BỘ Y TẾ BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN (VNNB), XÁC ĐỊNH VAI TRÒ GÂY BỆNH CỦA VIRUS VNNB GENOTYP CH NHIM TI: pgs.TS Phan Thị Ngà Cơ quan chủ trì đề tài: Viện vệ sinh dịch tễ trung −¬ng 7502 03/9/2009 HÀ NỘI - 2008 BỘ Y TẾ BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN (VNNB), XÁC ĐỊNH VAI TRÒ GÂY BỆNH CỦA VIRUS VNNB GENOTYP Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS PHAN THỊ NGÀ Cơ quan chủ trì đề tài: VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG Cấp quản lý: B Y T MÃ số đề tài (nếu có): Thời gian thực hiện: từ tháng năm 2006 đến tháng năm 2008 Tổng kinh phí thực đề tài: 300 triệu đồng Trong kinh phí nghiệp khoa học: 300 triệu đồng Nguồn khác có NĂM 2008 BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ Tên đề tài: Nghiên cúu dịch tễ học phân tử virus viêm não Nhật Bản (VNNB), xác định vai trò gây bệnh virus VNNB genotyp Chủ nhiệm đề tài: PGS TS PHAN THỊ NGÀ Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y Tế Thư ký đề tài: CN Nguyễn Viết Hồng Phó chủ nhiệm đề tài ban chủ nhiệm đề tài (nếu có): Danh sách người thực chính: - PGS TS Phan Thị Ngà BS Đỗ Phương Loan CN Nguyễn Việt Hoàng KS Bùi Minh Trang KTV Lê Thị Hiền Thu Ths Tống Thị Hà Ths Hoàng Minh Đức TS Nguyễn Thị Thuỳ Dương BS Nguyễn Văn Hoà BS Hoàng Anh Vường TS Vũ Thị Quế Hương Ths Huỳnh Thị Kim Loan Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương Quân Y viện 108 Viện Vệ Sinh Dịch tễ Tây Nguyên Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh Các đề tài nhánh (đề mục) đề tài (nếu có): (a) Đề tài nhánh (đề mục 1) - Tên đề tài nhánh: - Chủ nhiệm đề tài nhánh: (b): Đề tài nhánh - Tên đề tài nhánh: - Chủ nhiệm đề tài nhánh: Thời gian thực đề tài từ tháng năm 2006 đến tháng 12 năm 2008 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT a.a Axit amin (amino acide) Arbo Arthropod borne (mang côn trùng tiết túc) ADN Desoxyribonucleic Acid - DNA (Axit desoxyribonucleic) ARN Ribonucleic Acid - RNA (Axit Ribonucleic) cDNA Complement DNA (ADN bổ trợ) ELISA Enzym Linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch enzym) E-MEM Eagle Minimum Essential Medium E Envelope (vỏ bao) kd Kilodalton NS Non-structural protein - protein không cấu trúc PFU Plaque forming unit (đơn vị tạo đám hoại tử = virus) RT-PCR Reverse Transcriptase polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi chép ngược) HCNC Hội chứng não cấp Tế bào BHK21 Tế bào có nguồn gốc thận chuột Hamster đẻ (Baby Hamster Kidney cells) Tế bào Vero Tế bào có nguồn gốc từ thận khỉ xanh châu Phi VNNB Viêm não Nhật Bản MỤC LỤC PHẦN A: Báo cáo tóm tắt Tóm tắt kết nghiên cứu Bản tự đánh giá kết nghiên cứu đề tài PHẦN B: Báo cáo chi tiết Chương ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Tóm lược nghiên cứu nước 1.2 Giả thiết nghiên cứu đề tài 1.3 Mục tiêu nghiên cứu đề tài Chương TỔNG QUAN 2.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước liên quan tới đề tài 10 2.2 Tình hình nghiên cứu nước liên quan đến đề tài 21 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thiết kế nghiên cứu 25 3.2 Chọn mẫu, đối tượng nghiên cứu 25 3.3 Phương pháp nghiên cứu: 27 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 43 Chương BÀN LUẬN 59 Chương KẾT LUẬN 70 KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC: - Bảng xác nhận chi tiêu tài 78 - Minh chứng đào tạo (văn tốt nghiệp đại học) - Minh chứng kết so sánh trình tự nucleotide vùng gen E 79 số chủng virus VNNB genotyp 80 - Minh chứng báo khoa học liên quan đến đề tài 82 PHẦN A BÁO CÁO TÓM TẮT TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1.1 Mục đích nghiên cứu Đề tài nghiên cứu thực nhằm đạt mục đích sau: - Nghiên cứu dịch tễ phân tử virus VNNB số vùng Việt Nam - Xác định vai trò gây bệnh virus VNNB genotyp kỹ thuật sinh học phân tử mơ hình thực nghiệm động vật cảm thụ 1.2 Kỹ thuật sử dụng nghiên cứu Để đạt mục đích nghiên cứu đề tài, sử dụng kỹ thuật phân lập virus VNNB từ muỗi, lợn, người Kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR, Sequencing (giải trình tự gen) Các phần mềm sinh học ứng dụng phân tích kết kỹ thuật giải trình