Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp IAA và cố định đạm trên cây chuối ở Gia Lai

Từ thực tiễn trên, đề tài “Phan lập các dòng vi khuẩn nội sinh có khả tổng hopIAA và có định đạm trên cây chuối ở Gia Lai” được thực hiện ra... Mục tiêu đề tàiPhân lập được một số dòng v

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

PHAN LẬP CÁC DONG VI KHUAN NỘI SINH

TP Thủ Đức, 3/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

-KHOA -KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHAN LẬP CAC DONG VI KHUAN NỘI SINH

CÓ KHẢ NANG TONG HỢP IAA VÀ CÓ ĐỊNH DAM

TREN CAY CHUOI Ở GIA LAI

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS Võ Thị Thúy Huệ Lê Anh Đài

KS Nguyễn Minh Quang

TP Thủ Đức, 3/2024

LỜI CẢM ƠN

Trong cuốn khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban

Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm KhoaKhoa học Sinh học và tat cả các thầy cô đã luôn đồng hành và hỗ trợ tôi suốt quãng thời

gian học tập.

Đặc biệt, tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến thạc sĩ Võ Thị Thúy Huệ và

kĩ sư Nguyễn Minh Quang, những người đã hướng dẫn tận tình và chia sẻ kiến thức

chuyên môn, giúp tôi hoàn thành đề tài của mình một cách thành công

Không thê không nhắc đến sự giúp đỡ từ chị Nguyễn Thị Thùy Trang và anh LêNguyễn Thanh Đông, cùng những người bạn tại phòng Nam ăn & Nam dược liệu và

phòng RIBE 304 — Thử nghiệm Hoa Sự chia sẻ kinh nghiệm va sự hỗ trợ từ các bạn đã

giúp tôi có được những kiến thức và những góc nhìn mới mẻ đối với đề tài của mình

Cuối cùng, không thé không nhắc đến gia đình và em Nguyễn Thị Mỹ Liên,nguồn động viên vô cùng lớn lao và nguồn động lực không ngừng trong suốt hành trìnhhoàn thành đề tài của tôi Cảm ơn gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên và chia sẻ mọikhó khăn và niềm vui cùng tôi

Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người vì đã đồng hành và ủng

hộ tôi trong hành trình này.

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Lê Anh Dai, MSSV: 19126020, Lớp: DH19SHD thuộc ngành Công nghệ

Sinh học trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây làkhóa luận tốt nghiệp do chính bản thân tôi thực hiện, tất cả số liệu và kết quả nghiên cứuđạt được hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin chịu trách nhiệm trước hội đồng

về khóa luận tốt nghiệp của mình

Thành phố Thủ Đức, tháng 3 năm 2024

Người việt cam đoan

Lê Anh Đài

1

TÓM TẮT

Tình trạng lạm dụng phân bón hóa và thuốc bảo vệ thực vật dẫn đến thoái hóađất nông nghiệp ngày cảng nghiêm trọng, đặc biệt ở các vùng sâu, vùng xa với sự thiếuhiểu biết về cách quản lý đất và sử dụng phân bón, thuốc bảo vệ thực vật một cách kémhiệu quả Vì vậy, việc nghiên cứu này được tiến hành dé phân lập các dòng vi khuẩn nộisinh có khả năng tong hợp IAA (Indole-3-acetic acid) và có định đạm tốt là trong nhữngbiện pháp thay thế hiệu quả cao Các dòng vi khuan được phân lập từ mẫu đất và rễ câychuối ở huyện Mang Yang, tỉnh Gia Lai Kết quả phân lập được 15 dòng nội sinh trên 2môi trường NFb và BAz Khảo sát khả năng cô định đạm 15 dòng đã phân lập bằngphương pháp Indophenol blue thu được 4 dòng có hàm lượng đạm tông hợp cao DI.5

(2,40 ug/ml), D2.6 (2,92 ug/ml), D3.8 (2,24 ug/ml) và R5.1 (2,66 pg/ml) ở ngay nuôi

cấy thứ 6 Khảo sat khả năng sinh tổng hop IAA của 4 dong vi khuẩn theo phương phápSalkowski Kết quả 4 dòng đều có khả năng sinh tông hợp IAA cao nhất là 2,06 (g/ml)dòng D2.6, thấp nhất là 1,81 (ug/ml) dòng D3.8 Bốn dòng vi khuẩn này được định danhbằng phương pháp sinh học phân tử giải trình gen 16S rRNA, và kết quả cho độ tươngđồng cao với loài Bacillus pumilus (dong D2.6) với độ tương đồng 99,93%, loài Bacillussubtilis (dòng D1.5 và R5.1) độ tương đồng đều trên 99% và loài Brevundimonas terrae(Dòng D3.8) độ tương đồng 99,81% Phân lập thành công vi khuẩn nội sinh cây chuối

thuộc loài Bacillus pumilus, Bacillus subtilis và Brevundimonas terrae có kha năng sinh

tông hop IAA và cô định đạm tốt

Từ khóa: vi khuẩn nội sinh, cố định đạm sinh tông hợp IAA, Indophenol blue,

Salkowski.

