gien này của E. coli gây NKTN trên bệnh nhân Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài “Xác ñịnh tỷ lệ mang gien pap, afa và tình hình kháng kháng sinh của các chủng E. coli gây nhiễm khuẩn tiết niệu” với hai mục tiêu sau: 1. Xác ñịmh tỷ lệ mang gien pap, afa ở các chủng E. coli gây NKTN. 2. ðánh giá mức ñộ kháng kháng sinh của các chủng E. coli gây NKTN. 3 Chương1 TỔNG QUAN 1.1. NHIỄM KHUẨN TIẾT NIỆU 1.1.1. ðịnh nghĩa Bình thường, ở niệu ñạo trước có một số loại vi sinh vật (VSV) nhưng phần còn lại của hệ tiết niệu là vô khuẩn. NKTN xảy ra khi VSV xâm nhập và nhân lên ở bất kì bộ phận nào của hệ tiết niệu với số lượng có ý nghĩa, có hoặc không có triệu chứng lâm sàng kèm theo [66]. NKTN có thể chỉ khu trú ở một vị trí như: thận (viêm thận - bể thận), niệu quản (viêm niệu quản), bàng quang (viêm bàng quang ), niệu ñạo (viêm niệu ñạo). Nhưng toàn bộ hệ tiết niệu luôn có nguy cơ bị VSV xâm nhập khi một bộ phận của nó bị nhiễm khuẩn. Khái niệm này không bao hàm các NKTN do: lậu, Chlamydia, Mycoplasma… 1.1.2. Phân loại 1.1.2.1. Phân loại theo vị trí giải phẫu: - Viêm thận - bể thận: là nhiễm khuẩn ở nhu mô ñài bể thận, chỉ chiếm 25 - 30 % các trường hợp NKTN nhưng lại rất quan trọng vì chúng gây ảnh hưởng trực tiếp ñến chức năng của hệ tiết niệu. Nếu không ñược ñiều trị, nhiễm khuẩn có thể tới toàn bộ thận (mủ thận), tới vỏ thận (áp xe quanh thận), nhiễm khuẩn huyết và có thể gây tử vong. Căn nguyên gây viêm thận – bể thận thường do các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn ngược dòng như E. coli, P. aeruginosa, Proteus. Một tỷ lệ nhỏ NKTN theo ñường máu. Với các loài vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết như S. aureus và P. aeruginosa nguy cơ gây nhiễm khuẩn thận rất cao. 4 - Viêm bàng quang: là tình trạng nhiễm khuẩn chủ yếu ở lớp bề mặt bàng quang hoặc lớp sâu bị tổn thương nếu nhiễm khuẩn tồn tại lâu hoặc tái phát. Viêm bàng quang cấp hay xảy ra ở phụ nữ hơn nam giới và thường là NKTN không biến chứng. Tuy nhiên nếu không ñược ñiều trị có thể gây viêm thận – bể thận. Hầu hết viêm bàng quang xảy ra theo cơ chế nhiễm khuẩn ngược dòng. - Viêm niệu ñạo: là tình trạng nhiễm khuẩn dưới nếp niêm mạc niệu ñạo. Dấu hiệu chủ yếu của bệnh là ñái rắt, ñái buốt. Nam giới hay bị viêm niệu ñạo do các căn nguyên ñặc biệt như lậu, Chlamydia, Mycoplasma. 1.1.2.2. Phân loại theo triệu chứng lâm sàng: - NKTN cấp bao gồm viêm bàng quang cấp, viêm thận – bể thận cấp, viêm niệu ñạo cấp. Thể bệnh này thường có các dấu hiệu lâm sàng rõ rệt như sốt cao, rét run, các triệu chứng về tiết niệu (ñái buốt, ñái rắt, ñôi khi ñái máu…). Bệnh diễn biến nhanh và có thể dẫn ñến những biến chứng nguy hiểm như nhiễm khuẩn huyết, viêm mủ thận - bể thận và có khi ñe dọa ñến tính mạng người bệnh. Bệnh có thể khỏi hoặc chuyển sang mạn tính. - NKTN mạn tính thường là hậu quả của NKTN cấp tính do ñiều trị không hiệu quả. Triệu chứng thường nghèo nàn như sốt nhẹ, ñau tức vùng thắt lưng hoặc hạ vị. - NKTN không triệu chứng: ñây là thể bệnh thường gặp nhất trong NKTN, ñặc biệt ở người cao tuổi (40 – 50%) [87]. Bệnh nhân thường không biết mình bị NKTN nên thường không ñược ñiều trị. Diễn biến bệnh có thể gây viêm thận – bể thận mạn tính, viêm mủ thận hoặc teo thận. Việc chẩn ñoán các trường hợp NKTN không triệu chứng chỉ duy nhất là xét nghiệm