Kết quả xác định tỷ lệ nguồn cacbon và nitơ thích hợp cho sự sinh trưởng của giống nấm Thượng hoàng Phellinus linteus..... Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến giai đoạn nh
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Đặc điểm sinh học nấm Thượng hoàng
Nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus) là loại nấm dược liệu nổi tiếng thuộc chi Phellinus (Inonotus), họ Hymenochaetaceae, bộ
Aphyllophorales là một nhóm nấm thượng hoàng với 496 loài được ghi nhận trên toàn thế giới Nhiều loài trong nhóm này, như Phellinus linteus (còn gọi là Sanghuangporus linteus hoặc Inonotus linteus) và P baumii, nổi bật với hoạt tính dược học đáng chú ý.
Quả thể của loài nấm này có kích thước từ 2-10cm x 4-17cm, dày từ 1,5-7cm, với hình dạng bán nguyệt hoặc móng ngựa Chúng có cấu trúc cứng hoặc hóa gỗ, bề mặt màu sậm với lông ngắn, dần mất đi khi nấm trưởng thành, chuyển sang màu đen hoặc vàng sậm Mặt trên thường có màu vàng sáng, trong khi mặt dưới sẫm màu, bề mặt có thể nhẵn hoặc nứt Loài nấm này thường mọc ở những khu rừng sâu, núi cao hiểm trở và có thể sống hàng chục năm trong môi trường rừng nguyên sinh.
Hình 1 Quả thể nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus)
Giá trị dược liệu của chi nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus) Ngoài nước
Nấm Thượng hoàng được ghi nhận bởi những lợi ích cho sức khỏe và đã được sử dụng làm thuốc đông y hơn 2000 năm (Wenhua Chen và cs, 2019)
Nấm Thượng hoàng, theo y học cổ truyền Trung Quốc, được biết đến với nhiều tác dụng bồi bổ sức khỏe như cầm máu, loại bỏ cục máu đông, giảm đau bụng và trị tiêu chảy mãn tính (Wenhua Chen và cs, 2019) Chúng chứa nhiều hợp chất sinh học như polysaccharide, triterpenoid, phenylpropanoid, polyphenol và 12 loại Furan khác (Wenhua Chen và cs, 2019; Pingya He và cs, 2021) Nghiên cứu hiện đại đã chứng minh nấm Thượng hoàng có khả năng kháng viêm, tăng cường miễn dịch, chống oxi hóa, kháng vi sinh vật, chống ung thư, hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường, và bảo vệ gan cũng như hệ thần kinh (Gi-Young Kim và cs, 2003; Byung-Chul Kim và cs, 2007; Papawee Suabjakyong và cs, 2015; Wenhua Chen và cs, 2019).
Các polysaccharide, đặc biệt là β-glucan polymer, được coi là hợp chất quan trọng trong việc phát triển thuốc chống ung thư từ sản phẩm tự nhiên (Wenhua Chen và cs, 2019; Pingya He và cs, 2021) Gi-Young Kim và cs (2003) đã chiết xuất thành công proteo-heteroglycan từ nấm Thượng hoàng (P linteus), chứa 72,2% polysaccharide và 22,3% protein, với các đường mannose, galactose, glucose, arabinose và xylose Hợp chất này có khả năng tiêu diệt tế bào khối u thông qua việc sản sinh NO và tăng cường miễn dịch (Gi-Young Kim và cs, 2003) Sang Bae Han và cs (1999) đã chứng minh polysaccharide từ P linteus có khả năng ức chế sự sinh trưởng và di căn của tế bào ung thư mà không gây độc hại cho cơ thể Các polysaccharide này cũng làm tăng chức năng miễn dịch của tế bào Lympho T khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy hoặc tiêm vào chuột thí nghiệm (Hwan Mook Kim và cs, 1996) Ba chủng HN00K9, HN6036 và ASI26099 của P linteus được nuôi trồng và cho thấy chủng HN00K9 có hàm lượng β-glucan cao hơn 20% so với các chủng khác, đồng thời các polysaccharide từ các chủng này có khả năng ức chế cytokine (IL-6 và TNF-a) và chống lại nhiều loại tế bào ung thư ở người (Gyeong-Jin Min & Hee-Wan Kang, 2021).
Các polyphenol là hợp chất quan trọng trong khả năng chống ung thư của nấm Thượng hoàng Chúng đã được chứng minh có hoạt tính độc đối với nhiều loại tế bào ung thư, bao gồm tế bào ung thư tuyến tụy, tế bào khối u ác tính, tế bào ung thư bạch cầu NB4, tế bào ung thư biểu mô, tế bào ung thư vòm họng, tế bào hình sao gan, tế bào ung thư ruột kết HT29, biểu mô đại tràng HCT116, tế bào biểu mô thận phôi thai A293, tế bào ung thư vú, tế bào u tủy U266, u não, tế bào HepG2 và tế bào ung thư biểu mô phổi (Wenhua Chen và cs, 2019).
