Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phân lập và sàng lọc chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh từ đất tại vườn quốc gia gò lò xa mát ở tỉnh Tây Ninh

TÓM TẮTCác chủng xạ khuan được phân lập từ các mẫu đất ở Vườn quốc gia Gò Lò Xa Mattỉnh Tay Ninh sẽ được khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh và một số điều kiệnlên men ảnh hưởn

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO

-TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

—

PHAN LAP VA SÀNG LOC CHUNG XA KHUAN CÓ KHA NANG KHANG VI KHUAN VA NAM BENH

TU DAT TAI VUON QUOC GIA GO LO XA MAT

O TINH TAY NINH

Nganh hoc : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : DIỆP QUỲNH NHƯ

Mã số sinh viên : 19126126

Niên khóa : 2019 - 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHAN LAP VÀ SÀNG LOC CHUNG XA KHUAN CO KHA NANG KHANG VI KHUAN VA NAM BENH

TU DAT TAI VUON QUOC GIA GO LO XA MAT

O TINH TAY NINH

Hướng dẫn khoa hoc Sinh viên thực hiệnThS LÊ PHƯỚC THỌ DIỆP QUYNH NHƯ

TP Thú Đức, 08/2023

LỜI CẢM ƠN

Đề hoàn thành khóa luận và kết thúc khóa học, với tình cảm chân thành, em xinbảy tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đãtạo điều kiện cho em có môi trường học tập tốt trong suốt thời gian em học tập, nghiêncứu tại trường.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Trương Phước Thiên Hoang và ThS Lê

Phước Thọ đã giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và trực tiếp hướng dẫn emhoàn thành đề tài tốt nghiệp này

Đồng thời, em xin bảy tỏ lòng cảm ơn tới KS Võ Trần Quốc Thắng, các anh chị,các bạn và các em trong phòng thí nghiệm VI sinh ứng dụng đã tạo mọi điều kiện, chia

sẻ khó khăn, giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian thực hiện đề tài

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS Phạm Đức Toàn và tập thé lớp DH19SHA Công nghệ Sinh học khóa 45 và gia đình thân yêu của em đã luôn bên cạnh, động viên,

-giúp đỡ trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn.

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Diệp Quỳnh Như, MSSV: 19126126, Lớp: DHI9SHA (Số di động:

0905899749, Email: 19126126@st.hemuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệ Sinh học

Trường Dai học Nông Lam Thành phó Hồ Chi Minh, xin cam đoan: Đây là Khóa luậntốt nghiệp đo bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu

là hoàn toàn trung thực và khách quan Trong quá trình làm bài, tôi có tham khảo một

số bài nghiên cứu, bài báo dé thêm tin cậy cho đề tài Những nguồn tài liệu tôi thamkhảo đó đã được trích dẫn và ghi nguồn theo đúng quy định Tôi xin hoan toản chịutrách nhiệm trước Hội đồng về những cam kết này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 07 năm 2023

Người việt cam đoan

il

TÓM TẮT

Các chủng xạ khuan được phân lập từ các mẫu đất ở Vườn quốc gia Gò Lò Xa Mattỉnh Tay Ninh sẽ được khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh và một số điều kiệnlên men ảnh hưởng đến khả năng tông hợp chất kháng vi sinh vật Tiến hành phân lập

xạ khuẩn trên hai môi trường SCA và Gause I bằng phương pháp cấy trải, làm thuầntrên môi trường ISP2 dé quan sát đặc điểm hình thái và soi kính hiển vi điện tử quan sátsợi nam, bào tử dé sang lọc chủng xạ khuẩn Bằng phương pháp thỏi thạch, thực hiệnkhảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật đối với chủng xạ khuẩn nghỉ ngờ Ngoài ra, xác địnhhoạt tính kháng vi sinh vật trong dịch lên men bằng phương pháp khoanh giấy lọc Kếtquả nghiên cứu đã phân lập được 30 chủng xạ khuẩn từ các mẫu đất § chủng được chọn

dé tiễn hành khảo sát khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh Qua khảo sát nhận thấy, 8

chủng khang Phytophthora sp., N dimidiatum, F oxysporum, 4 chủng khang V parahaemolyticus, 1 chủng khang C albicans Ching N1 va N2 là hai chủng có kha

năng kháng mạnh nhất Đã xác định được điều kiện lên men thích hợp của chủng N2 ởmôi trường ISP4 với nguồn cacbon là tinh bột, nguồn nito là pepton và ở 30 °C Kết quađịnh danh sinh học phân tử đã xác định chủng xạ khuẩn NI thuộc loài Streptomycescostaricanus và chủng N2 thuộc loài Streptomyces noursei với mức tương đồng 100 %

Từ khóa: phân lập, xạ khuẩn, lên men, kháng khuẩn, kháng nam

Actinomycetes isolated from soil samples in Lo Go Xa Mat National Park, Tay Ninh province will be investigated for their antimicrobial activity and some fermentation

conditions affecting the ability to synthesize antimicrobial microorganisms Isolation of

actinomycetes in two media SCA and Gause I by spreading culture method, purification

on ISP2 media to observe morphological characteristics, and electron microscopy to

observe mycelium and spores for screening actinomycetes strains By the agar stick

method, the antimicrobial activity was investigated against the suspected actinomycete

strain In addition, the antimicrobial activity in the fermentation broth was determined

by the filter paper method Research results have isolated 30 actinomycetes from soil samples 8 strains were selected to investigate resistance to pathogenic microorganisms Through the survey, 8 strains were resistant to Phytophthora sp., N dimidiatum, F oxysporum, 4 strains were resistant to V parahaemolyticus, and | strain was resistant to

C albicans Strains NI and N2 are the two most resistant strains The suitable fermentation conditions of strain N2 have been determined in ISP4 medium with the carbon source being starch, the nitrogen source being peptone, and at 30 °C The result

of molecular biological identification has identified actinomycete strain N1 belonging

to Streptomyces costaricanus species and strain N2 belonging to Streptomyces noursei species with 100 % similarity.

Keywords: isolate, actinomycete, fermentation, antibacterial, antifungal.

IV

MỤC LỤC

LOI CAM ƠN 5-2222 22221221221221221212212121121211121121121121111121211111121 1e re iRAC MAN XÃ CAM BUA LoanuneskagnnteodiorrdgiSSGEGGSIGI000100000000010000001408-410/2042.806 iiTOM TẮTT 2-22 22 22122122112212211211221121127112112111112111112112111211211211211211212 212cc iiiABSTRACT - 5< 22222221122121121122112112112112111112111121111211111211222111 1e iv MỤC LỤC ©2222 21222222122122212711211211221121122112112112112111121121121121121122121 21 ca VvDANH SÁCH CÁC CHU VIET TẮTT 2- 2¿©2222+22E2EE£EE+2EE2EE222E2EE2Eezzxerkee viiieRe OS IES | 5, ixDANH SÁCH CÁC HÌNH ©-2©222222E12212221221221122122112112112112112111211211 2212 e0 XCHƯƠNG I MO ĐẦU 2-22 ©22222222E22212221221122112211221122122111271211211 211 |1.1 Đặt vấn đỀ - + 2s 2x 2122122122122111111111111121111121212121212121 1111 rre 1

a | er 21;5 NGiidung Thực hi 60 sees cases caren anes mists nem ae aaa aT 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU -2222222222E22EE2EEzEEzEzzxzrxzrssrszrxseseexce.Ö2.1 Giới thiệu Vườn quốc gia Gò Lò Xa Mate cecccccccccessesseessessesseessesseeseessessesseeneneees 32.1.1 Vị trí địa lý 2-5222222212221221221121122112112112112112112111112112112121121211212 re 3 21.2 Dia Linh Va tHỦU Vallone s nie wens Reman mone eiee

51,3; Boal ate Sta 9 i reese meetecttnes tea Ht nats nts th RR CA 3

2.2 Tổng quan về xạ Khan ecco ccc cco ecseeeseeesessesssessesesesseesessesiessteseessessesstesieeseseees 42.2.1 Giới thiệu chung và sự phân bố xạ khuẩn trong tự nhiên 2-52 22252252 42.2.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn + s+Ss+SSE£EE2EEEEEEEEEEEEEEE2EEE 2E rrreg 42.2.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 2-52 S2 S22E2EE 2212212112121 xe 42.2.2.2 Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn - 2-2 2+2 2S+S22E22E2212222122121E21 1221.212 Xe 52.2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn - 2 ¿+22 +S+2E£2E+£Et£Ee£Eczxrxrred 6