HỘI

The widespread misuse of chemical fertilizers and plant protection substances

has led to increasingly severe agricultural soil degradation, particularly in remote and less-informed regions with deficient understanding of soil management and inefficient use of fertilizers and plant protection substances Therefore, this research was conducted

to isolate endophytic bacteria capable of synthesizing Indole-3-acetic acid (IAA) and efficiently fixing nitrogen as highly effective alternative measures The bacteria were isolated from soil and banana roots in Mang Yang district, Gia Lai province The

isolation yielded 15 endophytic strains on NFb and BAz media The nitrogen-fixing

ability of the 15 isolated strains was assessed using the Indophenol blue method, resulting in four strains with high levels of synthesized nitrogen D1.5 (2.40 g/ml), D2.6 (2.92 pg/ml), D3.8 (2.24 ug/ml), and R5.1 (2.66 pg/ml) on the sixth day of cultivation The IAA synthesis capability of the four bacterial strains was surveyed using the Salkowski method The results showed that all four strains had the highest IAA synthesis capacity, with strain D2.6 at 2.06 (ug/ml) and the lowest at 1.81 (ug/ml) for strain D3.8 These four bacterial strains were identified using molecular biological methods analyzing the 16S rRNA gene, revealing a high similarity with Bacillus pumilus (strain D2.6) at 99.93%, Bacillus subtilis (strains D1.5 and R5.1) above 99%, and

Brevundimonas terrae (strain D3.8) at 99.81% The successful isolation of endophytic

bacteria from banana plants belonging to Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, and Brevundimonas terrae demonstrated their capability in IAA synthesis and effective

nitrogen fixation.

Keywords: endophytic bacteria, nitrogen fixation, [AA synthesis, Indophenol blue, SalkowskI.

IV

2.2.1 Cau tạo và đặc điểm của cây chuối oe ccceeceeccescsessesesesseseeeeseesesseeseseeseseesesenees 4

2.2.2 Plan b6 tai Vidt Natt 8MR 52.2.3 Thổ nhưỡng của cây chuối -2- 2 ©22222+2+22E+2EE£2EE2EEEEEE2EE22E222221 22v 52.3 Một số giống chuối phổ biến ở Việt Nam - 2-2 ©2222222E22EZ2EE2E222122E222zze 52.4 Sơ lược về vi khuân nội sinh thực vật - 2-2©-s©cz+ec+z.+zrkecrerrrrsrrecee 6

2Á, PW HỆ HÌÃ son ii c6c0560456616695810460360ã65366550/055E0501565383686484864368583u83664382885:30g006 35818) 48080-162g8u8 6

242 Nguồn sốc vi khuẩn nội sinh thực vật 22-52 2+S+EE£E2EE£EEEEEEEEEeErrrrkrrves 7

2.4.3 Đa dạng vi sinh vật nội sinh thực Vat 5-55-2222 3 2212221221 12E221E2121Eeerxes 7

2.4.4 Sự xâm nhập vi khuẩn nội sinh 2-2 s+S2+S£SE+EE+E£EE2EE2EE2E2E22122222222 2 xe2 10

2.5 Khả năng cô định đạm của vi khuẩn nội sinh 2- 22 522252z2S2222Sz2zz2s+2 10

2.6 Khả năng tong hợp indole-3-acetic acid (IAA) của vi khuẩn nội sinh 123.7 Tình Hinh vagal ch gần đầy chà HH HH 0.1020 10130 ancien 12

2.7.1 Tình hình nghiên cứu trong nưỚC - - 252 52 S2*2**+*2E2EEzEkrrrkrrrrree 12

2/26 Tink hifihfiphiển cứu hgbãi HƯỚ oeesssesaasbenossiissgissE28433805535550653950050045858058806 13

CHUONG 3 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHAP 0 csssesssssssessesessessesetsesseseseeseeeees 143.1 Thời gian whofe điểm sr On sacra ones nsreneaneonsisc 14

3.0: Vat ISU) TG HIST OU ¡ácnsoeoBionisuntitSEEIERSASSL-NGGAHHUIRGSHENEIIAIGI4GIGRESGGHSGGIIGSASISGISEHSSRĐEG388043088E 14

3.2.1, Miẫu thí IS ce vvesarvenesenevesorenenesseceunererevaneverencnevensavaneerenncsereneneseursureenesenneress 143.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chat thí nghiệm 2- 22 +222S+2E+2E22E2E22E222z2ze2 14

3;3 PhØne:phấp ngh†iẾH GỨNstsssssticssszcssgi2yaxsg223716880/3900463538)580385.E75E9330L320)l98i1/000u.24:80.59s 14

3.3.1 Thu thập mau và phân lập dòng vi khuẩn nội sinh - -22225522522522522 14

T11, E bi l tí losneseobuestorttsoatgrntiicbptererfienssgfEircoiigeipvgstsrngitintring0rtsntsizbrGSS0E 143.3.1.2 Phân lập và làm thuần các dòng vi khuẩn 2: 2¿©22+2z2z++zxzzzzzzzzex 153.3.1.3 Quan sát khuẩn lạc và làm thuần các dong vi khuân -. -2- 5z: 16