Các hợp chất phenylpropanoid trong nấm Thượng hoàng (P linteus) đóng vai trò quan trọng trong sức khỏe con người, với nhiều tác dụng như kháng viêm, chống oxi hóa, chống ung thư, trị tiểu đường, kháng vi sinh vật, và bảo vệ tim mạch cũng như dạ dày Đến nay, đã có 15 loại phenylpropanoid được phân tách từ nấm Thượng hoàng (P linteus) với hoạt tính sinh học và ứng dụng làm dược liệu (Wenhua Chen và cs, 2019).
Nấm Thượng hoàng (P linteus) chứa các terpenoid quan trọng như sesquiterpene, triterpene và một số diterpene, với 13 loại terpenoid có giá trị dược liệu từ hệ sợi của nó (Pingya He và cs, 2021) Nhóm phellilane từ D đến N là những hợp chất terpenoid có khả năng tác động đến vi sinh vật và bảo vệ gan (Wenhua Chen và cs, 2019).
Phelinone là một hợp chất thuộc nhóm Furan, được chiết xuất từ hệ sợi nấm P linteus, nổi bật với hoạt tính kháng vi sinh Các hợp chất Phellinusfuran A và B từ quả thể nấm Thượng hoàng cũng cho thấy khả năng chống bổ sung Đặc biệt, hợp chất 5-hydroxylmethyl-2-furaldehyde từ quả thể nấm Thượng hoàng có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường (Wenhua Chen và cộng sự, 2019).
Axit ellagic và ergothioneine, được chiết xuất từ quả thể và hệ sợi nấm Thượng hoàng, có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường Ngoài ra, Hispolon tách từ hệ sợi nấm này có hoạt tính kháng viêm Đặc biệt, Hispolon chiết xuất từ quả thể đã được chứng minh có khả năng chống ung thư (Wenhua Chen và cs, 2019).
Cao chiết BuOH từ quả thể nấm Thượng hoàng P linteus có khả năng kháng viêm thông qua việc ức chế nitric oxit Nghiên cứu cho thấy polysaccharide của P linteus có tiềm năng chống viêm bằng cách điều chỉnh các con đường tín hiệu MAPK và PPAR, làm giảm các cytokine viêm như TNF-α, IL-1β, IL-6, cũng như các protein liên quan như NF-kB, ERK1/2, p38 và JNK trong đại thực bào RAW264.7 được kích thích bởi LPS (Wenhua Chen và cs, 2019).
Cao chiết ethanol từ quả thể khô nấm Thượng hoàng (P linteus) và các phân đoạn polysaccharide tách chiết cho thấy khả năng chống oxi hóa cao Nghiên cứu chỉ ra rằng hàm lượng phenolic trong nấm Thượng hoàng đạt 4,6 mg axit galic/g mẫu, trong khi hàm lượng flavonoid là 2,30 mg quercetin/g mẫu (Trần Thị Văn Thi và cs, 2016).
Nghiên cứu nhân giống các loài của chi nấm Thượng hoàng Phellinus
Trong nghiên cứu của Pyo Hong và cộng sự (2002), nấm Thượng hoàng P linteus được nuôi trồng trên môi trường YMA, bao gồm 0,5% pepton, 0,3% cao nấm men, 0,3% malt extract, 1% dextrose và 2% agar Quá trình cấy chuyển được thực hiện sau mỗi 30 ngày nuôi cấy.
Nghiên cứu của Woo Sik Jo và cộng sự (2006) về điều kiện nhân nuôi ba loài nấm Thượng hoàng P linteus, P baumii và P gilvus cho thấy nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của nấm là 30°C Nguồn cacbon và nitơ thích hợp bao gồm manose và malt extract, với tỷ lệ nguồn C/N từ 10:1 đến 5:1 và nồng độ glucose 2% kèm theo vitamin B1, axit succinic và MgSO4 Trong ba loài nấm được nghiên cứu, P baumii thể hiện sự sinh trưởng vượt trội nhất.
Hyun Hur (2008) đã tiến hành nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng của bốn loại môi trường (MCM, MEA, PDA và YMA) cùng với các yếu tố như nhiệt độ, pH, nguồn cacbon và nitơ đối với khả năng sinh trưởng của chủng P linteus ATCC 26710 Kết quả nghiên cứu cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong khả năng phát triển của chủng này tùy thuộc vào các điều kiện môi trường và dinh dưỡng.