2.2.4 Ung dụng của xạ khuẩn trong thực tiễn oo eee cce cco csseeseesessessesseesesseeseeseeseesees i

D2 ATs Trone Tinh vite rồng A181 Epos ccsaremcsesnsnadinnantniesnsne poasnwenexanaussentaneseeanpanrwemebereetambets 7

2.2.4.2 Trong lĩnh vực công nghệ thực pham ccescccecsesseesessesseesessessessessesseeseeseess §

2.2.4.3 Trong lĩnh vực y hỌC - - L2 ST TH TH TH TT TT TH TT HH HH HH 8

2.3.1 Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 22 s+2E+2E22E2£EtzEtzzczxzed 82.3.2 Các yêu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chat khang sinh 9

2.3.2.1 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy -2+2 2 2z+2++2E+2E+£E+zEzEzxzxezzee 10

2.3.2.2 Anh hưởng của thành phan môi trường lên men 2¿ 2225225522: 102.4 Tình hình nghiên cứu ở trong va ngoai NưỚC - +2 5252 ++*£+c+csxzscsxcee I1

21:1 Cae fiEHISH:GỨU.ñ Bồi HƯỚ assessssseeieiiddnstigSE130830151030484838898640004883800189.20332/8/88300/80068/48 11

2.4.2 Các nghiên cứu trong ƯỚC cece + 2522 ceeeeceeeeceececeeseceececeeceeseceeesceeaees 12EHITRGNG1 VAT LIGU VÀ THƯƠNG THẾ ke 143.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 2 ¿+2+E+2E22E22E22E222222222221222222222222e2 143.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - - ¿2 2+2 22 S222 222 2 1 tre 14

đc Ea lm: MIOGEL1E LĨnggiosdevksd22M1GBE800E6EãN0SUS0I.394GG45GG8SE00/3US/SVGEGNGIAGEIGGESESMS.H.BLSIHENICEESHSĐ.SMSGPISSG.UENGHUHHH 14

3.2.1.1 Mẫu thí nghiệm - 2 52222S1222222212212322121121212112121221211121121 111.22 re 14

3.4.1.2 Thiết bí và dutte ENcgecun kg nho Gá nề 6 10 0g GIUAG13130G003014 6605104 G0146161633101301811848508166 14

B Dol By NOT WWOTiDsoeeernesseosoirSEolsals©isiEitSSESEERGINGIBTBSIESSLG.SNT92SI5E01204014S82S3IS2gG0922ngi2S 14

3.2.2 Phương Phap hghiỂH: CW .:¿ eccessecoonisedknirisdeddniloaidnisloadidBEsadosiS4440-.500508g.0.3006 153.2.2.1 Phương pháp lay mẫu 2- ¿222 22222E22E2E12212212212112112211211211 21.221 153.2.2.2 Phân lập các chủng xạ khuẩn 2 2+22+E2E22E2E22E12E225222222121122222222 Xe 153.2.2.3 Phương pháp cấy chuyền giữ giống - 2: 22©22222222222E2EE22EczEzrree, 163.2.2.4 Phương pháp quan sát khuẩn ty xạ khuân -22++22+22++zxzzxz+zxeez 16

3.2.2.5 Phương pháp khảo sát hoạt tính khang sinh ¿5+2 +++<£+<++czz<s+ 16

3.2.2.6 Khảo sát các điều kiện lên men ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp chất kháng

Ni Silty Ale =e ee ee eee ee 183.2.2.7 Định danh các chủng xa khuẩn 2 ese seesseseesesseseseeseesesseseeseseeseeeees 19

Ñ nu GHI ee 19CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2- 252 2E2E22E22E£EEEZEZErEerree 20

4.1 Kết quả phân lập và làm thuìn 2-2-2522 22+2E2E2E2EEE2E2E22E+2EZEzEzxrzree 20

4.2 Mô ta đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hiển vi các chuẩn chọn lọc - 254.3 Khảo sát.hoạt tính kháng vỊ,SINh VẬ bo ss6c1ssgcann4161Á2005510115955ĐESESSSSEELEESSE-5E848588 24

4.4 Khảo sát các điều kiện lên men ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp chất kháng vi

SiHh Vat của CHUTE N2 asessssssussuesesuesnecs canencusnanesxasueansanses 85 3L3864E.REL5ES08518.2818488 400.38 21538.,81-163ã 25 4.4.1 Lựa chon môi trường lên men thích hợp - -+ ++-<++c+zcezreereerrrrrrrrs 25

vi

4.4.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp chat kháng vi sinh vật của0n e8 s00 21 264.4.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tông hợp chất kháng vi sinh vật củaghing sa khuẩn MP susoseseernsrnioiednietoiDiiN0046120005000107012109040)01P553400191500010/014100/0300010 274.4.4 Anh hưởng của nhiệt độ đến kha năng tông hợp chat kháng vi sinh vat của chủng

xạ khuẩn N2 - 2 -S2222122121121221211211212112111111211211111121112112111112101211211121 1e xe 284.5 Kết quả định danh các chủng xạ khuẩn tuyén chọn -2- 22222225: 28CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ 22 s+222EsEEzEezserserrssrserrerrere 3BQT Ti ii EsasaatraratrartootrergtoarrgitaronttiygidaposinliiermgiiernptiltorstieaiGmsrdBidtoibitdrSgiini 31CẬU 0 cố or CƯ GA ae 31TÀI LIEU THAM KHẢO - 2 2222222222EE22EE22E122E122212221223122212211221122122212 222 ee 32

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

ATP : Adenosin Triphosphat

CKS : Chất kháng sinh

ctv : Cộng tác viên

DNA : Deoxyribonunucleic acid

ISP : International Streptomyces Project

KTCC : Khuan ty cơ chat

DANH SÁCH CAC BANG

TrangBảng 3.1 Bồ trí thí nghiệm khảo sát tính đối kháng với 5 vi sinh vật kiểm nghiệm 17Bảng 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các xạ khuẩn phân lập -5- 2+ 21Bang 4.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật của 8 chủng xạ khuẩn tiềm năng 24Bảng 4.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật của chủng N2 trên các môi trường lên men 25Bảng 4.4 So sánh kết quả giải trình tự gen trên ngân hang gen NCBI 29

Hình 2.1.

Hình 2.2.

Hình 4.1.

Hình 4.2.

Hình 4.3.

Hình 4.4.

Hình 4.5.

Hình 4.6.

Hình 4.7.

Hình 4.8.

Hình 4.9.

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang Các loại khuẩn ty 0 xa ee 5 Một số dang bào tử ở xạ KhUAI eee cece ccceececseesecsecsessecsessessecsessessesseeaeeees 6 Dia phân lập từ mẫu đất 2-2 ©22+2222E222122122512212231221221212 222 20 Một số chủng xạ khuẩn được phân lập và làm thuần s2 20

Kết quả nhuộm màu các chủng xạ khuẩn ở độ phóng đại 100X 29

Hoạt tính kháng vi sinh vật của chủng N2 trên 4 loại môi trường 26

Biểu đồ anh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp 26

Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn nito đến khả năng tổng hợp 27

Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tông hợp - 28

Phổ điện di của gen 16S rRNA của 2 dong xạ khuẩn tuyển chọn 29

Cây phát sinh chủng loại của chủng xa khuẩn N1 và N2 29

các vi sinh vật gây bệnh, mặt khác sẽ gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng nghiêm trọng

đến sức khỏe con người, động vật khác và làm mắt cân bằng hệ sinh thái Hiện nay, biệnpháp sử dụng các tác nhân sinh học thay thế tác nhân hóa học được xem là chiến lược