tự gen, so sánh cặp xếp đa trình tự, phân tích biến đổi trình tự acid amine vùng gen E; xây dựng phát sinh loài phần mềm xây dựng đồ dịch tễ học genotyp virus VNNB Việt Nam năm 1988 – 2007 để mối liên quan genotyp virus VNNB Cỡ mẫu sử dụng cho nghiên cứu 34 chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân, từ muỗi, lợn năm 1988 - 2007 1.3 Các tiêu chí đánh giá kết nghiên cứu Đánh giá kết nghiên cứu đề tài dựa tiêu chí sau: - Phân lập chủng virus VNNB từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân có hội chứng não cấp tế bào Aedes albopictus dòng C6/36 Kết định loại virus VNNB xác định kỹ thuật ELISA Sandwich; - Các chủng virus VNNB khuếch đại vùng gen E kỹ thuật RT-PCR trực tiếp Sản phẩm kỹ thuật PCR sử dụng để tinh sạch, làm khn để tổng hợp đoạn PCR cho giải trình từ gen mồi xuôi mồi ngược thiết kế vùng gen E đặc hiệu với virus VNNB để xác định tồn trình tự vùng gen E dài 1500 nucleotide - Xác định đặc điểm di truyền virus VNNB qua kết giải trình tự gen phân tích đoạn gen E (Envelope), sở xây dựng phát sinh lồi virus VNNB, vẽ đồ dịch tễ phân bố virus VNNB genotyp genotyp Việt Nam; - Khẳng định virus VNNB genotyp có khả gây bệnh kỹ thuật sinh học phân tử thực nghiệm động vật cảm nhiễm 1.4 Vật liêu phương pháp 1.4.1 Vật liệu Trong nghiên cứu này, sinh phẩm trang thiết bị cần thiết cho nghiên cứu cung cấp đầy đủ Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu thực theo quy trình chuẩn thức phịng thí nghiệm theo hướng dẫn nhà sản xuất sinh phẩm 1.4.2 Phương pháp Phần mềm tin sinh học DNA Star-Lasegene (Madison, Wisconsin, USA) MEGA 4.0 (USA) ứng dụng để nghiên cứu, đánh giá phân tích đặc điểm di truyền mức độ phân tử chủng virus VNNB Trình từ vùng gen E dài 1500 nucleotide chủng virus thực nghiên cứu chủng đại diện cho genotyp khác lấy ngân hàng gen so sánh cặp xếp đa trình tự theo chương trình ClustalW Cây phát sinh lồi vẽ phương pháp NeibourJoining (Saito&Nei 1987) với giá trị để tính phần trăm lặp lại (giá trị tin cậy) nhánh phát sinh 1000 lần Chọn giá trị ngưỡng 12 % khác số nucleotide để phân chia genotyp virus VNNB Cây phát sinh loài sở để xác định mối quan hệ mặt di truyền chủng virus VNNB Tính tương đồng khơng tương đồng trình tự nucleotide chủng virus VNNB tính phần mềm DNAStar-Lasegene Phần mềm vẽ đồ HealthMap 8.1 sử dụng để xây dựng đồ lưu hành genotyp virus VNNB khác mức độ địa giới hành phân chia cấp độ tỉnh Ngồi ra, có sử dụng thuật tốn thống kê sử dụng nghiên cứu: Excel, SPSS; thuật toán thống kê sinh học chuyên sâu sử dụng nghiên cứu UPGMA, Neibour-Joining 1.5 Kết nghiên cứu đề tài xác định: - Dịch tễ phân tử virus VNNB số vùng Việt Nam dựa kết giải trình tự phân tích vùng gen E 34 chủng virus VNNB phân lập năm 1988 – 2007 khẳng định: Virus VNNB genotyp lưu hành bốn miền Bắc, Trung, Nam Tây Nguyên từ mẫu phân lập virus có nguồn gốc muỗi, lợn năm 2001 – 2007; xác định có lưu hành đồng thời virus VNNB genotyp genotyp Việt Nam năm từ năm 1990 2007 - Vai trò gây bệnh virus VNNB genotyp khẳng định kỹ thuật sinh học phân tử với 27 chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân năm 1988 – 2007: (1) Kết xác định có chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân ký hiệu 90VN70 xác định thuộc genotyp 1, chiếm tỷ lệ thấp 1/27 (3,7 %); có 26 chủng phân lập từ bệnh nhân thuộc genotyp 3, chiếm tỷ lệ cao số chủng phân lập từ người 26/27 (96,3 %) Trên động vật cảm thụ (chuột Swiss trằng), chủng virus 90VN70 gây ốm, liệt chuột ổ chuột 11 – 13 gam sau - ngày gây nhiêm, khẳng định độc lực tính hướng thần kinh virus VNNB genotyp 1.6 Các kết khác liên quan với khoa học, kỹ thuật kinh tế - Đã đào tạo 01 cử nhân sinh học có nghiên cứu liên quan đến đề tài - Có năm báo liên quan đến đề tài cơng bố tạp chí quốc gia quốc tế - Tham dự ba hội nghị khoa học nước quốc tế - Đăng ký trình tự vùng gen E số chủng vi rút VNNB genotyp genotyp ngân hàng gen quốc tế - Đã áp dụng chuẩn hoá số kỹ thuật sinh học phân tử kỹ thuật RT-PCR, kỹ thuật tinh ADN, kỹ thuật giải trình tự gen nghiên cứu dịch tễ phân tử virus VNNB 1.7 Từ kết nghiên cứu đề tài đưa kết luận sau - Đã xây dựng phát