Môi trường MCM (20g/l agar, 20g/l dextrose, 2g/l cao nấm men, 1g/l pepton, 1g/l K2HPO4, 0,46g/l KH2PO4 và 0,5g/l MgSO4) cho phép chủng P linteus phát triển mạnh nhất với đường kính đạt 70 mm sau 14 ngày nuôi cấy Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là từ 25-30°C, trong khi pH 6-7 là điều kiện lý tưởng nhất Sucrose được xác định là nguồn cacbon phù hợp nhất trong 13 loại được đánh giá, cho đường kính lan tơ đạt 57,3 mm sau 14 ngày nuôi cấy, trong khi Arabinose, galactose và lactose không hỗ trợ sự sinh trưởng của P linteus Trong số 9 nguồn nitơ vô cơ được nghiên cứu, kết quả vẫn đang được tiếp tục đánh giá.
KNO 3 giúp chủng P linteus nghiên cứu tăng trưởng tốt nhất với 82,2 mm sau
14 ngày nuôi cấy trong khi (NH 4 )2SO4 và Ure là không phù hợp
Nghiên cứu của Changsoo Lee và cộng sự (2010) về nhân giống nấm Thượng hoàng P linteus đã xác định rằng tốc độ sinh trưởng cao nhất của hệ sợi nấm đạt 2,8 mm/ngày trong môi trường có nồng độ lactose 29,7g/l, nhiệt độ 26,2°C và pH 5.
Nghiên cứu của Gyeong-Jin Min và cộng sự (2016 và 2021) chỉ ra rằng nấm P linteus phát triển tốt khi được nuôi cấy trên môi trường YGMA, với nhiệt độ tối ưu từ 25-30°C và pH trong khoảng 5-7, trong thời gian 20 ngày.
Phạm Quang Thu (2016) đã thử nghiệm nhân giống P linteus trên môi trường PDA (potato, dextrose và agar), PGA (potato, glucose và agar) và GYA
Nghiên cứu cho thấy rằng môi trường PDA với thành phần glucose, yeast extract và agar tạo điều kiện cho nấm P linteus phát triển mạnh mẽ nhất, đạt tốc độ sinh trưởng 2,92 mm/ngày Ngoài ra, tác giả cũng khẳng định rằng chủng nấm P linteus có khả năng sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 20 độ C.
Năm 2017, nghiên cứu của Trần Thị Lụa và Vũ Văn Hạnh đã thành công trong việc nuôi trồng chủng nấm Phellinus baumii, đạt được sinh khối 17,9 g/l sau 15 ngày Môi trường nuôi cấy bao gồm 200g/l khoai tây, 20g/l glucose, 10g/l cao nấm men, 0,5g/l MgSO4, với nhiệt độ 28°C, pH ban đầu 6 và tốc độ lắc 150 vòng/phút.
Trong điều kiện nuôi lỏng tối ưu với thành phần môi trường gồm 40 g/l nguồn carbon, 20 g/l nguồn nitơ, 0,46 g/l K2HPO4, 1,00 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4.7H2O, 0,01 g/l FeCl2, 0,036 g/l MnCl2.4H2O, 0,03 g/l ZnCl2, và 0,005 g/l CuSO4.7H2O, cùng với pH 5,5-6, nhiệt độ 28°C và tốc độ lắc 150 vòng/phút, có thể thu nhận được 29,9 g/l sinh khối khô của nấm Thượng hoàng.
P linteus sau 15 ngày (Trần Thị Hiền và cs, 2020)
Nguyễn Văn Giang và cộng sự (2020) đã chỉ ra rằng đường fructose 20g/l là nguồn carbon tối ưu cho sự sinh trưởng của nấm Phellinus PHE67, với tốc độ sinh trưởng hệ sợi đạt 2,96mm/ngày và thời gian lan kín đĩa là 14,56 ngày Ngược lại, nấm PHE67 phát triển kém nhất trong môi trường chứa lactose Nguồn dinh dưỡng NH4NO3 2g/l đã cho thấy hiệu quả kích thích cao nhất, đạt tốc độ sinh trưởng 3,52mm/ngày và thời gian lan kín đĩa là 12,22 ngày Bên cạnh đó, MgSO4 0,5g/l được xác định là nguồn dinh dưỡng khoáng tối ưu, với tốc độ sinh trưởng hệ sợi đạt 2,94mm/ngày và thời gian lan kín đĩa là 14,67 ngày.