Việc sử dụng các vi sinh vật đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh là một trongnhững giải pháp đó Xạ khuẩn được biết đến là một trong những đối tượng quan trọngnhất trong sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học Chúng có khả năng tiết ra cácchất chuyền hóa thứ cấp ức chế sinh trưởng (như kháng sinh, độc tố, chất hoạt động bềmặt, chat dé bay hơi) có thé ngăn chặn hoặc tiêu diệt các vi sinh vật khác Trong khoảnghơn 8000 chất kháng sinh được biết đến trên thế giới hiện nay thì có hơn 80% trong số

đó có nguồn gốc từ xạ khuẩn Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces được xem lànguồn cơ chất sản xuất chất kháng sinh nhiều nhất

Thành phần xạ khuẩn trong đất vô cùng phong phú, tuy nhiên khoảng 50 năm qua, sựbùng nỗ của các nghiên cứu sang lọc xạ khuẩn từ đất khiến các chủng loài mới, cũngnhư kháng sinh mới từ nguồn cơ chất này chạm ngưỡng bão hòa Thu thập đất từ những

vị trí địa lý, thé nhưỡng có tính chat đặc biệt hơn là một trong những chiến lược tìmkiếm loài mới, kháng sinh mới từ xạ khuẩn Vườn quốc gia Gò Lò Xa Mat tỉnh Tây Ninh

có địa hình đôi thấp, trang đất ngập nước theo mùa của các sông, suối tự nhiên góp phantạo thành một hệ sinh thái vô cùng phong phú và độc đáo Đó là lý do em thực hiện đềtài: “Phân lập và sàng lọc chủng xạ khuẩn có kha năng kháng vi khuẩn và nam bệnh từVườn quốc gia Gò Lò Xa Mát ở tỉnh Tây Ninh” với mong muốn tìm ra chủng xạ khuẩn

có khả năng kháng các bệnh trong nông nghiệp, góp phan xây dựng và phát triển ngành

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập, tuyển chọn, khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của xạ khuẩn, đồng thờikhảo sát các điều kiện lên men khác nhau ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp chất khángkhuẩn và kháng nam

1.3 Nội dung thực hiện

Phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn trong mẫu đất từ Vườn quốc gia Lò Gò

Xa Mat tỉnh Tay Ninh.

Khao sát hoạt tính đối kháng của xa khuan phân lập với sinh vật thử nghiệm:Phytophthora sp., Fusarium oxysporum, Neoscytalidium dimidiatum, Candida albicans, Vibrio parahaemolyticus.

Khảo sát các điều kiện lên men ảnh hưởng đến kha năng tổng hợp chat kháng visinh vật.

Định danh bang sinh học phân tử các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu Vườn quốc gia Gò Lò Xa Mat

2.1.1 Vị trí địa lý

Vườn quốc gia Gò Lò - Xa Mát nằm trên địa phận 6 xã: Tân Bình, Tân Lập, HòaHiệp, Thạnh Tây, Thạnh Bình và Thạnh Bắc thuộc huyện Tân Biên, tỉnh Tây Ninh, cáchthành phố Tây Ninh khoảng 50 km về phía bắc tây bắc, theo đường 781, là khu vực córừng che phủ lớn nhất tại tỉnh Tây Ninh với tổng điện tích 30022 ha trong vùng sinh tháinông nghiệp Đông Nam Bộ.

2.1.2 Địa hình và thủy văn

Vườn quốc gia Gò Lò - Xa Mát rải rác có những gò cao với độ cao không vượt quá

25 m so với mực nước biển Cả vùng có độ đốc trung bình 1° - 5° do vật Vườn quốc gia

có địa hình gần như bằng phẳng Vườn gồm có đất phù sa cổ, đất phù sa sông suối, đấtphù sa có tầng laterit và đất xám đọng mùn tầng mặt

Con sông lớn nhất trong khu vực là sông Vàm Cỏ Đông Con sông này bắt nguồn

từ Campuchia, đồng thời cũng là một đoạn của biên giới dài 16 km giữa Việt Nam vàCampuchia Trong Vườn quốc gia có một số sông suối nhỏ chảy vào sông Vàm Cỏ nhưsông Da Hà ở phía đông bắc và các sông Mec Mu, Xa Nghé, Tà Dot, Bà Diệc

2.1.3 Da dang sinh học

Vườn quốc gia Gò Lò - Xa Mát nằm ở vị trí chuyển tiếp giữa nam Tây Nguyên,miền Đông Nam Bộ xuống vùng Đồng bằng sông Cửu Long, có các dạng địa hình đồithấp, bàu, trảng đất ngập nước theo mùa, các sông, suối tự nhiên Những đặc trưng chỉ

có ở Vườn quốc gia Gò Lò - Xa Mat mà các Vườn quốc gia khác không có, chi phối vàliên quan đến sự phân bố của thảm thực vật rừng, đa dạng sinh học của Vườn Gồmnhiều hệ động, thực vật rừng và các loài nguy cấp, quý hiểm Các kiểu thảm thực vậtchính tại Vườn quốc gia Gò Lò - Xa Mát: kiểu rừng nguyên sinh và thứ sinh thườngxanh cây lá rộng theo mùa, kiểu rừng sao dau thứ sinh trên đất ngập nước theo mùa trênđất ferralit nông hoặc cạn, kiểu rừng khô thưa thứ sinh ngập nước theo mùa trên datngập nước ưu thế họ Sao Dầu và Tràm và trảng ngập nước theo mùa thứ sinh ưu thếTràm và Randia, trang cỏ ngập nước theo mùa, rừng thứ sinh cây bụi trang có ngập nước

2.2 Tổng quan về xạ khuẩn

2.2.1 Giới thiệu chung và sự phân bố xạ khuẩn trong tự nhiên

Xa khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộngrãi trong tự nhiên Xạ khuẩn thuộc nganh Actinobacteria, lớp Actinobacteria, bộ

Actinomycetales, gom 10 bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài, trong đó có 478 loại xa khuẩn

đã được công bồ thuộc chi Streptomyces, hơn 500 loài thuộc các chi còn lại được sắpxếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Nữ Kim Thảo, 2006) Sựphân bồ của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảmthực vật Theo Waksman thì trong 1 gam đất có khoảng 29000 - 2400000 CFU xạ khuẩn,chiếm 9 - 45% tổng số vi sinh vật

Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng có nhiềutrong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5 Xa khuẩn có rat ít trong

lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩn trong

dat cũng thay đối theo thời gian trong năm Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của xạkhuẩn thường 25 - 30 °C Tuy nhiên xạ khuẩn cũng phát triển ở nhiệt độ cao 50 - 60 °C

và xạ khuẩn phát triển ở nhiệt độ thấp

2.2.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

2.2.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Giống như các loại vi sinh vật khác, khi nuôi cấy trên môi trường thạch, xạ khuẩnphát triển thành những khuẩn lạc Tuy nhiên, tùy theo loài và môi trường nuôi cấy khácnhau mà kích thước, màu sắc khuẩn lạc có thể khác nhau như: đỏ, da cam, vàng, nâu,tím, trắng, xám, Khuan lạc của xạ khuẩn rat đặc biệt, không trơn ướt như vi khuẩnhay nắm men, khuẩn lạc thường khô, chắc, xù xì, có dang da, dang nhung tơ, hay dạngmàng đẻo có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ và thường có cấu trúc ba lớp: lớpngoài có cấu trúc các sợi bền chặt, lớp giữa có cấu trúc tổ ong và lớp trong có cau trúctương đối xốp (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2006) Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn sinhtrưởng trong môi trường sẽ tạo ra hệ sợi cơ chất và ngoài mặt môi trường tạo ra hệ sợikhí sinh Màu sắc hệ sợi đa dạng, có thể gặp các màu trắng, vàng, đen, nâu, Hệ sợi cơchất có thé sinh ra các sắc tố tan trong nước hoặc trong dung môi hữu cơ Hệ sợi khí

sinh ở tận cùng thường là các chuỗi bào tử có dang xoắn, lượn sóng, thang, vòng

Xa khuẩn có thé mọc thành dang mang hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấykhi nuôi cấy trong môi trường dịch thé, trên bề mặt môi trường hay thành dang bọt hoặc

kết tủa kiểu vi khuẩn Khi nuôi cấy chìm trên máy lắc hoặc nồi lên men được khuấy daothì xạ khuẩn phát triển thành dang sợi bông hoặc cặn xốp Nhưng thường gặp hơn cả 1a

xạ khuẩn phát triển thành những quả cầu nhỏ chứa day môi trường, kích thước từ 0,1

Hình 2.1 Các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn.