3.3.1.4 Bao quản giống vi khuẩn + 2222SS2E9EE2E2122123121221211212121121211211 21 Xe 16

3.3.2 Quan sát hình thái tế bao và nhuộm Gram vi khuẩn 222 2522s+2zz24 163.3.3 Khao sát một số đặc điểm sinh hóa của các đòng vi khuẩn - 2: 17

3.3.3.1: Thử nghiệm khả nang di d6n8 sscssccscsccsssssessssvesssseosess nascent nese oreseenensanieess 17

EEbc 2W iniaijo o0) 18

3.3.3.3 Thử nghiệm kha năng lên men các loại đường - - -+-<+<c+<c<+¿ 18

3.3.3.4 Thử nghiệm kha năng biến dưỡng citrate eee eececeeeceeseeeseeseeeeeeees 19

33.3.9, Thintighiem kha nano sinh THdĐÏussseessssseissesasintiotgsidgsidltiSGEELSGI3413 08008302980 19

3.3.4 Tuyến chon các dòng vi khuẩn có khả năng cô định dam và tổng hợp IAA tốt.193.3.4.1 Do hàm lượng đạm (NH¿') bằng phương pháp Indophenol blue 193.3.4.2 Xác định khả năng tổng hợp IAA bằng phương pháp Salkowski 21

VI

3.3.4.3 Tuyển chọn dòng vi khuẩn 2-22 5222E2E22E22E22E2E2322E223223223222e22e2xe2 32

3.3.5 Dinh 0i:i028ii:0 0 Ỏa2£+^ L 22

3.3.6 Phương pháp xử ly và phân tích số liệu -2-2¿©222++22++2z+zzz+zzsze2 22CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 52552 +E£2E22E£2EEEE2EEErEerrerree 23

4.1 Kết quả phân lập và làm thuần các dòng vi khuẩn 2-22 ©2222zz22z+2z+2+2 23

4.2 Kết quả khảo sát đặc điểm sinh học của các dong vi sinh vật - 5-52 25

4.2.1 Kết quả thử nghiệm sinh học của các dong vi sinh vật -2 5 - 254.2.2 Kết quả thử nghiệm khả năng lên men đường của các dong vi khuan 574.3 Kết quả xác định khả năng cố đỉnh đạm và tông hợp IAA của các dòng vi khuan284.3.1 Kết quả xác định khả năng có định đạm -2- 22522 2S+2E+2E+2E+2Ez2Ezzz>ze2 284.3.2 Kết quả xác định khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn có định đạm 304.4 Kết quả dinh danh các dòng vi khuẩn tuyên chọn -2- 22 52 s22s+2z2S2zz2ze2 32CHƯƠNG 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ 2: 2+2s22E22E22E222127122112212222 xe 335.1 Kết luận 2-52-2222 2221E2121212712112111211211111121111111111211211121121211211211 22 re 330? ngg,31 33TÀI LIEU THAM KHÁO 2 + Ss2S12E2EE£EE2E21EE121211121121112111111211 111111 ce, 34

TT ng eertnrtrctrirttrtatririoBiirrinlirttrtifvtodtiinsirgindfineiripirfininknindtriifartredrr 38

VI

DANH SACH CHU VIET TAT

: Môi trường Burk's Agar

: Cộng tác viên : Ethylenediaminetetraacetic acid : Indole-3-acetic acid

: Môi trường Nutrient Broth

: National Center for Biotechnology Information : Môi trường Nitrogen-Fixing borth

: Optical density : ribosomal RNA gene

: Môi trường Simmon Citrate Agar

: Sinh học phan tử

: Số thứ tự

: Phần trăm hiệu suất biến thiên

Vill

DANH SÁCH BANG

Trang

Bảng 2.1 Su đa dang của vi khuẩn nội sinh thực vật 2 2 2+2s+zzz££zzEzzzzzxzzee 8Bang 3.1 Các bước tiễn hành dựng đường chuẩn NH¡” -©225225552 20Bang 3.2 Nong độ dung dịch chuẩn TA A -2-©2222222222E222E22E22EE22E222E22Ez22zzzev 21Bang 4.1 Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy trên môi

a 24

Bang 4.2 Kết qua khảo sát đặc điểm sinh hóa của 15 dong vi khuẩn - 35Bang 4.3 Khảo sát khả năng lên men 15 dong vi khuẩn 22©52 5525525525522 27Bang 4.4 Hàm lượng NH¡” theo dõi qua các ngày nuôi cấy của 15 dòng vi khuẩn 29Bang 4.5 Hàm lượng NH¿' theo dõi sau 8 ngày nuôi cấy của 4 dong vi khuẩn 30Bang 4.6 Hàm lượng IAA theo dõi sau 8 ngày nuôi cấy của 4 dòng vi khuẩn 31Bảng 4.7 Kết qua định danh tên loài 4 dòng vi khuẩn 2-22 55222zz22z22zz222 32

1x

Kha năng biến dưỡng citrate của 15 dong vi khuẩn 2-52: 26

Thử nghiệm catalase của 4 dòng vi khuẩn -22©2252222z22z+2zz2zzzex 2]Khả năng lên men đường của 15 dong vi khuẩn -22©52552£- 28