Nguyễn Văn Giang và cộng sự (2021) đã xác định rằng glucose 20g/l và casein 2g/l là nguồn dinh dưỡng carbon và nitơ lý tưởng cho sự phát triển của chủng nấm Thượng hoàng Điều kiện pH từ 7 đến 10 và nhiệt độ 30°C được coi là tối ưu cho sự sinh trưởng của loại nấm này.
P linteus nghiên cứu với tốc độ phát triển của hệ sợi nấm đạt 5,0 mm/ngày, mật độ hệ sợi dày, phân bố đều, bám chắc vào chất nền
Hoàng Văn Hưng và cộng sự (2022) đã thu thập 4 quả thể nấm Thượng hoàng Phellinus từ tự nhiên và tiến hành nhân giống Quá trình khử trùng quả thể nấm bằng ethanol 70% trong 10 phút cho thấy hiệu quả cao nhất, đạt 29,17% Bốn chủng nấm Phellinus được thử nghiệm nuôi cấy trên 4 loại môi trường khác nhau, bao gồm PDA, MCM, MEB và YEB, trong đó môi trường MCM, chứa dextroza 20 g/l và cao nấm men, cho kết quả khả quan nhất.
2 g/l; pepton 1 g/l; MgSO 4 7H 2 O 0,5g/l; KH 2 PO 4 0,46 g/l; K2HPO 4 1g/l; agar
Như vậy, qua nghiên cứu tổng quan tài liệu về nhân giống các loài nấm Thượng hoàng thuộc chi Phellinus và loài P linteus cho thấy: Các loài nấm
Thượng hoàng khác nhau có những thích ứng khác nhau với cùng 1 điều kiện nuôi cấy Ngoài ra, cùng 1 loài
P linteus nhưng ở các xuất xứ có khả năng thích ứng với điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường rất khác nhau Vì vậy, trước một nguồn giống nấm Thượng hoàng mới, muốn đưa vào nhân giống và nuôi trồng tạo ra các sản phẩm thương mại thì một trong những khâu quan trọng đầu tiên là tìm ra được những điều kiện nhân giống thích hợp nhất giúp có được nguồn giống tốt đưa vào sản xuất.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP
Mục tiêu nghiên cứu
Nhân thành công giống cấp I chủng nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus)
- Xác định được điều kiện thích hợp nhân giống cấp I nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus);
- Xác định môi trường thích hợp cho nhân giống cấp I nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus).
Đối tượng nghiên cứu
Chủng nấm Thượng hoàng Phellinus linteus, có nguồn gốc từ Phú Thọ, đang được nghiên cứu và lưu giữ tại Viện Ứng dụng Công nghệ Viện này cũng là đơn vị cung cấp thông tin về chủng nấm quý giá này.
Nội dung nghiên cứu
2.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến giai đoạn nhân giống cấp I nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus)
2.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến giai đoạn nhân giống cấp I nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus)
- Nghiên cứu xác định nguồn cacbon thích hợp cho sinh trưởng của hệ sợi nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus);
- Nghiên cứu xác định nguồn nitơ thích hợp cho sinh trưởng của hệ sợi nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus);
- Nghiên cứu xác định tỷ lệ nguồn cacbon : nitơ cho sự sinh trưởng của nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus).
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến giai đoạn nhân giống cấp I nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus) Để đánh giá mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Thượng hoàng, mẫu thí nghiệm được nuôi cấy trên môi trường có chứa 20g/l glucose, 20g/l agar, 2g/l cao nấm men, 1 g/l KH2PO4, 0,5g/l MgSO4 và pH môi trường được điều chỉnh đến 7 và được nuôi trong tối ở các nhiệt độ 20, 25, 30, 35 0 C
Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy đến giai đoạn nhân giống cấp I nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus)
Phương pháp xác định nguồn cacbon thích hợp cho sinh trưởng của giống nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus)
Nội dung nghiên cứu sử dụng các công thức thí nghiệm với thành phần bao gồm 20g/l agar, 2g/l cao nấm men, 1g/l KH2PO4, 0,5g/l MgSO4 và 20g/l các nguồn cacbon như dextrin, fructose, glucose, lactose, maltose, maintol, sucrose và dung dịch tinh bột Môi trường thí nghiệm được điều chỉnh pH 7 và các mẫu nghiên cứu được nuôi trong điều kiện tối ở nhiệt độ 30 độ C.
Phương pháp xác định nguồn nitơ thích hợp cho sinh trưởng của giống nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus)
Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm này gồm 20g/l agar, 20g/l glucose,
Môi trường nuôi cấy bao gồm 1 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4 và được bổ sung thêm 2 g/l một trong các loại như cao nấm men (yeast extract: YE), pepton (PE), casein (CA), malt extract (MA), (NH4)2SO4 (AS), NH4NO3 (AN), Ca(NO3)2 (CN) và KNO3 (KN) Điều kiện nuôi cấy được duy trì với pH môi trường là 7 và nhiệt độ 30°C trong tối.