(Nguồn: Chương trình Vi sinh vật học, Nguyên Lan Dũng và Nguyên Kim Nữ Thao, 2006).

2.2.2.2 Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn

Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh gọi là cuống bao tử Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn Hình thái, cuốngsinh bào tử và bảo tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn

-Sau thời gian phát triển, trên đầu sợi khuẩn ty khí sinh hình thành nên những sợiphân hóa gọi là cuống sinh bao tử của xạ khuẩn Tùy theo từng loại mà cuống sinh bào

tử có thé thang hay uốn cong hay xoắn ốc; chúng có thé mọc đơn, mọc đối, mọc vòng,mọc thành chùm, số vòng xoắn của cuống sinh bào tử có thể từ 5 - 10 vòng, đường kínhvòng xoắn có thé thay đổi 5 - 7 nm Bao tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dai củacuống bảo tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que

với mép nhẫn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dai thành dạng lông

Bào tử ở xạ khuẩn được sinh ra nhiều đạng: bảo tử màng mỏng gọi là bào tử trần,bao tử nam trong bao nang (sporangium) gọi là nang bào tử hay bào tử kin

(sporangiospores), bào tử sinh ra ở đầu một số khuẩn ty theo kiểu hình thành vách ngăn

(septa) Các chuỗi bào tử trần có thé là 1 bào tử (7Jermoactinomyeey,Saccharomonospora, Micromonospora), có thê có 2 bào tử (Microbispora), chuỗi ngắn

(Nocardia, Pseudonocardia Streptoverticillium, AcHnomadura, 4mycolala,

Amycolatopsis), hay chuỗi dài (Streptomyces, Saccharopolyspora, Actinopolyspora,

Kitasatosporia, nhiéu loai Nocardioides, Nocardia, Amycolatopsis, Pseudonocardia),

có thé các bao tử trần nằm trên bó soi (synnema), tương tự bó sợi của nam(Actinosynnema, Actinomadura) Hình dang, kích thước chuỗi bao tử, cấu trúc mảng

bào tử tương đối ôn định rất quan trọng trong định tên xạ khuẩn (N guyén Lân Dũng và

Nguyễn Kim Nữ Thảo, 2006) Nhưng những tính trạng, đặc điểm trên cũng có thể thayđổi khi nuôi cay trên các môi trường có nồng độ nito khác nhau (Bùi Thị Hà, 2008)

Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết phải kích thích sự sinh trưởng củakhuẩn ty khí sinh Nếu môi trường giàu dinh dưỡng quá thì quá trình sinh bào tử thường

bị kìm hãm Trong nhiều trường hợp khi kích thích sự hình thành bào tử, hiệu suất sinhtổng hợp chất kháng sinh giảm đi

et SEL hát

Một số dang bào tử 6 xa khuẩn

— Bào tử đơn (Monosporous) Micromonospora (A) ; Thermomonospora (B) ;

Saccheromonospora (C) ; Thermoactinomyces (D).

— Bào tử kép (Disporous) : Microbispora (E).

~ Chuỗi bào tử ngắn (Olygosporous) : Nocardia brevicatena (F) ; Catellatospora (G).

Hình 2.2 Một số dang bào tử ở xạ khuẩn

(Nguồn: Chương trình Vi sinh vật học, Nguyên Lan Dũng và Nguyên Kim Nữ Thao 2006).

2.2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn

Xa khuẩn là nhóm vi khuan Gram dương, hiếu khí, hoại sinh và đặc biệt có tỷ lệ

GC trong DNA cao hơn 55% theo Nguyễn Lân Dũng và ctv (1977), trong khi đó vikhuẩn khá thấp (25% - 45%) Xa khuan là một nhóm cơ thé dị dưỡng, chúng sử dụngđường, rượu, axit hữu co, protein và nhiều hợp chất khác dé làm nguồn cacbon Connitrat, nitrit, axit amin, pepton, cao men, cao thịt dé lam nguồn nitơ Ở các loài khácnhau thì khả năng hấp thụ các chất này khác nhau Phần lớn xạ khuẩn là VSV hiếu khí,

ưa 4m, nhiệt độ thích hợp dé sinh trưởng phát triển là 25 — 30 °C Da số xạ khuẩn pháttriển tốt trong điều kiện pH là 6,8 - 7,0 và ít có khả năng phát triển tốt trong môi trườngkiềm Xạ khuẩn không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự sắp xếp lại trongphân tử DNA Điều này gây ra tính đa dạng của hình thái, tính chất sinh lý và sinh hóacủa xạ khuẩn (khả năng đồng hóa các nguồn cacbon, nitơ, hoạt tính kháng sinh).

2.2.3 Phân loại xạ khuẩn

Ngày nay với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học,việc định tên một chủng xạ khuẩn được tiến hành tương đối nhanh chóng và chính xácvới nhiều phương pháp mới, song người ta vẫn chủ yêu dựa vào các đặc điểm hình thái,nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử Ví dụ như theomôi trường sống có các loại xạ khuẩn ưu nhiệt, ưa acid, ưa muối

Dựa trên các dấu hiệu hình thái, xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính

Các nhóm xạ khuẩn mang bao tử rõ rệt Đặc trưng của nhóm này là sinh sản bằng

bào tử và phân hóa thành KTKS và KTCC.

Nhóm xạ khuan có bào tử nang Đặc trưng của nhóm nay là khuẩn ty phân chiatheo hướng vuông góc với nhau, tạo ra câu trúc tương tự nang bào tử

Nhóm xạ khuan dang Nocardia: sinh sản bang cach phân đốt khuan ty

Nhóm xa khuẩn tương tự Corynebacter và dang cầu: tế bao có hình chữ V, T hoặcdạng cầu, thông thường không có khuẩn ty

Hiện nay, phần lớn các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằng mức độ tươngđồng về trình tự ARNr phản ảnh mối quan hệ tiến hóa giữa các cá thể vi sinh vật Tat cảcác loài vi sinh vật đều có cùng một cách tổng hợp protein nhờ các riboxom Vì vậyngười ta đã tiễn hành so sánh trình tự nucleotit của gen mã hóa ARNr ở các vi sinh vậtkhác nhau đề xác định mối quan hệ tiến hóa giữa chúng Và phương pháp xác định trình

tự gen ARNr 16S là phương pháp phổ biến nhất dùng để định loại vi sinh vật Tuynhiên, đặc tinh của một loài mới nên xác định từ kiểu gen đến kiểu hình, vì kế cả giảitrình tự toàn bộ bộ gen cũng rất khó dé dự đoán đặc điểm kiểu hình của một loài Sosánh kiểu hình là cách so sánh gián tiếp vi enzyme, protein là sản phẩm của gen, biéuhiện ra ngoài.

2.2.4 Ứng dụng của xạ khuẩn trong thực tiễn

2.2.4.1 Trong lĩnh vực nông nghiệp

Xạ khuẩn được ứng dụng trong việc sản xuất làm chế phẩm sinh học nông nghiệp

bởi chúng có khả năng tiết ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh có khả năng khánglại một số bệnh gây hại trên cây trồng, vật nuôi.

Trong lĩnh vực trồng trọt xạ khuẩn được ứng dụng làm chế phẩm sinh học thay thếcho các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học giúp tiêu diệt vị sinh vật gây hại như nam, vikhuẩn Ngoài ra, chúng cũng được nghiên cứu dé sản xuất các sản phẩm sinh học dinglàm chất kích thích sinh trưởng So với các sản phẩm thuốc hóa học thì chế phẩm sinhhọc có từ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh sẽ có tác dụng nhanh, dé phânhủy, có tính đặc hiệu cao, chỉ tiêu diét một số loại vi sinh vật hoặc sâu nhất định nhưngkhông gây ảnh hưởng đến những sinh vật có ích khác, đồng thời cũng không gây ô

nhiễm môi trường và có khả năng ức chế cả những loại vi sinh vật đã kháng thuốc hóa

học (Ngô Đình Quang Bính, 2005).