sinh loài đồ dịch tễ lưu hành virus VNNB genotyp genotyp dựa trình tự vùng gen E 34 chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân, muỗi, lợn, năm 1988 – 2007 Xác định virus VNNB genotyp lưu hành bốn miền Bắc, Trung, Nam Tây Nguyên muỗi, lợn năm 2001 - 2007 - Trong số 27 chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân năm 1988 – 2007, tỷ lệ phân lập virus VNNB genotyp từ bệnh nhân chiếm tỷ lệ thấp 3,7 % (1/27), phần lớn chủng phân lập từ bệnh nhân thuộc genotyp 3, chiếm tỷ lệ cao 96,3 % (26/27) Xác định virus VNNB genotyp có độc lực tính hướng thần kinh với động vật cảm thụ (chuột ổ chuột 11 – 13 gam) Để xác định nhanh genotyp virus thực theo phương pháp giải trình tự gen hai đầu mồi xuôi mồi ngược đặc hiệu Tuy nhiên, để xây dựng phát sinh loài, nghiên cứu tiến hoá virus cần phải giải trình từ tồn vùng gen E dài 1500 nucleotide Nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus VNNB năm 90 thực Chen cộng dựa vùng gen PrM, xác định virus VNNB có genotyp Trong nghiên cứu Solomon 2003 dịch tễ học phân tử virus VNNB dựa vùng gen E xác định virus VNNB có nhóm genotyp Genotyp gồm chủng virus VNNB phân lập từ Đông Nam Á, Australia, Triều Tiên Nhật Bản Genotyp gồm chủng virus phân lập từ Malaysia, Indonesia Australia Genotyp gồm chủng virus VNNB phân lập từ Đông Nam Á, Nhật Bản, Trung Quốc, Triều Tiên, Đài Loan tiểu lục địa Châu Á Genotyp có chủng virus VNNB phân lập từ muỗi Indonesia genotyp có chủng virus VNNB phân lập từ chim Singapore [18,23,32,34,40,42,50] Như genotyp virus VNNB, genotyp ghi nhận có lưu hành nhiều nước Châu Á Trên thực tế virus VNNB genotyp phân lập từ bệnh nhân, ổ chứa virus (lợn, chim), muỗi nhiều nơi giới Ngược lại, phần lớn chủng virus VNNB thuộc genotyp phân lập từ muỗi máu lợn, có chủng virus VNNB thuộc genotyp phân lập từ não tử thi Thái Lan năm 1979 1984 [42,50] Trong nghiên cứu này, dựa kết xác định genotyp virus VNNB phân lập Việt Nam năm 1988 – 2007, xác định chủng virus 64 VNNB phân lập từ muỗi, lợn năm 2001 – 2007 thuộc genotyp Như vậy, virus VNNB genotyp xác định lưu hành rộng rãi miền Bắc (Hà Tây), miền Trung (Quảng Bình), miền Nam (Long An, Cần Thơ) Tây Nguyên (Gia Lai) muỗi, lợn (hình 4.3) Kết nghiên cứu phù hợp với số nghiên cứu khác giới lần khẳng định VNNB genotyp thích ứng với muỗi, lợn người Nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus VNNB trước năm 1990 xác định chủng virus VNNB phân lập từ người, từ muỗi, từ lợn từ chim Việt Nam thuộc genotyp [23,42] Như vậy, với xuất virus VNNB genotyp 1, Việt Nam lưu hành hai genotyp virus VNNB genotyp genotyp (hình 4.5) Do khơng thực giải trình tự gen tồn chủng virus VNNB phân lập từ muỗi lợn mà chọn số lượng chủng phân lập được, nên khơng thể xác định tỷ lệ mang virus VNNB genotyp genotyp quần thể muỗi Sự xuất virus VNNB genotyp số nước vùng cận nhiệt đới châu Á năm gần Nhật Bản, Triều Tiên, Việt Nam chim di cư mang virus, chúng ổ chứa nguồn lây truyền virus sang muỗi tự nhiên Chính từ năm 2003, nghiên cứu tiến hoá virus VNNB châu Á, Solomon cộng cho vùng Đơng Nam châu Á vùng tiềm tàng lưu hành nhiều loại virus chưa phát hiện, vùng trọng điểm xuất nguyên giới [17,35,46,47,65,66] Virus VNNB lan rộng vài thập kỷ gần đây, nhiên lý lan rộng đến khu vực chưa sáng tỏ, có giả thiết cho chim di cư mang virus tới muỗi Cx Tritaeniorhynchus bay xa điều kiện tự nhiên định, mang xa gió 65 vài trường hợp ví dụ xuất số lượng muỗi mang virus tầu thuỷ máy bay vùng Nam Á Đơng Á góp phần làm phát tán virus VNNB từ vùng đến vùng khác [46,65] Điều đề cấp tới xuất lan rộng virus Tây sông Nil Hoa Kỳ năm gần [44] Sự lây lan virus từ vùng đến vùng khác chim di cư nhiễm virus huyết giải thích hợp lý Mongolia Korea Japan China Thai Vietnam Philippines Cambodia Malaysia Indonesia Australia Hình 5.1 Đường di cư chim từ Châu Á tới Đại Tây dương [42] Tuy nhiên, chưa phân lập virus VNNB từ loài chim di cư để làm chứng khoa học khẳng định cho giải thiết Do vậy, cần có nghiên cứu phát virus VNNB từ số loài chim di cư chim hoang dại để chứng minh cho giả thiết 66 Kết phân tích tiến hố chủng virus VNNB không phù hợp với chủng