Phương pháp xác định tỷ lệ cacbon:niơ thích hợp cho sự sinh trưởng của giống nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus)
Tỷ lệ cacbon:nitơ trong nghiên cứu được xác định từ hai nguồn chính là fructose và cao nấm men, với hàm lượng nấm men cố định ở mức 2g/l Các công thức thí nghiệm được tạo ra với tỷ lệ cacbon:nitơ lần lượt là 5:1 (CN1), 10:1 (CN2), 15:1 (CN3), 20:1 (CN4), 25:1 (CN5) và 30:1 (CN6) Mỗi công thức môi trường đều được bổ sung 20g/l agar, 1g/l KH2PO4, 0,5g/l MgSO4 và điều chỉnh pH = 7 Các mẫu nghiên cứu được nuôi cấy trong điều kiện tối ở nhiệt độ 30°C.
Tất cả các môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm được điều chỉnh pH bằng 0,1M NaOH hoặc 0,1M HCl, sau đó khử trùng ở 121°C trong 20 phút Sau khi khử trùng, môi trường được làm nguội xuống 50-55°C và chia vào các đĩa petri có đường kính 7 cm, mỗi đĩa chứa 25ml môi trường Sau 24 giờ, mỗi đĩa được cấy một miếng thạch giống gốc kích thước khoảng 5mm x 5mm vào giữa đĩa Các đĩa sau khi cấy giống được nuôi trong điều kiện tối cho đến khi tơ nấm lan kín đĩa thạch Mỗi loại môi trường được thử nghiệm trên 10 đĩa và lặp lại 3 lần Sự lan tơ được theo dõi bằng cách đo đường kính lan tơ tại các thời điểm khác nhau, bắt đầu từ 9 giờ.
Thời gian lan tơ nấm trong khoảng 11, 13 và 15 ngày được xác định thông qua việc quan sát trực quan độ dày của hệ sợi nấm Phương pháp này giúp đánh giá tốc độ lan tơ trên từng môi trường, từ đó lựa chọn môi trường nhân giống phù hợp nhất cho sự phát triển nhanh chóng của tơ nấm.
Tốc độ mọc của hệ sợi nấm Thượng hoàng được tính theo công thức:
+ V: tốc độ mọc của hệ sợi nấm (mm/ngày)
+ X: Bán kính của hệ sợi nấm mọc trên bề mặt môi trường (mm)
+ T: Thời gian hệ sợi nấm mọc trên bề mặt môi trường (ngày)
2.4.2 Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả các thí nghiệm được thống kê vào phần mềm excel và được xử lý bằng phần mềm SPSS version 22.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả xác định nhiệt độ nuôi cấy cho sinh trưởng của giống nấm Thượng hoàng (P linteus)
Nấm là nhóm sinh vật nhạy cảm với nhiệt độ, và việc xác định nhiệt độ thích hợp là yếu tố quyết định trong quá trình nhân giống Bốn mức nhiệt độ từ 20-35°C đã được sử dụng để kiểm tra ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của nấm Thượng hoàng Kết quả thí nghiệm được ghi nhận trong bảng 01.
Bảng 3.1 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của hệ sợi nấm Thượng hoàng
CTTN Đường kính lan tơ (mm)
Tốc độ ăn lan tơ (mm/ngày)
Số ngày ăn lan kín đĩa (ngày Đặc điểm hệ sợi nấm
25 0 C 58,15±0,98 a 1,94±0,03 a 18,06±0,30 a Dày, sợi nấm hơi bông, màu vàng
30 0 C 59,07±0,99 a 1,97±0,03 a 17,78±0,29 a Dày, hệ sợi nấm kết chặt, màu vàng đều
35 0 C 14,47±0,87 c 0,48±0,03 c - Hệ sợi nấm mịn mảnh, màu vàng
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ ra sự khác biệt thống kê có ý nghĩa ở mức xác suất 95% Đường kính của lan tơ được đo lường sau 15 ngày nuôi cấy.