2.2.4.2 Trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm

Trong việc bảo quản các loại thực phẩm, các tác nhân vật lý (phương pháp đun

nóng, đông lạnh, chiếu tia UV) hoặc tác nhân hóa học (phương pháp lên men) thườngđược sử dụng Với sự phát triển của xã hội và khoa học thì chúng ta có thể sử dụng mộtliều lượng kháng sinh từ xạ khuẩn có hoạt tính sinh kháng sinh với liều lượng nhỏ débảo quản thực phẩm tránh khỏi tác động của vi sinh vật Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn

có phô tác động rộng, không chỉ tác dụng lên vi khuân Gram dương, vi khuân Gram âm

mà ngay cả với một số loại nắm cũng có thé bị tiêu điệt nhưng không làm mắt di mùi vị

và chất lượng của thực phẩm Ngoài ra, việc sử dụng chất kháng sinh trong quá trình lênmen thực phâm tươi có khả năng ức chế một số vi sinh vật có khả năng sinh trưởng vàlàm hỏng thực phẩm (Ngô Dinh Quang Bính, 2005; Lương Đức Pham, 2004)

2.2.4.3 Trong lĩnh vực y học

Đối với lĩnh vực y học ngày nay, việc nghiên cứu và phát hiện để phát triển ra cácloại chat kháng sinh mới từ các chủng xạ khuân cũng góp phan đáng kể trong các công

tác phòng chống bệnh tật, nhất là các bệnh nhiễm khuẩn của con người Nhờ có thuốc

kháng sinh mà nhiều dịch bệnh được đây lùi như dịch hạch, thương hàn hay bệnh uốnván Năm 1994, Waskman, Schatz và Bugie đã phát hiện ra streptomycin đã mang đếnmột kỷ nguyên mới trong điều trị bệnh lao và đặc biệt là bệnh viêm mang não (De LimaProcopio va ctv, 2012).

2.3 Chat kháng sinh từ xa khuẩn

2.3.1 Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn

§

Sự đối kháng giữa các vi sinh vật trong đất là cơ sở của biện pháp sinh học phòngchống bệnh cây Các nghiên cứu cho thấy cơ chế cơ bản và quan trọng nhất của sự đốikháng bởi vi sinh vật đối với mầm bệnh là do sản sinh ra các chất kháng sinh(Gnanamanickam va Mew, 1989) Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm

rõ rệt tỷ lệ bệnh của cây Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là

khả năng hình thành chat kháng sinh Số chất kháng sinh từ xạ khuẩn đều có phố kháng

sinh rộng, kiềm hãm hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nhiều loại vi sinh vậtkhác nhau Một loại xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế một vài loại nắm gây bệnh nhưng

có những loài hoạt động rộng có thể ức chế nhiều tác nhân gây bệnh có trong đất Ngoàiviệc sinh chất kháng sinh dùng trong y học thì xạ khuẩn còn sinh ra các chất đối kháng

vi sinh vật gây bệnh hại cây trồng, hại quả sau thu hoạch (như vi khuẩn héo lá, nắm mốctrên quả, nam dao 6n, nam thối cổ, TẾ)

Chất kháng sinh (Antibiotic) là những chất có tính chống lại các vi sinh vật gây

hai, chúng có hoạt tính sinh lý cao, có tác động chon lọc và được các vi sinh vật tiết ra

đi vào môi trường sống trong mối quan hệ đối kháng với các vi sinh vật khác trong đó

có vi khuẩn, nam, xạ khuẩn là những vi sinh vật sinh ra nhiều chất kháng sinh nhất Chatkháng sinh có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác mộtcách có chọn lọc ngay khi ở nồng độ thấp, có thể can thiệp vào hoạt động sinh lý củamột chất khác bằng cách kết hợp đặc hiệu với thụ thể, kiềm hãm hoặc ức chế sự phát

triển của vi sinh vật khác

Sự hình thành và các con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh Chất kháng sinhđược tổng hợp từ một, hai, ba chất trao đổi bậc một khác nhau, hay bằng cách polymehóa các chất trao đối bậc 1 sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác détạo thành các đạng kháng sinh khác nhau Chất kháng sinh còn là chất tham gia cạnhtranh của xạ khuẩn trong môi trường sống tự nhiên Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năngtong hợp đồng thời hai hay nhiều chat kháng sinh có cấu trúc hóa học va tác dụng tương

tự nhau Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều khiển genngoài các gen chịu trách nhiệm tổng hợp chất kháng sinh, còn có cả các gen chịu tráchnhiệm tổng hợp các tiền chất, enzyme và cofactor

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh

Quá trình sinh tổng hợp CKS ở xạ khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào các yéu tố như

pH, nhiệt độ, thành phần môi trường lên men, Dé xạ khuẩn sinh trưởng tốt và hình

thành các sản phẩm tối ưu, cần đảm bảo trong môi trường lên men có đầy đủ các nguồncacbon, nitơ, các nguyên tô vi lượng và các thông số về điều kiện nuôi cấy thích hợp.2.3.2.1 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ: phần lớn xạ khuẩn sinh trưởng tốt ở 28 - 30 °C Nhiệt độ tối ưu cho tổnghợp CKS tùy thuộc vào từng chủng thường nam trong khoảng 18 - 28 °C

pH môi trường: sinh tổng hợp CKS phụ thuộc rất lớn vào pH môi trường pH thíchhợp cho tổng hợp CKS thường là trung tính, pH kiềm hay axit thường ức chế quá trìnhsinh tổng hợp CKS

Độ thông khí: xạ khuẩn có nhu cầu thông khí cao hơn so với các vi sinh vật khác,nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng 6 - 12 giờ nuôi) Do vậy, đảm bảo thông khí tốt,

người ta thường thêm vào môi trường lên men benzylthioxyanat làm tăng khả năng hòa

tan của oxi Nong độ thích hợp cho sinh tổng hợp CKS là 2 - 8% Os trong dịch lên men

Lượng giống và tuổi giống: qua thực nghiệm cho thay sinh tổng hợp CKS khôngchỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử vàgiống sinh dưỡng Thông thường, lượng giống cấy truyền vào môi trường lên men đểhiệu quả nhất là từ 2 - 10%, tuổi giống thường là 24 giờ

2.3.2.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men

Nguồn cacbon: các hợp chất cacbon có ảnh hưởng rat lớn tới quá trình sinh trưởng

và sinh tông hợp CKS Tùy thuộc vào từng chủng mà chọn nguồn cacbon thích hợp nhưcác loại đường đơn glucose, fructose, galactose hay các loại đường đôi như maltose,

saccarose, lactose, ; các loại đường đa như tinh bột, destrose, ; các loại thành phần

không xác định như rỉ đường, đại mạch, ; cũng có thể là các axit hữu cơ và chất béolàm nguồn cacbon Trong tat cả các nguồn cacbon thì glucose là nguồn cacbon dé tiêuhóa, nhưng nó thường gây nên hiện tượng kiềm chế dị hóa trong tổng hợp CKS ở mộtngưỡng nông độ nào đó Tuy nhiên ta có thể khắc phục được hiện tượng nay bang cách

bồ sung liên tục một lượng nhỏ glucose theo định kỳ, mà không dẫn đến tích lũy các

chất trao đối ức chế, nhờ đó có thể tiễn hành sản xuất CKS từ nguồn cacbon là glucose

Nguồn nito: hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh CKS đều đòi hỏi cả 2 nguồn nitơ hữu

cơ và vô cơ Trong đó, nguồn nitơ vô cơ thường cho khả năng sinh CKS không cao

Nguồn nitơ hữu hiệu nhất thường là các sản phẩm từ thực vật như bột đậu tương, bột

đậu xanh, cao ngô,

Nguồn photphat vô cơ: nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp phần lớn

10

CKS không quá 10 mg/ml Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm tăng lượng axit nucleic

trong khuẩn ty, làm kéo dai pha sinh trưởng, rút ngắn pha tông hợp, làm tăng ATP trong

tế bào dẫn đến làm giảm hoặc ngừng quá trình sinh tổng hợp CKS Sự thừa photphatcũng ức chế tổng hợp các enzyme tham gia vào quá trình trao d6i chat sơ cấp và thứ cấp

làm giảm khả năng tổng hợp CKS

Các yếu tô vi lượng: đây là thành phan không thể thiếu trong môi trường lên men

Nếu môi trường lên men có nguồn dinh đưỡng tự nhiên thì hầu hat các nguyên tổ vilượng đã có sẵn Việc bổ sung các chất giàu nguyên tố vi lượng vào môi trường sẽ làmthay đôi đáng ké khả năng tổng hợp chất kháng sinh của nhiều chủng xạ khuẩn

2.4 Tình hình nghiên cứu ở trong và ngoài nước

2.4.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Việc phát hiện ra penicillin vào năm 1928 bởi A Fleming va streptomycin phân

lập từ S griseus bởi A Waksman vào năm 1943 đánh dấu một kỷ nguyên trong việc tim

kiếm các kháng sinh mới từ tự nhiên

Một vi dụ khác là phân lập Saccharopolyspora erythraea sản xuất ra erythromycin

vào năm 1949 bởi Abelardo Aguilar.