virus VNNB genotyp mà phù hợp với chủng virus VNNB genotyp tính tương đồng vật liệu di truyền chủng virus VNNB phân lập vùng địa lý khác nhau, khoảng thời gian gần Ví dụ, chủng virus phân lập khoảng thời gian gần từ Việt Nam, Nam Triều Tiên Nhật Bản có liên quan gần chủng với genotyp (hình 4.4) Trong nghiên cứu này, trình tự vùng gen E chủng virus VNNB phân lập Việt Nam thập kỷ 60, 70 80 xác định thuộc nhóm genotyp Chính chủng Nakayama Nhật Bản, Beijing-1 SA 14 Trung Quốc sử dụng để sản xuất vắc-xin VNNB phòng bệnh Việt Nam giới [7,21,23,26,29,37,39] 5.2 Xác định vai trò gây bệnh virus VNNB genotyp 5.2.1 Phát virus VNNB genotyp từ bệnh nhân Để xác dịnh vai trò gây bệnh virus VNNB genotyp 1, nghiên cứu giải trình tự gen chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân thời điểm nghiên cứu năm trước sử dụng cho mục đích Trong tổng số 27 chủng virus VNNB phân lập năm 1988 – 2007, so sánh phân tích trình tự vùng gen E xác định chủng virus VNNB phân lập năm 1990 có ký hiệu 90VN70 thuộc genotyp Như vậy, tỷ lệ phân lập virus VNNB genotyp thấp có khoảng 3,7 % tổng số chủng phân lập từ bệnh nhân Kết nghiên cứu phù hợp với nhận định, virus VNNB genotyp thích ứng với muỗi, lợn người Kết nghiên cứu nhóm tác giả Nhật Bản phát 67 vật liệu di truyền virus VNNB genotyp genotyp từ số mẫu dịch não tủy cho thấy virus VNNB genotyp có khả gây bệnh [30,42,62] Hơn nữa, nghiên cứu thử nghiệm chuột ổ chuột 11 – 13 gam, cho thấy chuột ổ chuột 11 – 13 gam nhậy cảm với chủng virus VNNB genotyp phân lập từ người có ký hiệu 90VN70 gây nhiễm virus cho chuột theo đường tiêm vào não, chuột bị ốm liệt sau – ngày gây nhiễm Kết lần khẳng định tiến hành thử nghiệm với chủng virus VNNB genotyp phân lập từ muỗi máu lợn Trên thực tế có số động vật nhậy cảm với virus VNNB, nhiên cịn phụ thuộc vào đường tiêm, liều lượng tuổi động vật thử nghiệm Nghiên cứu cho thấy, với chuột trưởng thành, tiêm virus VNNB chủng độc lực theo đường phúc mạc, chuột không bị ốm, liệt [38] Ngược lại, nghiên cứu so sánh độc lực virus VNNB genotyp với genotyp thực mơ hình động vật thực nghiệm, xác định độc lực virus VNNB genotyp thấp so với chủng virus VNNB genotyp Cho đến nay, chủng virus VNNB genotyp phân lập từ muỗi, chưa có cơng bố việc phát virus VNNB genotyp từ bệnh nhân, cho thấy virus VNNB genotyp có khả gây bệnh cho người [2,42,50,62] So sánh trình tự nucleotide vùng gen E chủng virus VNNB genotyp phân lập từ bệnh nhân Việt Nam năm 1988 – 2007 cho thấy khoảng thời gian 20 năm, sai khác nucleotide chủng virus VNNB lớn % chủng genotyp chọn để so sánh Như vậy, tốc độ tiến hoá cúa chủng virus VNNB chậm, khoảng %, phù hợp với kết nghiên cứu công bố trước [1, 23] 68 Sự xuất virus VNNB genotyp khu vực châu Á lần công bố Nam Triều Tiên, Nhật Bản vào năm 1994; tiếp cơng bố Việt Nam vào năm 2004 chủng virus genotyp phân lập từ muỗi lợn Trong nghiên cứu gần đây, phát có mặt vật liệu di truyền virus VNNB genotyp genotyp mẫu dịch não tuỷ bệnh nhân Nhật Bản, chưa phân lập virus VNNB genotyp từ bệnh nhân [19,34,40] Trong nghiên cứu này, chủng virus VNNB genotyp lần phát từ bệnh nhân Việt Nam năm 1990, khẳng định virus VNNB genotyp có khả gây bệnh Như vậy, virus VNNB genotyp xuất Việt Nam từ năm 1990, sớm so với công bố trước lưu hành virus VNNB genotyp năm đầu kỷ 21 từ muỗi máu lợn miền Bắc Việt Nam [1,42] Tương tự vậy, nghiên cứu dịch tễ học phân tử chủng virus VNNB phân lập Trung Quốc năm 1949 – 2005 phát virus VNNB genotyp lưu hành Trung Quốc từ năm 1979 từ muỗi Tuy nhiên, số 135 chủng virus VNNB phân lập Trung Quốc giải trình tự vùng gen E để xác định lưu hành genotyp, phát virus VNNB genotyp từ muỗi máu lợn, chưa phát virus VNNB genotyp từ bệnh nhân [62] Như vậy, nghiên cứu dịch tễ học phân tử xuất virus VNNB châu Á chủng virus VNNB phân lập năm 1949 - 2007 cho thấy: virus VNNB genotyp xuất Trung Quốc (1979), tiếp Việt Nam (1990) sau Nam Triều Tiên Nhật Bản (1994) Như vậy, với phát virus VNNB genotyp từ bệnh nhân Việt Nam năm 1990, sau công bố trước Thái Lan năm 1979 – 1984 chủng virus VNNB genotyp phân lập từ bệnh nhân Có thể nói, 69 chủng virus VNNB genotyp