Kết quả phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt lớn về sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Thượng hoàng ở 4 mức nhiệt độ Ở 25 và 30 °C, các chỉ số về đường kính lan tơ, tốc độ lan tơ và số ngày ăn lan kín đĩa đều tương đương và đạt kết quả cao nhất Ở nhiệt độ 25 °C, hệ sợi nấm có màu vàng đều, mọc dày nhưng có nhiều sợi nấm ký sinh, trong khi ở 30 °C, mức độ kết chặt của các sợi nấm cao hơn Tại 20 °C, hệ sợi nấm phát triển chậm hơn với tốc độ 1,42 mm/ngày và mất 24,62 ngày để kín đĩa, có màu hơi trắng Ngược lại, ở 35 °C, hệ sợi nấm gần như không phát triển, chỉ đạt 14,47 mm sau 15 ngày, với tốc độ lan chỉ 0,48 mm/ngày và màu vàng nhưng đường kính quá nhỏ để đánh giá các đặc điểm khác Nghiên cứu này phù hợp với các công trình trước đây về ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của nấm Phellinus, đặc biệt là loài P linteus.
Nghiên cứu của Hyun Hur (2008) cho thấy ba loài nấm P linteus, P baumii và P gilvus đều phát triển tốt ở nhiệt độ 30°C, trong khi chủng P linteus ATCC 26710 thích hợp với dải nhiệt độ từ 25-30°C Changsoo Lee và cộng sự (2010) xác định nhiệt độ tối ưu cho P linteus là 26,2°C Các kết quả nghiên cứu của Gyeong-Jin Min và cộng sự (2016, 2021) cũng chỉ ra rằng chủng nấm P linteus phát triển tốt ở nhiệt độ 25-30°C Tại Việt Nam, các tác giả như Trần Thị Lụa, Vũ Văn Mạnh (2016), Trần Thị Hiền và cộng sự (2020), cùng Nguyễn Văn Giang và cộng sự (2020) đã khẳng định nhiệt độ tối ưu cho một số loài nấm Thượng hoàng Phellinus.
28, 30 0 C, Phạm Quang Thu (2016) cho rằng P linteus có khả năng sinh trưởng tốt nhất ở 25 0 C
Kết quả thí nghiệm cho thấy chủng nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus) phát triển tốt ở nhiệt độ từ 25-30 °C, với tốc độ lan tỏa của hệ sợi nấm đạt 1,94-1,97 mm/ngày và thời gian lan kín đĩa là 18,06-17,78 ngày Nhiệt độ 30 °C được xác định là tối ưu, giúp hệ sợi nấm kết chặt, bám chắc vào môi trường và tạo ra mật độ sợi nấm dày, màu vàng đồng đều.
Kết quả ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến giai đoạn nhân giống cấp I nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus) 14 1 Kết quả xác định nguồn cacbon thích hợp cho sinh trưởng của giống nấm
3.2.1 Kết quả xác định nguồn cacbon thích hợp cho sinh trưởng của giống nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus)
Trong nuôi cấy nhân tạo, việc cung cấp nguồn dinh dưỡng cacbon là yếu tố quan trọng cho sự phát triển của các loài nấm, đặc biệt là nấm Thượng hoàng Nghiên cứu này đã bổ sung 8 nguồn dinh dưỡng cacbon vào môi trường nuôi cấy và tiến hành đánh giá hiệu quả của chúng, với kết quả được trình bày trong bảng 02.
Bảng 3.2 Kết quả ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng của hệ sợi nấm Thượng hoàng
CTTN Đường kính lan tơ (mm)
Tốc độ ăn lan tơ (mm/ngày)
Số ngày lan kín đĩa (ngày) Đặc điểm hệ sợi nấm
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột cho thấy sự khác biệt thống kê có ý nghĩa ở mức xác suất 95% Đường kính lan tơ được đo lường sau 15 ngày nuôi cấy.
Hệ sợi nấm có ba loại đặc trưng: loại đầu tiên với hệ sợi kết chặt, bề mặt mịn màng và đồng đều, mang màu vàng đậm; loại thứ hai có nhiều sợi khí sinh, bề mặt tơ bông và màu vàng nhạt; và loại cuối cùng mọc thưa, cho phép nhìn rõ môi trường nuôi cấy, có màu trắng hơi vàng.
Kết quả từ bảng 02 cho thấy 8 nguồn cacbon ảnh hưởng khác biệt đến sự tăng trưởng của hệ sợi nấm Thượng hoàng P linteus Trong đó, dung dịch tinh bột hòa tan cho kết quả tốt nhất với 62,08 mm sau 15 ngày nuôi cấy, tốc độ lan tơ đạt 2,07 mm/ngày, và trung bình 16,91 ngày để sợi nấm lan kín bề mặt đĩa thạch Fructose và glucose cũng cho kết quả khả quan, nhưng hệ sợi nấm ở dạng khí sinh nhiều hơn khi sử dụng fructose và glucose, với mật độ sợi dày và màu sắc đồng đều Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Giang và cộng sự (2020), fructose 20g/l là nguồn cacbon tối ưu cho Phellinus PHE67, trong khi glucose 20g/l phù hợp với P linteus (Nguyễn Văn Giang và cs, 2021) Các loại đường khác như dextrin, maltose, manitol và sucrose có hiệu quả thấp hơn so với glucose và fructose Đặc biệt, lactose không phù hợp với nấm Thượng hoàng Phellinus, mặc dù P linteus có thể tăng trưởng với tốc độ 2,8mm/ngày trong môi trường chứa 29,7g/l lactose, nhiệt độ 26,2°C và pH = 5 (Changsoo Lee và cs, 2010).