Một vi dụ nổi bật là việc phân lập Streptomyces avermitilis vào đầu những năm

1970 bởi S Omura và nhóm nghiên cứu của ông từ mẫu đất sân gôn S avermitilis đượcbiết đến nhiều với khả năng sản xuất ra avermectin

Năm 2006, Marinomycins A - D, kháng sinh thuộc lớp cấu trúc mới từ chi xạkhuẩn biển “Marinispora” được Kwon và cộng sự phát hiện cho thấy hoạt tính khángkhuẩn đáng kể chống lại sáu trong số tam dòng tế bảo khối u ác tính

Năm 2010, Orakci và cộng sự đã phân lập và tuyển chọn được các chủng xạ khuẩn

có kha năng đối kháng, làm tác nhân kiểm soát sinh học chống lại nam thối rễ

Năm 2010, Eienstein va cộng sự đã khám phá ra daptomycin - kháng sinh được

chấp thuận điều trị các bệnh truyền nhiễm trong da, viêm da phức tap gây ra bởi vi khuẩn

Gram dương từ Streptomyces roseosporus phân lập từ mẫu đất của Ararat, Thổ Nhĩ Kỳ

Năm 2016, Khucharoenphaisan và cộng sự đã sàng lọc được chủng xạ khuẩnStreptomyces malaysiensis có khả năng tạo ra các chất chuyên hóa thứ cấp khác nhau

chống lại Phytophthora sp - nguyên nhân gây bệnh thối củ sắn

Năm 2021, Li và cộng sự đã phân lập và tuyên chon chủng Streptomyces sp 2) có khả năng đối kháng với nam Fusarium oxyspoum f sp cubense (Foc) gây bệnh

(H3-héo rũ trên cây chuối.

Nhiều loại thuốc kháng sinh có sẵn trên thị trường được sản xuất bởi các xạ khuẩn

hiếm gồm có rifamycin bởi Amycolatopsis mediterranei, vancomycin bởi Amycolatopsis

orientalis, erythromycin bởi S%accharopoljyspora erythraea, teicoplanin bởi Actinoplanes teichomyceticus, va gentamicin bởi Micromonospora purpurea.

Các chat chuyên hóa vi sinh vật cũng có ý nghĩa quan trọng đối với hóa tri liệu ung

thư Actinomycin D phân lập được từ Streptomyces sp là chất chuyên hóa thứ cấp lâuđời nhất được sử dụng cho điều trị ung thư

2.4.2 Các nghiên cứu trong nước

Các đề tài về xạ khuẩn ở Việt Nam cũng được quan tâm khá nhiều

Năm 2011, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên và cộng sự đã điều tra, nghiên cứu một

số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn

Năm 2012, Nguyễn Văn Hiếu và cộng sự đã nghiên cứu chủng xạ khuẩn H D 3.16

có hoạt tính kháng khuẩn và khả năng sinh một số enzyme ngoại bào như: amylase,cellulase và protease phân lập từ vùng ven bờ biển Việt Nam

Năm 2014, Lê Thị Hiền và cộng sự đã phân lập và tuyển chọn được hai chủng xạ

khuẩn là Streptomyces roseosporus HN6 va Streptomyces albofaciens NA1 đối khángvới nam bệnh cây

Năm 2016, Đinh Hồng Thái và Lê Minh Trường đã tuyển chọn được 5 chủng xạkhuẩn là TG1, TG4, HG3, HG4, CM18 và BL16 được phân lập từ đất trồng sen ở một

số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long luôn thé hiện kha năng đối kháng cao so với namPhytopphthora sp - gây bệnh cháy lá, thối thân trên sen

Năm 2016, Nguyễn Xuân Cảnh và công sự đã tuyển chọn được chủng xạ khuẩnStreptomyces aureofaciens có khả năng đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticusgây bệnh trên tôm.

Năm 2019, Phạm Hồng Hiển và cộng sự đã tuyển chọn ra được dong xạ khuẩnthuộc chi Streptomyces có khả năng đối kháng với nam Phytophthora gây bệnh trên một

số loại cây ăn quả Đồng thời đã xác định được các điều kiện thích hợp cho nuôi cấychủng xạ khuẩn này bao gồm khả năng đồng hóa nguồn cacbon và nitơ, các điều kiện

nhiệt độ, pH và nồng độ muối phù hợp cho nuôi cấy

Năm 2021, Phạm Thị Tuyến Ngân và cộng sự đã phân lập được 12 chủng xạ khuẩn,

trong đó chủng DH3.4 có khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus cao Ngoài ra chủng

12

DH3.4 được coi là tiềm năng với khả năng sinh hoạt tính enzyme ø-amylase, protease

và cellulase tương đối cao

Năm 2022, Định Trường Sơn và cộng sự đã phân lập được chủng xạ khuẩnStreptomyces diastatochromogenes VNUA27 giúp phòng trừ nam Fusarium oxyspoum

f sp cubense (Foc) TR4 dat hiệu quả cao bằng biện pháp sinh học

Hiện nay, nhiều trong số các kháng sinh sử dụng trên lâm sang là sản phẩm trựctiếp của tự nhiên hoặc các dẫn xuất bán tổng hợp từ xạ khuẩn được phát hiện thông quaquy trình sàng lọc khuẩn toàn bộ tế bào Do đó, việc sảng lọc chủng xạ khuẩn ở nước ta

có thể giúp tìm kiếm những chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng vi sinh vật cũng như

mở ra cơ hội xác định chất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh từ dịch nuôi tế bào

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP

3.1 Thời gian và dia điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện đề tài dự kiến từ tháng 03/2023 đến tháng 08/2023

Địa điểm: phòng Vi sinh ứng dụng RIBE 212, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinhhọc và Môi trường tại Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu

3.2.1.1 Mẫu thí nghiệm

Các chủng xạ khuẩn được phân lập từ mẫu đất tại vườn quốc gia Gò Lò Xa Máttỉnh Tây Ninh.

Các chủng sinh vật kiểm nghiệm: Phytophthora sp., Fusarium oxysporum,

Neoscytalidium dimidiatum, Candida albicans, Vibrio parahaemolyticus được cung cấpbởi phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường tại

Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh

và một số dụng cụ trong phòng thí nghiệm

3.2.1.3 Môi trường

Các môi trường được sử dụng trong nghiên cứu:

Môi trường SCA: tinh bột 10 g/L, casein 0,3 g/L, KNO32 g/L, NaCl 2 g/L, KzHPO¿a

2 g/L, MgSO4.7H20 0,05 g/L, CaCO; 0,02 g/L, FeSO4.7H20 0,01 g/L, thạch agar 20 g/L, pH = 7,0.

Môi trường Gause I: tinh bột 20 g/L, KNO3 1 g/L, NaCl 0,5 g/L, K2HPO, 0,5 g/L,

MgSOa.7HaO 0,5 g/L, FeSO4.7H20 0,01 g/L, thạch agar 20 g/L, pH = 7,2 - 7,4.

Môi trường ISP2: yeast extract 4 g/L, malt extract 10 g/L, glucose 4 g/L, thạch

agar 20 g/L, pH =7,3.