phát từ bệnh nhân châu Á khoảng thời gian 1985 – 2007 Trong năm gần đây, có xuất genotyp số vùng địa lý, chưa có chứng khoa học để giải thích cho xuất Nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus VNNB thường dựa vào kết phân tích trình tự vùng gen mã hoá cho protein cấu trúc phi cấu trúc vùng gen E, PreM NS5 [28,54,62] Ngược lại, chưa có cơng bố đề cập đến kết xác định trình tự vùng gen khơng mã hố đầu UTR’3 chủng virus VNNB Có giả thiết cho rằng, nghiên cứu trình tự vùng gen UTR’3 góp phần giải thích xuất genotyp số vùng địa lý 70 KẾT LUẬN 6.1 Nghiên cứu dịch tễ phân tử virus VNNB số vùng Việt Nam dựa số liệu phân tích trình tự vùng gen E 34 chủng virus VNNB phân lập năm 1988 – 2007 xác định: Virus VNNB genotyp lưu hành bốn miền Bắc, Trung, Nam Tây Nguyên phân lập từ muỗi, lợn năm 2001 – 2007, xác định có lưu hành đồng thời virus VNNB genotyp genotyp Việt Nam khoảng thời gian từ 1990 đến 2007 6.2 Nghiên cứu xác định vai trò gây bệnh virus VNNB genotyp kỹ thuật sinh học phân tử với 27 chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân năm 1988 – 2007 khẳng định: (1) Có chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân ký hiệu 90VN70 xác định thuộc genotyp 1, chiếm tỷ lệ thấp 1/27 (3,7 %), có 26 chủng phân lập từ bệnh nhân thuộc genotyp 3, chiếm tỷ lệ cao số chủng phân lập từ người 26/27 (96,3 %) Trên mơ hình động vật cảm thụ, chủng virus 90VN70 gây ốm, liệt chuột ổ chuột 11 – 13 gam sau - ngày gây nhiễm virus, khẳng định độc lực hướng tính thần kinh virus VNNB genotyp Lời cảm ơn: Tập thể tác giả trân trọng cảm ơn hỗ trợ phần kinh phí Bộ Y tế cho nghiên cứu đề tài 71 KHUYẾN NGHỊ Dựa kết nghiên cứu đề tài, phát chủng virus VNNB genotyp từ người Việt Nam khu vực Châu Á từ năm 1990 trở lại Cần thực nghiên cứu giải mã toàn vật liệu di truyền chủng virus, sở cho nghiên cứu để góp phần làm sáng tỏ virus VNNB genotyp lại thích ứng với người Trong nghiên cứu này, không phân lập virus VNNB từ dịch não tuỷ bệnh nhân Gia Lai, Tây Nguyên; phân lập chủng virus Banna, loại virus muỗi truyền thuộc họ Reoviridae Do vậy, cần có nghiên cứu để xác định vai trò gây bệnh loài muỗi véc-tơ truyền virus Banna Việt Nam CƠ QUAN CHỦ QUẢN CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI PGS TS PHAN THỊ NGÀ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Nguyễn Viết Hoàng, Đỗ Phương Loan, Bùi Minh Trang, Lê thị Hiền Thu, Phan thị Ngà Phát IgM kháng vi rút viêm não Nhật Bản (VNNB) kháng nguyên virus VNNB genotyp Tạp chí Y học dự phịng tập XVIII, số (93): 16 - 19 Nguyễn Viết Hoàng, Đỗ Phương Loan, Bùi Minh Trang, Lê thị Hiền Thu Phan thị Ngà Phát xuất virus Viêm não Nhật Genotype miền Trung, Miền nam, Tây nguyên, Việt nam Tạp chí Y học dự phòng tập XVIII, số 2008 Đỗ phương Loan, Đặng đình Thoảng, Bùi Minh Trang, Nguyễn Viết Hồng, Lê thị hiền Thu, Phan thị Ngà Phát tàn suất nhiễm vi rút viêm não Nhật Bản quần thể lợn Hà Nam kỹ thuật GAC-ELISA.Tạp chí Y học dự phòng tập XVIII, số Phan Thị Ngà, Nguyễn Thị Kiều Anh, Vơng Đức Cờng, Vũ Sinh Nam, Phạm Thị Minh Hằng, Trần Văn Tiến Giám sát chẩn đoán viêm nÃo Nhật ë ViƯt nam, 2001 – 2002 T¹p chÝ Y häc dù phßng 2003, tËp XII, sè (55): – 11 Phan Thị Ngà, Vũ Sinh Nam, Masahiro Takagi Nghiên cứu tồn vi rút viêm nÃo Nhật Bản tự nhiên Tạp chí Y học dự phòng 2004, tËp XIV, sè (64): 21 – 26 Phan Thị Ngà, Mary B Crabtree ứng dụng kỹ thuật RT-PCR ph¸t hiƯn vËt liƯu di trun cđa mét sè vi rút gây hội chứng nÃo cấp Việt Nam Tạp chÝ Y häc dù phßng 2004, tËp XIV, sè (70): 5-10 Phan thị Ngà, Đoàn Hải Yến, Phạm Đỗ Quyên Phát kháng thể kháng virut viêm não Nhật (VNNB) huyết trẻ em tiêm phòng vắc-xin VNNB Tạp chí Y học dự phịng tập XVI, số (85): – 10 Phan thị Ngà, Đoàn thị Hải Yến, Phạm đỗ Quyên, Nguyễn Thuỷ, Huang Claire Giám sát nguyên virut viêm não Nhật bản, virut West Nile virut Nam định gây hội chứng não cấp kỹ thuật MACELISA Tạp chí nghiên cứu Y học, tập 36, số 3: 18 – 24 Phan thị Ngà, Nguyễn Thuỷ, Bùi Minh Trang, Nguyễn thị Tuấn, Đặng tuấn Đạt, Nguyễn Trần Hiển Phát thành viên virut thuộc họ Reoviridae gây hội chứng não cấp tỉnh Gia Lai, 2005 Tạp chí Y học dự phòng tập