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam là nước nhiệt đới và là một trong những xứ sở của chuối, từ Bắc đếnNam, đồng bằng cũng như miền núi, ở đâu và mùa nào cũng có chuối Xuất khẩu chuối

của Việt Nam năm 2021 đạt 260 triệu USD, trong 3 quý của năm 2022, xuất khẩu chuối

sang Trung Quốc tăng mạnh, đã đưa Việt Nam vượt qua Philippines trở thành nước xuất

khẩu chuối lớn nhất vào thị trường Trung Quốc Theo thống kê Bộ Nông nghiệp và Pháttriển nông thôn năm 2022 cả nước hiện có hơn 130.000 ha trồng chuối, với sản lượng2,1 triệu tắn/năm, trong đó Đồng bằng sông Cửu Long là 35.278,9 ha, với sản lượng478.877,3 tan chuối (2022) Gan đây các tinh Cà Mau, Gia Lai, Nghệ An, Sóc Trăng,Nam Định, Phú Thọ đã có những bước cải thiện trong việc trồng và phát triển cây chuốitiến tới xuất khẩu sản phẩm chuối Nhiều dia phương chọn chuối làm cây chủ lực đượcxuất khâu với số lượng lớn đem lại lợi nhuận kinh tế cao Trong khi tình hình trồngchuối xuất khẩu lạm dụng phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật dé tăng năng suấttiêu tốn nhiều tiền bạc và gây hại nhiều đến môi trường đất, nguồn nước, còn ảnh hưởngtới con người và các sinh vật sống trong môi trường Việc ứng dụng những thành tựucông nghệ sinh học vào nghiên cứu sự tương tác có lợi giữa vi sinh vật nội sinh tiết rakích thích tăng trưởng va khả năng cố định đạm giúp cây tăng kích thước và số lượng

rễ hap thụ tốt chất dinh dưỡng, đồng thời tăng sản lượng chuối

Trên thế giới vi sinh vật nội sinh được tìm thấy nhiều cây trồng, nhiều nghiên

cứu từ thế kỷ 19 và thu nhiều kết quả ý nghĩ, ứng dụng hiệu quả trong nền nông nghiệp,

tăng năng suất cây trồng Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu tiềm năng và ứng dụng của cácloài vi khuẩn nội sinh này vẫn còn ít Hiện nay, việc nghiên cứu các loài vi khuẩn nội

sinh tăng năng suất và chất lượng được nhiều sự quan tâm Nhằm thay thế cho phân hóa

học và tránh gây ô nhiễm môi trường, tiết kiệm chi phí sản xuất, việc sử dụng các loạiphân bón sinh học có chứa giống vi sinh vật có khả năng cố định đạm trong môi trường

biến đồi thành đạm vô cơ cây hấp thụ được, tiết chất kích thích sinh trưởng IAA

(Indole-3-acetic acid) thuộc nhóm chất Auxin không thé thiếu cho cây trồng phát triển mạnh

Từ thực tiễn trên, đề tài “Phan lập các dòng vi khuẩn nội sinh có khả tổng hopIAA và có định đạm trên cây chuối ở Gia Lai” được thực hiện ra

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập được một số dòng vi khuẩn nội sinh trên cây chuối có kha năng tônghợp IAA và có định đạm tốt, dé tạo tiền đề nhằm sản xuất phân bón sinh học vi sinhtăng năng suất trồng trọt, giảm chỉ phí sản xuất và nguy cơ ô nhiễm môi trường cải thiệncuộc sống cho người nông dân cũng như góp phần phát triển nền kinh tế đất nước

1.3 Nội dung thực hiện

Thu thập mẫu và phân lập dòng vi khuẩn nội sinh trên cây chuối Gia Lai

Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA và có định đạm tốt

Định danh các dòng vi khuẩn nội sinh đã tuyển chon

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Sơ lược về cây chuối

Trong nghiên cứu của John M Macharia và ctv (2022) chuối được phân loại

một cách khoa học theo giới, lớp, bộ, họ, chi như sau:

là loại cây trồng nằm trong top 10 về an ninh lương thực (Rouard và ctv, 2022)

Hiện nay, Việt Nam đã khang định vị thé là một trong những quốc gia sản xuấtchuối lớn và nỗi tiếng trên thé giới, với nhiều vùng trồng chuối nỗi bật từ Bắc vào Nam.Chuối chiếm 19% tổng diện tích cây ăn trái của Việt Nam hàng năm, có khoảng 155nghìn hecta trồng chuối với sản lượng gần 2,5 triệu tan/nam Theo số liệu thông kê củaTổng cục Hải quan, xuất khẩu chuối mang về 41,1 triệu USD trong tháng 12/2023 tăng31,6% so với cùng kỳ Tinh chung cả năm 2023, Việt Nam xuất khâu gần 308 triệuUSD, tăng 1,3% so với cùng kỳ Mặt hàng này chiếm 7,6% trong tổng kim ngạch xuất

khâu các loại quả của Việt Nam năm 2023, chỉ xêp sau sâu riêng và thanh long.