14

Môi trường ISP4: tinh bột 10 g/L, NaCl 1 g/L, KzHPO¿ 1 g/L, CaCO3 2 g/L,

MgSO.7HaO 1 g/L, (NH4)2SOu4 2 g/L, thạch agar 20 g/L, pH = 7,2 - 7,4.

Môi trường M177: tinh bột 10 g/L, KNO3 2 g/L, NaCl 2 g/L, KaHPO¿ 2 g/L,

CaCO3 0,02 g/L, casein 0,3 g/L, MgSOa.7HaO 0,05 g/L, FeSO4.7H20 0,01 g/L, thạch agar 20 g/L, pH = 7,2 - 7,4.

Môi trường M180: tinh bột 10 g/L, KNO3 1 g/L, NaCl 0,2 g/L, KaHPO¿ 3 g/L,

CaCO 0,5 g/L, MgCO3 0,3 g/L, FeSO, 0,001 g/L, thạch agar 20 g/L, pH = 7,2 - 7,4.

Môi trường LB: tryptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 5 g/L.

Môi trường PDA: potato extract 200 g/L; dextrose 20 g/L, thạch agar 20 g/L 3.2.2 Phuong pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Phương pháp lấy mẫu

6 mẫu đất được lấy tại vườn quốc gia Gò Lò Xa Mát tỉnh Tây Ninh Lấy mẫu đất

cách bề mặt từ 5 - 10 cm khoảng 10 - 20 g Mẫu đất sau khi thu sẽ được đựng vào túi

nilon đã khử trùng và ghi nhãn Các mẫu thu thập được chuyên về phòng thí nghiệmphân lập ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 °C trong vòng 24 giờ (Lương Thi Hương Giang, 201 1).

Tiếp đến dùng micropipet hút 0,1 mL dich pha loãng ở 2 nồng độ 103 và 107 lên

bề mặt của đĩa petri chứa môi trường SCA và Gause I, mỗi nồng độ lặp lại hai lần Dùng

que cấy thủy tinh trải đều dich pha loãng trên toàn bộ bề mặt đĩa và trang đến lúc đĩamôi trường khô Đĩa được ủ ở nhiệt độ 30 °C trong 4 - 7 ngày Sau đó tiến hành quan sát

và phân biệt khuẩn lạc xạ khuẩn với các loại vi sinh vật khác đựa trên hình thái khuẩn

lạc và màu của sợi nam

Khuan lạc riêng rẽ được cay ria sang dia petri chứa môi trường ISP2 dé làm thuần

u 0 30 °C trong 4 - 7 ngày.

3.2.2.3 Phương pháp cấy chuyền giữ giống

Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy làm thuần bằng cách dùng que cấy vòng cấychuyền các khuẩn lạc khi ngờ lên đĩa petri chứa môi trường ISP2 để làm thuần Thựchiện nhiều lần đến khi khuẩn lạc đồng nhất trên dia petri

Giữ giống trong ống thạch nghiêng hay glycerol để bảo quản giống được lâu hơn

và tránh hiện tượng thoái hóa giống

Giữ giống trong ống thạch nghiêng: các chủng xạ khuẩn phân lập được sẽ cấy theokiểu zic zac trong ống thạch nghiêng chứa môi trường ISP2 Sau 3 - 5 ngày mọc lên,ống thạch nghiêng sẽ được đi ủ ở 4 °C và sẽ được cấy chuyền hàng tháng

Giữ giống trong glycerol: các chủng xạ khuẩn phân lập được sẽ được giữ trongglycerol 20% có bổ sung pepton 1% ở nhiệt độ -20 °C Giữ giống theo cách này có thể

giữ được lâu hơn và cần được hoạt hóa lại trước khi nhân giống.

3.2.2.4 Phương pháp quan sát khuẩn ty xạ khuẩn

Cay ria các chủng đã phân lập được trên môi trường ISP2 dé quan sát các đặc điểmkhuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn: về hình dáng khuẩn lạc, mau sắc của khuẩn ty khísinh (KTKS), màu sắc của khuẩn ty cơ chất (KTCC) dựa vào khóa phân loài Bergey(Parte và ctv, 2012).

Chuỗi bảo tử và bề mặt bào tử được nhuộm màu và quan sát dưới kính hiển vi điện

tử sau 7 - 14 ngày nuôi cấy trên môi trường ISP2 được dùng đề xác định các dòng xạkhuẩn Chuỗi sinh bảo tử có các dạng thắng hay hơi lượn sóng kí hiệu là RF, hình móccâu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S

Làm tiêu bản mẫu: nhỏ một giọt nước cất vô trùng lên giữa lam kính Dùng quecấy vòng khử trùng trên ngọn lửa đèn côn rồi lấy một ít sinh khối khuẩn lạc xạ khuẩntrai mỏng lên giọt nước, tách rời các sợi Dé khô tự nhiên hoặc ho nhanh qua đèn cồnmặt dưới lam kính dé cố định khuẩn Nhỏ 1 - 2 giọt Crystal Violet lên lam trong 1 phút,

rửa nước 5 giây Nhỏ 1 - 2 giọt Lugol dé trong 1 phút, rửa nước 5 giây Rửa lại bằng

cồn thật nhanh trong 15 giây đề tây màu cho đến khi giọt cồn không còn màu tím, rửanước Đặt lamen lên lam kính và quan sát ở vật kính 40X và 100X dùng dầu soi kính

3.2.2.5 Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng sinh

Xa khuẩn được phân lập và xác định từ các mẫu đất được kiểm tra phố kháng

khuẩn của chúng Vi sinh vật kiểm định được sử dụng để sảng lọc ban đầu làPhytophthora sp., Fusarium oxysporum, Neoscytalidium dimidiatum, Candida

16

albicans, Vibrio parahaemolyticus Khảo sát được tiễn hành trên các môi trường LB với

vi khuân và môi trường PDA đôi với nâm.

Bang 3.1 Bồ trí thí nghiệm khảo sát tính đối kháng với 5 vi sinh vật kiểm nghiệm

Nghiệm thức Tên môi trường Vi sinh vật kiểm nghiệm

Phy PDA Phytophthora sp.

Neo PDA Neoscytalidium dimidiatum Fus PDA Fusarium oxysporum Can PDA Candida albicans Vib LB Vibrio parahaemolyticusChuẩn bị chất cấy: các chủng vi vi vật kiểm định được tiến hành hoạt hóa trongmôi trường LB, nam men được hoạt hóa trong PDA và ủ ở nhiệt độ 37 °C trong 24 gid.Tiến hành tăng sinh khuẩn trong môi trường LB long và nam men trong môi trườngPDA lỏng được điều chỉnh sao cho mật số đạt 10° CFU/ mL sau khoảng 48 giờ tăng sinhbằng cách sử dụng máy đo quang phố ở bước sóng 660 nm Dé môi trường thích hợpcủa vi khuân và nam men vào các đĩa petri Cay trải vi khuẩn và nắm men sau khi đượctăng sinh lên đĩa petri.

Phương pháp thỏi thạch (Nguyễn Lân Dũng và Phạm Thị Trân Châu, 1978): xạ

khuẩn được nuôi cấy trên dia petri chứa môi trường ISP2 ở 30 °C Sau 7 ngày nuôi cấy,thỏi thạch xạ khuẩn đặt vào dia petri đã cấy vi sinh vật kiểm định Vi khuan kiểm nghiệmnuôi ở 37 °C, nam men nuôi ở 28 - 30 °C Đọc kết quả sau 1 ngày đối với vi khuẩn, nammen Các nghiệm thức được lặp lại ba lần Hoạt tính kháng sinh được xác định dựa vào

kích thước vòng kháng.