Hình 3.3 Hệ sợi nấm Thượng hoàng 15 ngày tuổi trên các MT có nguồn cacbon khác nhau.
Qua phân tích, các chủng nấm Thượng hoàng thể hiện phản ứng khác nhau với nguồn dinh dưỡng carbon Nghiên cứu chỉ ra rằng fructose là nguồn carbon tối ưu cho sự phát triển của nấm P linteus, với tốc độ lan tơ đạt 2,00 mm/ngày và thời gian lan tơ kín đĩa là 17,47 ngày Mặc dù glucose cho kết quả kém hơn một chút so với fructose, nhưng do glucose dễ kiếm và giá thành rẻ hơn, nên có thể sử dụng glucose thay thế fructose trong sản xuất đại trà.
3.2.2 Kết quả xác định nguồn nitơ thích hợp cho sinh trưởng của giống nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus)
Nitơ là yếu tố dinh dưỡng quan trọng giúp nấm tổng hợp axit amin, protein, axit nucleic và nhiều hợp chất chứa nitơ khác, hỗ trợ sự sinh trưởng và phát triển của chúng Trong thí nghiệm này, 8 nguồn nitơ, bao gồm 4 nguồn hữu cơ và 4 nguồn vô cơ, đã được sử dụng để kiểm tra hiệu quả đối với sự phát triển của hệ sợi nấm Thượng hoàng Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 03.
Bảng 3.3 Kết quả ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh trưởng của hệ sợi nấm Thượng hoàng
CTTN Đường kính lan tơ (mm)
Tốc độ ăn lan tơ (mm/ngày)
Số ngày lan kín đĩa (ngày) Đặc điểm hệ sợi nấm
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt thống kê có ý nghĩa ở mức xác suất 95% Đường kính lan tơ được ghi nhận sau 13 ngày nuôi cấy Hệ sợi nấm được phân loại như sau: ++++: hệ sợi nấm kết chặt, bề mặt mịn, đồng đều và có màu vàng đều; +++: hệ sợi nấm có sợi khí rõ ràng trong môi trường nuôi cấy, màu trắng hơi vàng không đều hoặc màu vàng nâu; +: hệ sợi nấm mảnh, màu trắng với một số vị trí có màu vàng hoặc trắng trong.
Kết quả phân tích cho thấy 8 nguồn nitơ trong thí nghiệm ảnh hưởng khác nhau đến sự tăng trưởng của hệ sợi nấm Thượng hoàng Trong đó, 4 nguồn nitơ hữu cơ hiệu quả hơn so với 4 nguồn vô cơ Nấm men (YE) và casein (CA) ghi nhận tốc độ sinh trưởng tốt nhất, mặc dù mật độ hệ sợi nấm của CA kém dày hơn YE Hai nghiệm thức MA và PE có tốc độ sinh trưởng thấp hơn và mật độ sợi nấm thưa hơn so với YE và CA Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Nguyễn Văn Giang và cs (2021), cho thấy casein là nguồn nitơ phù hợp nhất cho P linteus, nhưng tốc độ sinh trưởng trong nghiên cứu này cao hơn Đối với nguồn nitơ vô cơ, nghiệm thức CN ghi nhận tốc độ sinh trưởng lớn nhất đạt 1,91 mm/ngày, nhưng hệ sợi nấm rất mảnh và màu sắc không đồng đều Nghiệm thức KN có sợi nấm mọc thưa, trong khi AN và KN chỉ bắt đầu lan sau 15 ngày nuôi cấy, dẫn đến việc không thể theo dõi số ngày ăn lan kín đĩa thạch.
Như vậy, với 8 nguồn nitơ nghiên cứu cao nấm men và casein là thích hợp cho sự tăng trưởng của hệ sợi nấm Thượng hoàng nghiên cứu
Hình 3.3 Hệ sợi nấm Thượng hoàng 13 ngày tuổi trên các MT có nguồn nitơ khác nhau
3.2.3 Kết quả xác định tỷ lệ nguồn cacbon:nitơ thích hợp cho sự sinh trưởng của giống nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus)
Nghiên cứu của Woo Sik Jo và cộng sự (2006) chỉ ra rằng tỷ lệ nguồn cacbon : nitơ tối ưu cho ba loài nấm Thượng hoàng P linteus, P baumii và P gilvus là từ 10:1 đến 5:1, điều này giúp nấm phát triển tốt hơn Trong thí nghiệm, đã thực hiện 6 công thức với tỷ lệ nguồn cacbon : nitơ dao động từ 5:1 đến 30:1, và kết quả được trình bày trong bảng 04.