Các vùng trồng chuối nổi bật ở Việt Nam bao gồm Đồng bang sông Cửu Long,

Tây Nguyên và Nam Bộ Trong đó, Đồng bằng sông Cửu Long là vùng trồng chuối lớnnhất, với diện tích trên 35.000 hecta và sản lượng đạt khoảng 478.000 tấn vào năm 2022.Các tỉnh như Tiền Giang, Bến Tre và Cần Thơ là các trung tâm sản xuất chuối lớn tạivùng này Ở Tây Nguyên, các tỉnh như Gia Lai, Đắk Lắk và Đắk Nông cũng đóng gópmột phan quan trọng vào sản lượng chuối của đất nước Với điều kiện địa lý và khí hậuphù hợp, cùng với việc ứng dụng các công nghệ canh tác hiện đại, sản xuất chuối ở cácvùng này đang phát triển mạnh mẽ Ở Nam Bộ tỉnh Đồng Nai đang đứng đầu về diệntích trồng chuối, chiếm tỷ lệ trên 8% diện tích toàn quốc và trên 70% vùng Đông Nam

bộ (2023) đóng vai trò quan trọng trong nguồn cung chuối của cả nước Điều này chothấy sự quan trọng và tiềm năng phát triển của ngành công nghiệp chuối trong nền kinh

tế nông nghiệp của Việt Nam

2.2 Đặc điểm sinh học của cây chuôi

2.2.1 Cau tao và đặc diém của cay chuôi

Theo nghiên cứu của Nguyễn Bảo Vệ và Lê Thanh Phong (2004) mô tả như sau:Trong quá trình phát triển từ hạt rễ sơ cấp cây thường chết sớm thay thế bởi rễhữu hiệu, vòng đời cây chuối có khoảng 600 — 800 rễ cái hữu hiệu Rễ cái mọc nhiều ởphan trên của củ chuối mọc đâm thang xuống lòng đất Mỗi ngày rễ cái có thé vươn dai2—4 cm, đạt độ dài đôi khi đến 1,2 m Rễ nhánh ngang có nhiều dé hút dinh dưỡng vànước từ đất nên gọi là rễ dinh dưỡng

Củ chuối là thân that của cây chuối nằm dưới mặt dat, phát triển chiều ngang cóthê đến 30 cm Phần bên ngoài xung quanh củ chuối được bao phủ bởi những vết sẹo từ

bẹ lá Củ chuối sống lâu năm, là cơ quan chủ yếu dự trữ chất dinh dưỡng đồng thời cũng

là nơi dé rễ, lá, mam và cuống hoa mọc ra Ngoài ra xung quanh củ chuối có nhiều mamngủ, sau này phát triển thành cây con

Lá mọc từ thân thật, bẹ lá mọc thang hướng lên trên mat đất tạo thành thân giảchiều dai lên đến 6 — 7 m tùy giống chuối Thân giả có hình trụ, do nhiều be lá lồng vàonhau tạo thành Bẹ lá hình lưỡi liềm, giữa phình to, mỏng đần ra hai bên Đỉnh bị hẹpdan va day tạo thành cuống lá, các bó sợi xếp chặt nhưng vẫn còn các lỗ thông khí Phiến

lá rộng, mọc đối xứng nhau, lá hình elip kéo đài, phiến lá dày xấp xi 1 mm, có các gân

phụ song song nhau và thăng góc gân chính

2.2.2 Phan bo tại Việt Nam

Cây chuối được trồng rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và ôn đới ẩm ướt trên khắpViệt Nam, từ Bắc vào Nam Miền Trung và Nam Bộ là hai trong số các vùng trồng chuốichủ yếu tại Việt Nam Các tỉnh như Bến Tre, Tiền Giang và Đồng Nai là các trung tâmsản xuất chuối lớn ở miền Nam, cung cấp cho thị trường nội địa và xuất khâu Ngoài ra,vùng đồng bằng sông Cửu Long, bao gồm các tỉnh An Giang, Vĩnh Long và Cần Thơ,cũng là các vùng trồng chuối quan trọng, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong và ngoài nước

Ở miền Bắc, một số tỉnh như Lào Cai, Hà Giang và Cao Bằng đang mở rộng điện tíchtrồng cây chuối nhằm đáp ứng yêu cầu xuất khẩu, nâng cao giá trị trên đất canh tác

Vùng Tây Nguyên, bao gồm các tỉnh như Gia Lai, Kon Tum và Đắk Lắk, cũng có diện

tích trồng chuối nhất định

2.2.3 Thé nhưỡng của cây chuối

Dé cây chuối phát triển mạnh mẽ và cho ra quả tốt, cây cần một loạt các chấtdinh dưỡng, bao gồm nguyên tố đa lượng: kali, nitơ, phospho, canxi, magie và cácnguyên tố vi lượng khác: bo, mangan Cây chuối phát triển được trên nhiều loại đất, đặcbiệt là ở các loại đất phù sa, đốc tụ Nhưng dé có năng suất cao, chất lượng tốt, chuốicần trồng ở những loại đất có tầng dày, đủ dinh dưỡng và đảm bảo đủ nước Thích hợpvới đất phù sa ven sông, suối, đất rừng mới khai phá nhiều mùn, thoát nước và giữ ẩmtốt Trong quá trình trồng và chăm sóc, các chất dinh dưỡng cần thiết là rất quan trọng

đề duy trì và nâng cao hiệu suât sản xuât của cây chuôi.