XVII, số (87): – 10 Đặng Đình Thoảng, Nguyễn Ngọc Tâm, Bùi Minh Trang, Nguyễn thị Yên, Phan thị Ngà Nghiên cứu biến động xác định véc tơ truyền 73 vi rút Viêm não Nhật Tỉnh Hà Nam, 2006-2007 Tạp chí Y học dự phịng tập XVIII, số 3(95) 2008 11 Đặng Đình Thoảng, Phan thị Ngà, Nguyễn Thu Yến, Nguyễn lập Quyết Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh viêm não Nhật Bản tỉnh Hà Nam từ năm 2001 đến năm 2006.Tạp chí Y học dự phịng tập XVIII, số (93): - Tài liệu tham khảo tiếng Anh 12 Ali, A & Igarashi, A (1997 Antigenic and genetic variations among Japanese encephalitis virus strains belonging to genotype Microbiol Immunol 41, 241–252 13 Ali A, Igarashi A, Paneru LR, Hasebe F, Morita K, Takagi M, Suwonkerd YT, Wada Y, 1995 Characterization of two Japanese encephalitis virus isolated in Thailand Arch Virol 140.1557–1575 14 Asahina, S On the transoceanic flight of mosquitoes Jap J Sanit Zool 1970, 21: 121 15 Asahina, S Transoceanic flight of mosquitoes on the northwest Pacific Jap J Sanit Zool 1970, 23: 255-258 16 Brinton MA, Dispoto JH, 1988 Sequence and secondary structure analysis of the -terminal region of avivirus genome RNA Virology 162.290–299 17 Buescher, E.L., Scherer, W.F., Mc Clure, H.E., Moyer, J.T., Rosenberg, M.Z., Yoshii, M & Okada, Y (1959) Ecologic studies of Japanese encephalitis virus in Japan IV Avian infection Am J Trop Med Hyg 1959, 8: 678-688 18 Chen, D., Wang, H Y., Fu, S H., Song, H., Deng, J., Yang, Y L & Liang, G D (2005) Molecular characteristics of three new isolates of Japanese encephalitis virus in Fujian Province Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi 19, 5–8 (in Chinese) 19 Chung Y, Nam J, Ban S, Cho H, (1996) Antigenic and genetic analysis of Japanese encephalitis viruses isolated from Korea Am J Trop Med Hyg 55.91–97 20 Hanna, J.N., Ritchie, S.A., Phillips, D.A., Shield, J., Bailey, M.C., Mackenzie, J.S., Poidinger, M., McCall, B.J & Mills , P.J An outbreak of Japanese encephalitis in the Torres Strait, Australia, 1995 Med J Aust 1996, 165: 256-260 21 Hasegawa, H., Masamichi, Y., Fujita, S., & Kobayashi , Y Comparison of structural proteins among antigenically different Japanese encephalitis virus strains Vaccine 1994, 12: 841-844 22 Holbrook, M.R & Barrett, A.D.T Molecular epidemiology of Japanese encephalitis virus In Current topics in microbiology and Immunology: 74 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Japanese encephalitis and West Nile virus infections, 2002, vol.267: 7590 Edited by J.S mackenzie, A.D Barret & V Deubel Berlin: Springer-Verlag Huong VTQ, Ha DQ, Deubel V, (1993) Genetic study of Japa nese encephalitis viruses from Vietnam Am J Trop Med Hyg 49.538–544 Igarashi, A Epidemiology and control of Japanese encephalitis World Health Stat Q 1992, 45: 299-305 Igarashi, A., Tanaka, M., Morita, A., Takasu, T., Ahmed, A., Akram, D.S & Wakar , M.A (1994) Detection of West Nile and Japanese encephalitis viral genome sequences in cerebrospinal fluid from acute encephalitis cases in Karachi, Pakistan Microbiol Immunol 1994, 38: 827-830 Jan L., Yueh Y Y., Wu Y C et al Genetic Variation of Japanese Encephalitis virus in Taiwan Am Trop Med Hyg 2000, 62(4): 446452 Kimura K J., Yasui K Antigenic comparison of envelope glycoprotein E between Japanese Encephalitis virus and some other flaviviruses using monoclonal antibodies J Gen Virol 1986, : 2663-2672 Kuno G Universal diagnostic RT-PCR protocol for arboviruses J Virol Methods 1998 (72): 27 – 41 Kuno G., Chang G J J., Tsuchiya K R., Karabatsos N., and Cropp C B Phylogeny of the genus Flavivirus Journal Virol 1998, 72: 73 – 83 Kuwayama M., Ito M., Takao S., Shimazu Y., Fukuda S., Miyazaki K., Kurane I and Takasaki T Detection of Japanese Encephalitis virus genome in cerebrospinal fluids from meningitis patients in Japan Emerging Infectious Disesea 2005, 11: 471 – 473 Laird, M Reactions of mosquitoes to the aircraft enviroment Trans R Soc NZ 1948, 77: 93-114 Li, X Y., Song, H., Fu, S H., Wang, H Y., Yu, Y X., Dong, G M., Tao S J., Chen, D., Kurane, I & Liang, G D (2004) The molecular biology