Bảng 3.4 Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ nguồn cacbon:nitơ lên khả năng sinh trưởng của hệ sợi nấm Thượng hoàng
CTTN Đường kính hệ sợi ăn lan ở 15 ngày tuổi (mm)
Tốc độ ăn lan của hệ sợi nấm (mm/ngày)
Số ngày ăn lan kín đĩa (ngày) Đặc điểm hệ sợi nấm
Ghi chú: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt thống kê có ý nghĩa ở mức xác suất 95% Đường kính của lan tơ được đo sau 15 ngày nuôi cấy Kết quả cho thấy: +++ thể hiện hệ sợi nấm kết chặt, bề mặt mịn, đồng đều màu vàng; ++ cho thấy hệ sợi nấm cũng kết chặt, bề mặt mịn, đồng đều nhưng có màu vàng nhạt hoặc có phần trắng.
Bảng 04 cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong hiệu quả tác dụng của các công thức thí nghiệm lên sự sinh trưởng của nấm Thượng hoàng Ở tỷ lệ cacbon: nitơ là 5:1 (CN1), tốc độ sinh trưởng đạt 1,69 mm/ngày, và sau 20,77 ngày, nấm lan kín bề mặt đĩa với mật độ dày, màu vàng Khi tỷ lệ cacbon: nitơ tăng lên 10:1 (CN2) và 15:1 (CN3), tốc độ sinh trưởng tăng lên 2 mm/ngày, nấm lan kín bề mặt đĩa trong khoảng 17,5 ngày, với màu sắc vàng đồng đều ở CN2, trong khi CN3 có phần viền trắng Tuy nhiên, ở CN3, hệ sợi nấm giữ màu trắng lâu hơn, cho thấy khả năng tổng hợp sắc tố kém Khi tăng tỷ lệ lên 20:1, 25:1 và 30:1, tốc độ sinh trưởng giảm dần, nhưng mật độ hệ sợi nấm vẫn dày và màu sắc chuyển từ vàng đến vàng nhạt hoặc hơi trắng Điều này cho thấy rằng mặc dù hàm lượng đường cao, đặc điểm của hệ sợi nấm ít thay đổi, nhưng tốc độ sinh trưởng giảm rõ rệt Các nghiên cứu trước thường sử dụng tỷ lệ cacbon: nitơ từ 10:1 như đã được công bố bởi Nguyễn Văn Giang và cộng sự.
(2020, 2021), Woo Sik Jo và cs (2006) hay 5:1 như của Woo Sik Jo và cs (2006), Hoàng Văn Hưng và cs (2022); Hyun Hur (2008) hay 15:1 như Changsoo Lee và cs (2010)
Dựa vào tốc độ tăng trưởng và đặc điểm của hệ sợi nấm, tỷ lệ nguồn cacbon và nitơ (fructose và cao nấm men) 10:1 được xác định là tối ưu cho chủng nấm P linteus Kết quả nghiên cứu cho thấy tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm đạt 2,00 mm/ngày, với thời gian 17,47 ngày để hệ sợi nấm bao phủ toàn bộ bề mặt đĩa.
Hình 3.4 Hệ sợi nấm Thượng hoàng 15 ngày tuổi trên các MT có tỷ lệ nguồn cacbon và nitơ khác nhau
- Dải nhiệt độ thích hợp cho nhân giống cấp I nấm Thượng hoàng P linteus là từ 25-30 0 C, trong đó 30 0 C là thích hợp nhất
Môi trường tối ưu cho nhân giống cấp I nấm Thượng hoàng bao gồm 20g/l agar, 20g/l fructose, 2g/l cao nấm men, 1g/l KH2PO4 và 0,5g/l MgSO4, với pH = 6 và nhiệt độ nuôi là 30°C Dưới điều kiện này, chủng nấm P linetus có tốc độ tăng trưởng đạt 2,00 mm/ngày và thời gian lan tơ kín đĩa là 17,47 ngày.
2 Kiến nghị Đây là loài nấm dược liệu quý, chưa được nuôi trồng nhiều ở Việt Nam nên được quan tâm nghiên cứu tiếp ở các bước nhân giống và nuôi trồng tạo sản phẩm thương mại hóa.