Phương pháp đồng nuôi cấy (Dhanasekaran và ctv, 2012): khả năng đối kháng củacác chủng xạ khuẩn với các chủng nam bệnh được đánh giá bằng phương pháp đồngnuôi cay trên môi trường PDA Nam bệnh được cấy ở trung tâm đĩa petri, chủng xạ

khuẩn được cay ở 4 góc bao quanh nam bệnh Đường kính vòng kháng được xác định

sau 4 - 7 ngày nuôi cay ở 30 °C Các nghiệm thức được lặp lại ba lần

Phương pháp khoanh giấy lọc: khoanh giấy lọc có đường kính 6 mm được tắm mộtlượng dung dich CKS (1 mL/ 10 khoanh giấy lọc) Đặt khoanh giấy lọc đã tâm CKS vàodia petri đã cấy vi sinh vật kiêm nghiệm Vi khuan kiểm nghiệm nuôi ở 37 °C, nam men

và nam mốc nuôi ở 28 - 30 °C Đọc kết quả sau 1 ngày đối với vi khuẩn, nắm men và 4ngày đối với nắm mốc Các nghiệm thức được lặp lại ba lần Hoạt tính kháng sinh được

xác định dựa vào kích thước vòng kháng.

Vòng kìm hãm VSV được tính bằng mm theo công thức:

Ching xạ khuan đã tuyên chọn được nuôi cấy trong bình nón 250 mL chứa 100

mL môi trường Gause I và nuôi lắc 220 vòng/ phút trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng Giống

phát triển tốt sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

Lựa chọn môi trường lên men thích hợp

Bồ sung 4% giống xạ khuẩn tuyển chon và lên men trong bình nón chứa 100 mLvới các môi trường: Gause I, ISP4, M177 và M180 Sau 120 giờ nuôi cấy lắc tròn vớitốc độ 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng Xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch lênmen bằng phương pháp khoanh giấy lọc dé chọn ra môi trường phù hợp cho nhữngnghiên cứu tiếp theo

Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp chat khang vi sinh vật

Tiếp 4% giống xạ khuẩn vao trong bình nón chứa 100 mL với môi trường đã chọn

và thay thế nguồn cacbon lần lượt bằng tinh bột, glucose, maltose, sucrose với lượngtương đương Sau 120 giờ nuôi cấy lắc tròn với tốc độ 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng.Xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch lên men bằng phương pháp khoanh giấy lọc

dé chọn ra nguồn cacbon phù hợp cho những nghiên cứu tiếp theo

Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tông hợp chất kháng vi sinh vật

Tiếp 4% giống xạ khuẩn vào trong bình nón chứ 100 mL với môi trường, nguồncacbon đã chọn và thay thế nguồn nitơ lần lượt bằng bột đậu tương, cao thịt, pepton,

(NH¿2zSO¿ với lượng tương đương Sau 120 giờ nuôi cấy lắc tròn với tốc độ 220 vòng/

phút ở nhiệt độ phòng Xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch lên men bằng phươngpháp khoanh giấy lọc dé chọn ra nguồn nitơ phù hợp cho những nghiên cứu tiếp theo

18

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tổng hợp chất kháng vi sinh vật

Sau khi chọn được môi trường, nguồn cacbon, nguồn nitơ phù hợp Tiếp 4% giống

xạ khuẩn vào trong bình nón chứa 100 mL với những điều kiện lên men này Sau 120giờ nuôi cấy lắc tròn với tốc độ 220 vòng/phút ở các nhiệt độ 5 °C, 20 °C, 30 °C và 38

°C Xác định hoạt tinh kháng sinh trong dịch lên men bằng phương pháp khoanh giấylọc dé tìm ra nhiệt độ tối ưu cho việc tổng hợp chất kháng

3.2.2.7 Định danh các chủng xạ khuẩn

Hút dich tăng sinh của chủng vao ống eppendorf, ly tâm 10000 rpm trong 15 phút

Đồ bỏ dịch nổi, tiếp tục thêm dich tăng sinh còn lại vào ống cũ và ly tâm cho đến khihết 10 mL dịch tăng sinh hoặc khối lượng tế bào khoảng 0,2 g

Sau khi lượng tế bào đạt yêu cầu thi cho vào ống eppendorf 1000 uL dung dịchCTAB- hóa chat có tác dụng phá vỡ mảng tế bao, vortex dé hòa tan tế bào U ống trong

bề điều nhiệt 60 °C trong 1h Ly tâm 13000 rpm trong 15 phút Nhẹ nhàng hút 800 pL

dịch nổi sang ống eppendorf mới

Thêm phenol: chloroform: isoamylalcolhol (25:24 :1) vào ống mới chứa dịch nỗi,vortex và dé ôn định trong ngăn lạnh đông của tủ lạnh 2 phút.Sau ly tâm, hỗn hợp tachthành 3 lớp, hút dịch nỗi trên cùng cho vào eppendorf mới

Thêm isopropanol với tỉ lệ 1:1 v/v U mẫu ở 80°C trong 30 phút Ly tâm lạnh 14000

rpm trong 15 phút, bỏ dịch thu tủa trắng đục Rửa tủa bằng 1000 pL ethanol 70%, ly

tâm Làm khô cặn DNA bằng cách mở nắp ống, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút ở

trong buồng cấy DNA tổng số được hòa trong 50 pl đệm TE và bảo quản mau ở 4 °Ccho các thí nghiệm tiếp theo Kết quả tách chiết DNA bộ gen trên gel được phát hiệnbằng hộp đèn UV Thực hiện phản ứng PCR với các thành phan: 2,5 pL đệm PCR; 0,5

uL DNA tổng số; 0,5 L dNTPs; 1 pL mỗi loại mỗi và 0,2 pL Taq polymerase

Sau đó sản pham PCR được gửi đi giải trình tự bởi Viện Sinh học Phân tử Loci(Địa chỉ: 54 Phan Đăng Lưu, Phường 5, Quận Phú Nhuận, Thành phố Hồ Chí Minh)

So sánh trên dữ liệu ngân hang NCBI.

3.3 Xử lý số liệu

Các số liệu thí nghiệm được nhập và xử lý sơ bộ, tính các giá trị trung bình và vẽ

biểu đồ bằng phần mềm Excel 2016, phân tích ANOVA một yếu tố các chỉ tiêu theo dõi

bằng phần mềm Minitab 16, vẽ cây đi truyền bằng phần mềm Mega 11

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả phân lập và làm thuần

Sau khi tiến hành phân lập 6 mẫu đất được thu thập từ đất tại vườn quốc gia Gò

Lò Xa Mát, tỉnh Tây Ninh trên hai môi trường SCA và Gause I Kết quả dựa vào hìnhthái khuẩn lạc phân loại được 30 đòng xạ khuẩn khác nhau

Sau khi cấy và làm thuần những khuẩn lạc nghi ngờ là xạ khuẩn trên môi trường

ISP2 Hình dáng khuẩn lạc, màu sắc khuẩn ty co chất, khuẩn ty khí sinh đều thể hiện

khác nhau giữa các chủng phân lập Kết quả quan sát đặc điểm khuẩn lạc của các dòngxạkhuẩn phân lập được ghi nhận ở Bảng 4.1

20

Bảng 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các xạ khuẩn phân lập

Chủng Hình dáng khuân lạc Màu sắc KTCC Màu sắc KTKS

dạng phóng xạN2 Khô, vòng tròn đông tâm, Vàng nhạt Nâu nhạt

dạng phóng xạKết quả phân lập được 16 chủng có hình dạng giống xạ khuẩn Xạ khuẩn là nhóm

vi khuẩn có đặc điểm rất khác biệt với các nhóm vi khuẩn khác ở chỗ rất đa dạng vềmàu sắc khi nuôi trên môi trường nuôi cấy khác nhau Tùy theo thành phần môi trường

và thời gian nuôi cấy mà màu sắc KTCC và KTKS hay sắc tố hòa tan tiết ra khác nhau

và thay đôi mau liên tục Da số các chủng phân lập được đều khô, hình tròn đồng tâm,dạng phóng xạ, có mùi đặc trưng của xạ khuẩn với đặc điểm hình thái tương đồng vớicác chủng xạ khuẩn và màu của KTKS chiếm phan lớn là màu xám, sau đó là màu trắng

và nâu (Nguyễn Lân Dũng, 2001).

4.2 Mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hién vi các chuẩn chọn lọc

|

Á

Hình 4.3 Kết quả nhuộm màu các chủng xạ khuẩn ở độ phóng đại 100X

NI, N2, N3, N4: các chung xạ khuám.

22