of Japanese encephalitis viruses isolated in China Chin J Virol 20, 200–209 Lowry, P.W., Truong, D.T., Hinh, L.D., Ladinsky, J.L., Karabatsos, N., Cropp, C.B., Martin, D & Gubler, D.J Japanese encephalitis among hospitalized pediatric and adult patients with acute encephalitis syndrome in Hanoi, Vietnam 1995 Am J Trop Med Hyg 2000, 58: 324329 Ma, S.P., Yoshida, Y., Makino, Y., Tadano, M., Ono, T &Ogawa, M A major genotype of Japanese encephalitis virus currently circulating in Japan Am J trop med Hyg 2003, 69: 151-154 75 35 Mackenzie, J.S., Johansen C.A., Ritchie, S.A., Van den Hurk, A.F & Hall, R.A Japanese encephalitis as an emerging virus: The emergence and spread of Japanese encephalitis virus in Australia In Current topics in microbiology and Immunology: Japanese encephalitis and West Nile virus infections 2002, vol.267: 49-73 Edited by J.S mackenzie, A.D Barret & V Deubel Berlin: Springer-Verlag 36 Mackenzie, J.S., Poidinger, M., Phillips, D., Johansen C.A., Hall, R.A., Hanna, J., Ritchie, S., Shield, J., & Graham, R Emergence of Japanese encephalitis virus in the Australasian region In Factors in the emergence of arbovirus diseases 1997: 191-201 Edited by J.F Saluzzo & B Dodet Paris: Elsevier 37 Mangada, M N M., & Takegami, T Molecular characterization of the Japanese encephalitis virus representative immunotype strain JaGAr01 Virus Res 1999, 59: 101-112 38 Monath, T.P & Heinz, F.X Flaviviruses In Fields, Knipe and Howley’s Fields Virology, 1996 3rd Edition, vol 1: 961-1034 Edited by R.M Chanock, J.L Melnick, T.P Mpnath, B Roizman & S.E Straus Philadelphia: Lippincott-Raven 39 Nam, J H., Chae, S L., Won, S Y., Kim, E J., Yoon, K S., Kim, B I Jeong, Y S & Cho, H W Genetic heterogeneity of Japanese encephalitis virus assessed via analysis of the full-length genome sequence of a Korean isolate Am J Trop Med Hyg 2001, 65, 388–392 40 Nam, J.H., Chung, Y.J., Ban, S.J., Kimu, A.J., Park, Y.K & Cho , H.W Envelope gene sequence variation among Japanese encephalitis viruses isolated in Korea Acta 1996, Virol 40: 303-309 41 Nerome R., Tajima S., Takasaki T., Yoshida T., Kotaki A., Lim C K., Ito M., Sugiyama A., Yamanchi A Yano T., Kameyama T., Morishita I., Kuwayama M., Ogawa T., Sahara K., Ikegaya A., Kanda M., Hosoya Y., Itokazu K., Onishi H., Chiya S., Yoshida Y., Tabei Y., Katsuki K., Tabata K., Harada S., Kurane I Molecular epidemiology analyses of Japanese encephalitis virus isolates from swine in Japan from 2002 – 2004 J Gen Virol 2007, 88 (Pt 10): 2762 – 2768 42 Nga, P T., Parquet, M del C., Cuong, V D., Ma, S.-P., Hasebe, F Inoue, S., Makino, Y., Takagi, M., Nam, V S & Morita, K (2004) Shift in Japanese encephalitis virus (JEV) genotype circulating in northern Vietnam: implications for frequent introductions of JEV from Southeast Asia to East Asia J Gen Virol 85, 1625–1631 43 Ni, H., & Barret, A D T Nucleotide and deduced amino acid sequence of the structural protein genes of Japanese encephalitis viruses from different geographical locations J Gen Virol 1995, 76, 401-407 76 44 Oya A., Kurane I Japanese encephalitis for a reference to international travelers J Travel Med 2007, 14 (4): 259 – 268 45 Parida M., Dash P K., Sekhar K et al Japanese encephalitis outbreak, India, 2005 Emerging Infectious Disease 2006, Vol 12, No 9: 1427 – 1430 46 Ree, H.I., Hong, H.K., Lee, J.S., Wada, Y & Jolivet, P Dispersal experiment on Culex tritaeniorhyncus in Korea Report NIH, Korea1975, 12: 235-242 47 Ritchie, S.A & Rochester, W Wind-blown mosquitoes and introduction of Japanese encephalitis into Australia Emerging Infect Dis 2001, (suppl 5): 900-903 48 Saitou N, Nei M The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees Mol Biol Evol 1987 Jul;4(4):406-25 49 Shah P S., Tanaka M., Khan A H., Mathenge E G., Fuke I., Takagi M., Igarashi A., Morita K Molecular characterization of attenuated Japanese Encephalitis live vaccine strain ML-17 Vaccine 2006 (24): 402-411 50 Solomon, T., Ni, H., Beasley, D W C., Ekkelenkamp, M., Cardosa, M, J, & Barrett, A D T (2003) Origin and evolution of Japanese encephalitis virus