2.3 Một số giống chuối phố biến ở Việt Nam

Theo Nguyễn Bảo Vệ và Lê Thanh Phong năm 2004 có nêu ra các nhóm giốngchuối phô biến trồng ở Việt Nam

Nhóm chuối gia:

Chuối già (tiêu) hương: trái hơi cong và còn xanh khi chín, đầu trái lõm vào rõ

rệt Quay chuối có ít lông hay trung bình, hình lăng trụ, cuống quầy không có mo khô

vì rụng hết

Chuối già (tiêu) cui: trái hơi cong và còn xanh khi chín, đầu trái bằng phẳng hay

hơi lõm vào Quay chuối có ít lông hay trung bình, quay hơi có hình nón cut vì có mộtnải mọc ra xa Mo khô không rụng hết ở quầy nhưng còn lại ít hơn già lùn Vòi noãn

khô còn sót ở trái.

Chuối già lùn: trái cong và vỏ còn xanh khi chín, chóp trái hình cô chai ngắn,

đầu trái bằng phẳng Quay chuối ít lông, dạng hình nón cụt

Nhóm chuối Cau:

Chuôi cau man: trái tròn nhưng phang, có vỏ láng bóng và màu vàng khi chín,

trái rất nhỏ và ngắn Quay ít lông hay trung bình

Chuối cau quảng: giống như cau mắn nhưng trái dài và lớn hơn

Chuối cau tây (bom): giống như cau mắn nhưng lớn hơn cả cau quảng

Nhóm chuối xiêm:

Chuối ngự (long): trái có cạnh to, trái thăng và lớn, đầu trái chuối hơi lồi Quaychuối không lông, vòi noãn khô còn sót nhiều ở trái

Chuối xiêm đen: trái ít cạnh, đầu trái lồi, kích thước trung bình Vỏ trái chín có

đốm mốc Quay chuối không lông, vòi noãn khô rụng gần hết

Chuối xiêm trang: trái it cạnh, đâu trái lôi, trái dài hơn và lớn hon Xiém Den.

Vỏ trái chín không đồm móc Quay chuối không lông, vòi noãn khô rụng gần hết

Ngoài ra còn nhiều giống chuối khác tùy theo từng địa phương mà có những têngọi khác nhau nhưng có đặc điểm cau tạo cũng như giá trị dinh dưỡng là giống nhau.2.4 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh thực vật

2.4.1 Định nghĩa

Vi khuẩn nội sinh thực vật (Endophytic bacteria) là vi khuẩn cư trú bên trongcây theo nghĩa đen ("endon" = bên trong; "phyton" = cây) Ké từ năm 1904 sự phát hiệncác vi sinh vật nội sinh, các nhà nghiên cứu đã định nghĩa vi sinh vật nội sinh theo nhiều

cách khác, tuỳ thuộc phương pháp phân lập và đánh giá vi sinh vật nội sinh Theo

Hallmamn và ctv (1997) mô tả vi khuẩn nội sinh là những sinh vật có thể phân lập được

từ các bộ phận đã khử trùng bề mặt của cây hoặc được chiết xuất từ các nội mô thực vật

6

và không gây thiệt hại cho cây chủ Vào năm 2000, Bacon và White đã đưa ra một định

nghĩa "Vi khuẩn nội sinh thực vật là những vi khuẩn xâm chiếm các mô sống va cư trú

ở bên trong thực vật mà không gây ra bat kỳ tác động tiêu cực tức thời rõ ràng nao”,định nghĩa này về vi khuẩn nội sinh thực vật được chấp nhận rộng rãi

2.4.2 Nguồn gốc vi khuẩn nội sinh thực vật

Vi khuẩn nội sinh thực vật hiện điện phô biến trong hầu hết tat ca các loài thựcvật, chúng sống tiềm ân hoặc tích cực xâm chiếm nội mô thực vật một cách cục bộ hoặc

có hệ thống (Hallmamn và ctv, 1997) Vi khuẩn nội sinh bắt nguồn từ các vi khuẩn biểusinh vùng rễ và lá, hoặc từ hạt hoặc các vật liệu nhân giống vô tính Nhiều nghiên cứuchỉ ra rằng vùng rễ là nguồn vi khuẩn nội sinh chính, từ đó chúng xâm chiếm vào bêntrong mô tế bào thực vật (Verma và ctv, 2001, Bressan và Borges, 2004) Do đó, vikhuẩn nội sinh thường xuất hiện ở vùng rễ với mật độ cao ngay từ những giai đoạn đầu

của sự xâm nhập (Melnroy va Kloepper, 1995).