qua nuôi cấy nước tiểu. 1.1.2.3. Phân loại theo căn nguyên: - NKTN ñặc hiệu: Do các loài vi khuẩn ñặc biệt gây nên và có hình ảnh lâm sàng ñặc trưng. Các vi khuẩn trong nhóm này bao gồm: Mycobacterium 5 tuberculosis, Neisseria gonorrhoae, Mycoplasma, Chlamydia Loại NKTN ñặc hiệu này chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ trong NKTN nói chung. - NKTN không ñặc hiệu: Là loại NKTN thường gặp do các trực khuẩn Gram âm hoặc cầu khuẩn Gram dương gây nên, ví dụ: E. coli, S. saprophyticus 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh NKTN 1.1.3.1. Cơ chế bảo vệ: Quá trình nhiễm khuẩn phụ thuộc không chỉ vào tác nhân gây bệnh mà còn phụ thuộc vào sự hoạt ñộng của cơ chế bảo vệ [64]. Trong ñiều kiện bình thường, VSV xâm nhập vào hệ tiết niệu ñược thải trừ một cách nhanh chóng nhờ cơ chế ñề kháng tự nhiên của vật chủ: - Hệ tiết niệu với sự toàn vẹn và bình thường về giải phẫu, sinh lý cho phép dẫn nước tiểu dễ dàng triệt ñể. Lượng nước tiểu lớn và số lần ñi tiểu bình thường cho phép rửa trôi VSV khi nó xâm nhập vào hệ tiết niệu [66, 87]. - Cấu trúc van bàng quang – niệu quản có tác dụng chống trào ngược nước tiểu từ bàng quang lên niệu quản khi có tăng áp lực quá mức trong bàng quang [87]. - Chiều dài niệu ñạo cũng có tác dụng hạn chế sự xâm nhập của VSV. Niệu ñạo nam giới (18 – 20 cm) dài hơn niệu ñạo nữ (3- 4 cm) nên mam giới ít bị NKTN ngược dòng hơn nữ giới. - Ngoài cơ chế bảo vệ mang tính cơ học nói trên, hệ tiết niệu còn ñược bảo vệ bởi miễn dịch tại chỗ (IgAs) là giảm khả năng bám và xâm nhập của vi khuẩn, miễn dịch toàn thân (IgG, bổ thể), ñáp ứng viêm, bong các tế bào biểu mô khi bị VSV bám [25, 87]. - Thành phần nước tiểu có một số yếu tố: pH thấp, áp lực thẩm thấu cao, nồng ñộ ure cao, nồng ñộ glucose và Fe thấp, không thuận lợi cho VSV phát triển [25, 87]. - Chất tiết của tiền liệt tuyến có tác dụng kháng khuẩn [66, 87]. [...]... lo i E coli thu c h Enterobacteriacae Tác gi T c Gi ng Loài Ewing (1986) Escherichieae Escherichia E coli Escherichia – Shigella E coli Bergey’s (1995) Escherichia E coli IJSB (2000) Escherichia E coli CDC (1989) - D a vào c u trúc kháng nguyên: E coli ñư c chia thành hơn 700 type huy t thanh khác nhau - D a vào s ly gi i b i phage ñ c hi u, có kho ng 50 type - D a vào tính ch t gây b nh: + E coli. .. có gien afaC, afaE, afaD Gien afaE mã hóa protein bám AfaE afaD mã hóa protein AfaD có ch c năng xâm nh p AfaC là protein ñóng vai trò như m neo (anchoring protein) M neo Hình 7: Mô hình protein bám afa1 , afa2 n m trên nhi m s c th afa3 , afa5 , afa7 , afa8 n m trên plasmid và NST [70] Có s khác nhau v t l gi a các subtyp và v trí gây b nh afa7 ch có ñ ng v t afa1 , 2, 3, 5 ch có các ch ng c a ngư i afa8 ... th , s ñ kháng xu t hi n nhanh chóng loài này, theo sau là h nh ng Enterobacteriaceae mà ñ u tiên là nh ng vi khu n gây nhi m khu n b nh vi n như Klebsiella, Enterobacter và E coli Các ch ng E coli kháng Quinolon thư ng ña kháng thu c [68] Các Cephalosporin ph m r ng (Extended spectrum cephalosporins) như : cefotaxime, ceftriazone, ceftazidime, cefepime hi n ñang ñư c s d ng r ng rãi trong ñi u tr nhi... vi khu n kháng l i kháng sinh này do men beta-lactamase ph r ng (Extended spectrum beta-lactamases, ESBLs) ESBLs ñư c tìm th y ñ u tiên Sau ñó, ESBLs th y Klebsiella pneumoniae năm 1990 [65] h u h t các Enterobacteriaceae khác Tuy nhiên, hi n nay, ESBLs ñư c tìm th y ch y u K pneumoniae và E coli v i t l ngày càng tăng và tăng theo tu i (E coli phân l p ñư c t nhóm b nh nhân > 60 tu i có t l ESBLs cao... fimbriae [31] Hình 5: Mô hình c u trúc và quá trình l p ráp P fimbriae [63] (A, C, G, E, F là PapA, PapC, PapG, Pap E, PapF._, c u trúc không bám ñư c vào receptor +, c u trúc có th bám ñư c vào receptor) 19 * Nhóm gien afa g m 6 gien: afa1 , 2, 3, 5, 7, 8 mã hóa cho các y u t bám afimbriae (Afimbriae adhesins – AFAs) tương ng AfaI, II, III, V, VII, VIII Hình 6: Sơ ñ c u trúc c a các gien afa [18] Các afa. .. nh: + E coli tiêu ch y (Diarrheagenic E coli - DEC) + E coli gây viêm màng não sơ sinh (New born menigitidis E coli NMEC) + E coli gây NKTN (Uropathogenic E coli – UPEC) + E coli gây nhi m trùng b nh vi n 1.3.1.3 Kh năng gây b nh E coli kí sinh bình thư ng trong ñ i tràng c a ngư i và m t s ñ ng v t, chi m 80% t ng s vi khu n hi u khí Nhưng nh ng năm g n ñây, vai trò gây b nh c a vi khu n này ñã ñư... 59, 74] S khác nhau gi a các ch ng kháng và nh y c m v i các kháng sinh khác r t nh [57] Vi t Nam, theo nghiên c u c a Bùi Kh c H u, m c ñ nh y c m v i kháng sinh c a E coli gây nhi m trùng b nh vi n, mang m t trong ba gien pap, afa sfa, không có s khác bi t có ý nghĩa th ng kê (P > 0,05) so v i E coli không mang gien ñ c l c [5] 1.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ð NH GIEN ð C L C C A E COLI * Phương pháp lai ADN:... trình t và có kích c không quá 2000 bp * Các deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs): - Deoxyadenosine triphosphate (dATP) - Deoxythymidine triphosphate (dTTP) - Deoxyguanosine triphosphate (dGTP) - Deoxycytidine triphosphate (dCTP) ðây là các nguyên li u dùng ñ kéo dài m i * M i (Primer): Là m t ño n ADN s i ñơn dài kho ng 18 - 40 base, bao g m các ño n m i xuôi (forward) và m i ngư c (reverse) ð c... fimbriae/ vi khu n Pili có ñư ng kính kho ng 7 nm, dài 0,5- 2µm [24] Hình 2: nh fimbriae c a E coli dư i kính hi n vi ñi n t [34] Afimbriae khác v i fimbriae Afimbriae có c u trúc ki u cu n dư i kính hi n vi ñi n t [85] Các gien mã hoá cho các y u t bám E coli gây NKTN: 16 S TT GIEN KI U HÌNH V TRÍ GIEN 1 pap P fimbriae NST [46] 2 Sfa S fimbriae NST [46] 3 Fil Type 1 fimbriae NST [86] 4 Prs F fimbriae NST... c ng s ñã nghiên c u trình t nucleotide c a các afaC ñã ñ xu t c p m i afa- f và afa- r ñ c hi u cho nhóm gien afa [26] 1.3.2.3 Cơ ch và tình hình kháng kháng sinh c a E coli Vi khu n t n t i hơn 3 t năm trên trái ñ t và r t lão luy n trong vi c t b o v mình ch ng l i các ch t hóa h c Kháng sinh ñư c s d ng trên lâm sàng m i ch hơn 6 th p k , nhưng hi n nay kháng kháng sinh là m t v n ñ toàn c u c n ñư . tỷ lệ các gien này của E. coli gây NKTN trên bệnh nhân Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài Xác ñịnh tỷ lệ mang gien pap, afa và tình hình kháng kháng sinh của các chủng E. coli gây. coli gây nhiễm khuẩn tiết niệu với hai mục tiêu sau: 1. Xác ñịmh tỷ lệ mang gien pap, afa ở các chủng E. coli gây NKTN. 2. ðánh giá mức ñộ kháng kháng sinh của các chủng E. coli gây NKTN loại E. coli thuộc họ Enterobacteriacae. Tác giả Tộc Giống Loài Ewing (1986) Escherichieae Escherichia E. coli CDC (1989) Escherichia – Shigella E. coli Bergey ’ s (1995) Escherichia E. coli