in southeast Asia J Virol 77, 3091-3098 51 Srivastava A.K., Aira Y., Mori C., Kobayashi Y., Igarashi A Antigenicity of Japanese Encephalitis virus envelope glycoprotein V3 (E) and its cyanogen bromide cleaved fragments examined by monoclonal antibodies and western blotting Arch Virol 1987, 96: 97107 52 Sumiyoshi H, Mori C, Fuke I, Morita K, Kuhara S, Kondou J Kikuchi Y, Nagamatu H,, Igarashi A, 1987 Complete nucleotide sequence of the Japanese encephalitis virus genome RNA Virology 161:497–510 53 Takano, S Identification of swallows In Wild birds identification handbook Japan: Japanese Wild Bird Association 1984 Taken from thehomepage[http://kawasemi.kserver.org/research/tubame/tubame_qa html] 54 Takegami, T., Hasanuddin, I., Miyamoto, C., Shirai, Y & Kamimura , K Isolation and moleculae comparison of Japanese encephalitis virus in Ishikawa, Japan Jpn J Infect Dis 2000, 53: 178-179 55 Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599 56 Thayan T., Morita K., Vijayamalar B., Chew T K., Sinniah M., Igarashi A Comparison of two different methods for the purification of 77 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 polymerase chain reaction (PCR) products used in direct sequencing, in an Applied Biosystems 373 DNA sequencing system Trop Med 1995, 37: 39-33 Tsai T F New initiatives for the control of Japanese Encephalitis by vaccination: Minutes of a WHO/CVI meeting, Bangkok, Thailand, 13 – 15 October 1998 Vaccine 2000, 18: – 25 Tsai, T.F Factors in the changing epidemiology of Japanese encephalitis and West Nile fever In Factors in the emergence of arbovirus diseases, 1997: 179-189 Edited by J.F Saluzzo & B Dodet Paris: Elsevier Uchil, P.D & Satchidanandam, V Phylogenetic analysis of Japanese encephalitis virus: envelope gene based analysis reveals a fifth genotype Geographic clustering, and multiple introductions of the virus into the Indian Subcontinent Am J Trop Med Hyg 1992, 65: 242-251 Vaughn, D.W & Hoke, C.H., Jr The Epi of Japanese encephalitis: prospects for prevention Epidemiol Rev 1992, 14: 197-221 Wada, Y., Kawai, S., Oda, T., Miyagi, I., Suenaga, O Nishigaki, J & Omori, N Dispersal experiment on Culex tritaeniorhyncus in Nagasaki area (preliminary report) Trop Med 1969, 11: 37-44 Wang H Y., Takasaki T., Fu S H., Sun X H., Zhang H L., Wang Z X., Hao Z Y., Liang X F., Yang W Z., Kurane I and Liang G D Molecular epidemiological of Japasese encephalitis virus in China Journal of General Virology 2007, 88: 855 – 894 Weaver, S.C., Powers, A.M., Brault, A.C & Barret, A.D.T Molecular epidemiological studies of veterinary arboviral encephalitides Vet J 1999, 157: 123-138 Williams, D.T., Lin-Fa, W., Daniels, P.W & Mackenzie, J.S Molecular characterization of the first Australian isolate of Japanese encephalitis virus, the FU strain J Gen Virol 2000, 81: 2471-2480 Williams, M Migration hub of the Orient: Beidaihe, China In Birding, the magazine of the American Birding Association (published in Oct 1994 and Feb 1995) Taken from the homepage 1994 [http://www.drmartinwilliams.com/beidaihe/beidaihebirding.html] World Wildlife Fund Migratory waterbirds in the East Asian – Australasian region In the homepage of the WWF Honk Kong 2000, [http://www.wwf.org.hk/eng/ maipo/bird_migrate/index html] Developed by Lemon (Asia) Limited Yoshida Y., Tabei Y., Hasegawa M., Nagashima M and Morozumi S Genotypic Analysis of Japanese Encephalitis virus strains isolated from swine in Tokyo, Japan J Infect Dis 2005, 58: 259 – 261 78 ...BỘ Y TẾ BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ VIRUS VI? ?M NÃO NHẬT BẢN (VNNB), XÁC ĐỊNH VAI TRÒ GÂY BỆNH CỦA VIRUS VNNB GENOTYP Chủ nhiệm đề tài:... truyền bệnh từ lợn (ổ chứa virus), cho thấy cần thiết nghiên cứu dịch tễ phân tử virus VNNB [18 ,24,32,34,36] Do vậy, thực đề tài: ? ?Nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus vi? ?m não Nhật Bản (VNNB), xác. .. QUẢ NGHIÊN CỨU 1. 1 Mục đích nghiên cứu Đề tài nghiên cứu thực nhằm đạt mục đích sau: - Nghiên cứu dịch tễ phân tử virus VNNB số vùng Vi? ??t Nam - Xác định vai trò gây bệnh virus VNNB genotyp kỹ