Vi khuẩn nội sinh xâm chiếm tế bào nội mô thực vật từ các vị trí như bề mặt rễ,

lông hút, chop rễ và điểm phát sinh rễ bên (Verma va ctv, 2001) Ngoài ra, vi khuẩn

cũng có thé xâm nhập thông qua các khe hở tự nhiên như: khí không và thủy không

Hơn nữa, chúng có thé di chuyên một cách hệ thông bên trong cây có thé dẫn đến tìnhtrang cân bang mật độ vi khuẩn bên trong cây Ngược lại, vùng rễ dường như tao ra mộtmôi trường sống ôn định nơi mà nhiệt độ và hàm lượng nước én định cho vi khuẩn cưtrú tốt (McInroy và Kloepper, 1995) Khi vi khuan xâm nhập được vào bên trong thựcvật sẽ cư trú thành các 6 nội sinh Các 6 nội sinh này sẽ bảo vệ vi khuẩn nội sinh xâmnhập vào các khoảng gian bào và tránh các tác động xấu từ môi trường, đồng thời giúpchúng thiết lập bên trong tế bào, mô thực vật (Oliveira và ctv, 2013)

2.4.3 Da dang vi sinh vật nội sinh thực vật

Vi khuẩn nội sinh thực vật rat đa dạng, chúng được phân lập từ cả thực vật một

lá mầm và hai lá mầm, từ các loài thân gỗ (keo, điều, lê), thân bụi (cà phê, đậu phộng),thân leo (hồ tiêu, chanh dây) đến các thực vật thân thảo (lúa, ngô, cỏ voi) Nhiều tác giả

đã tổng hợp sự đa dạng của vị khuẩn nội sinh thực vật như: Hallmann và ctv (1997),

Lodewyckx va ctv (2002), Rosenblueth và Martinez-Romero (2006), Ryan và ctv

(2008) Bang tóm tắt của Miliute va ctv (2015) về các chủng vi khuan nội sinh phan bốrộng và phô biến nhất trong nhiều loại cây trồng nông nghiệp

7

Bảng tổng hợp các loại thực vật khác nhau có thé có thành phan vi khuẩn nội

sinh tương tự nhau va một loài vi khuẩn có thể nội sinh nhiều loài thực vật khác nhau

(Đỗ Thị Kiều An, 2019) Theo tông kết của nhiều nghiên cứu các chi vi khuẩn nội sinhPseudomonas, Bacillus, Enterobacter va Agrobacterium là phô bién nhất, phân lập được

từ nội mô các cây khoẻ (Hallmamn và ctv, 1997; Miliute và ctv, 2015).

Bảng 2.1 Sự đa dạng của vi khuẩn nội sinh thực vật

Vi khuẩn nội sinh Thực vật

Azorhizobium caulinodans Lúa

Azospirillum brasilense Chuối

Azospirillum amazonense Chuối, đứa

Bradyrhizobium japonicum Lúa

Gluconacetobacter diazotrophicus Mia, ca phê, lúa, dứa, khoai lang Methylobacterium mesophilicum Cây có múi

Rhizobium leguminosarum Lúa

Rhizobium (Agrobacterium) radiobacter Cà rốt, lúa

Sinorhizobium meliloti Khoai lang

Azoarcus sp Co kallar, lua

Burkholderia pickettii Ngô

Burkholderia sp Chuối, dứa, lúa

Chromobacterium violaceuma Lúa

Herbaspirillum seropedicae Mia, lua, chuối, ngô, lúa miễn

Herbaspirillum rubrisulbalbicans Mia

Citrobacter sp Chuối

Enterobacter spp Ngô

Enterobacter sakazakii Dau nanh

Enterobacter cloacaea Cây có múi, ngô, cà phê voi

Enterobacter agglomeransa Dau nanh

Bảng 2.1.(tt) Sự đa dạng của vi khuẩn nội sinh thực vật

Vi khuẩn nội sinh Thực vật

Bacillus thuringiensis, B licheniformis, B subtilis

B brevis, B megaterium, B mycoides

Bacillus spp.

Bacillus megaterium

Sphingobacterium sp.

Xà lách, ca phê chè Lúa mì, khoai lang, ngô

Cà phê chè, chuối

Cà phê chè, chuối, Dứa

Cà phê chè Cây có múi

Cây có múi, ngô, cà rốt

Lúa

Da dạng vi khuẩn nội sinh bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, lượng mưa, kỹ thuật canh

tác và các chất cải tạo đất (Hallmann và ctv, 1999; Berg và Hallmann, 2006) Ngoài ra,

mật độ vi khuẩn nội sinh còn bị giảm khi môi trường bị ô nhiễm, đất đai bị khai thác

quá mức và lạm dụng phân hóa học (Mekete và ctv, 2009) Các loại mô thực vật ở các

9

thời điểm mà vi khuẩn nội sinh được phân lập khác nhau và kết quả cũng khác nhau về

mật độ vi khuẩn nội sinh (Miguel và ctv, 2013) Nhiều nghiên cứu cho thấy rang quanthé vi khuẩn nội sinh mặc dù vi khuẩn nội sinh xâm nhập toàn bộ cây, nhưng rễ thường

là nơi tập trung nhiều loài nhất

Mật độ vi khuẩn nội sinh trong cây tùy thuộc vào loài thực vật, bộ phận cây,giai đoạn sinh trưởng và điều kiện môi trường Nhìn chung, mật độ vi khuẩn nội sinhthường cao nhất ở mô rễ và dao động ở khoảng 10°— 10° CFU/g (McInroy và Kloepper,1995) Mật độ ở các bộ phận khác có vi khuẩn nội sinh thấp hơn

2.4.4 Sự xâm nhập vi khuẩn nội sinh

Nhiều nghiên cứu cho thấy các chủng vi khuẩn nội sinh được phân lập từ loài

thực vật này có thể được chủng thành công vào bên trong loại thực vật khác mà vẫn phát

huy các đặc tính thúc đây sinh trưởng thực vật của chúng Quá trình xâm nhiễm nội môtối ưu đạt được khi lượng tế bào chủng nhiễm ban dau là 10° — 10 CFU/cây (Puri

va ctv, 2015).

Việc nghiên cứu chủng nhiễm vi khuẩn nội sinh vào thực vật đã đưa đến một sốkết luận sau: (i) chỉ cần một vài tế bao cũng đủ dé vi khuẩn nội sinh xâm nhập được vàobên trong cây; (ii) chủng có khả năng xâm nhiễm tốt có thé xâm chiếm nội mô của nhiềuloài thực vật khác nhau; (iii) các chủng liên quan gần có thé khác biệt rat lớn về kha

năng xâm nhập vào bên trong mô thực vật (Dong và ctv, 2003).

2.5 Khả năng có định đạm của vi khuẩn nội sinh

Nito chiếm tới 78% thé tích không khí va là yếu tố dinh dưỡng hạn chế nhất cho

sự phát triển của thực vật Chúng tồn tại dưới dạng khí Na, thực vật không có khả năng

đồng hóa trực tiếp Các vi sinh vật có định đạm có khả năng hap thu đạm (N: trong

không khí) và biến đổi đạm từ dạng cây trồng không hấp thụ được (N2) thành dạng dam

mà cây trồng có thể hấp thụ được

Các vi khuẩn nội sinh này có vai trò hết sức quan trọng trong sự ôn định chutrình dinh dưỡng nitơ, bổ sung nguồn đạm cho đất và dinh dưỡng cây, cải thiện năngsuất mùa vụ, phát triển bền vững hệ sinh thái (Nguyễn Hữu Hiệp, 2007) Hằng năm các

vi khuẩn cô định đạm đã có định được khoảng 160 — 170 triệu tấn nitơ khí quyền vàchuyền hóa thành nguồn phân đạm dưới các dạng khác nhau (Cao Ngọc Điệp, 2010)

10

Nhờ đó, cây trồng có thé sử dụng nguồn đạm vô han trong không khí từ các vi sinh vật

có định đạm

Nhiều nghiên cứu cho thấy có các vi khuan nội sinh giữ vai trò quan trọng trongcanh tác nhiều loại cây trồng như lúa, mía, lúa mì và giúp giảm lượng phân đạm bónđồng ruộng Trong thí nghiệm của Yanni va ctv (1997) việc bổ sung Rhizobium cho cây

lúa đã tiết kiệm được 96 kg N/ha, đáp ứng 2/3 lượng phân bón cần thiết cho lúa và bón

bổ sung Burkholderia vietnamiensis vào cây lúa đã giúp tiết kiệm được 25 - 30 kg phândam/ha (Tran va ctv, 2000) Lượng dam sinh học tông hợp bởi các chủng vi khuẩn nộisinh đã đáp ứng được một phần nhu cầu đạm của cây trồng

Một số vi khuẩn nội sinh cô định đạm đã được phân lập từ cây này và có thể

được cung cấp để cố định đạm được cho cây khác (Gyaneshwar vả ctv, 2002) Nhiều

chủng vi khuẩn nội sinh có phô ký chủ rộng như Herbaspirillum seropedicae đã đượcphân lập từ nhiều loại cây trồng như cây ngô, lúa miễn, mía và các loài họ hòa thảo khác(Baldani và ctv, 1986) Điều này cho thay vi khuẩn nội sinh phân lập từ một loài cây cóthé nội sinh được trong nhiều loài cây khác, thậm chí nhóm cây nay không cùng chi,

Các vi khuẩn nội sinh cô định dam được nghiên cứu nhiều gồm các chủng thuộc

chi Azoarcus, Burkholderia, Gluconobacter, Herbaspirillum va Klebsiella trong đó các

chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng có định đạm tốt được cho là Acetobacter

diazotrophicus, Herbaspirillum sp., và Azoarcus sp (Sturz va ctv, 2000).

lãi

2.6 Khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) của vi khuẩn nội sinh

Indole-3-acetic acid (IAA) là một dang auxin, là chất điều hòa sinh trưởng củathực vật IAA chi phối sự phân chia tế bao, sự giãn dài tế bao, phân hóa sinh mô, phát

triển trái và hat, chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng [AA kích thích đồng

thời sự giãn dài trục lá mam, ngăn can sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự khởi

đầu của rễ bên và sự thành lập lông rễ (Theologies và Ray, 1982)

Rất nhiều vi khuẩn nội sinh thuộc các chi Azospirillum, Bacillus, Burkholderia,

Enterobacteria, Gluconacetobacter, Staphylococcus và Pseudomonas là những vi

khuẩn cố định đạm nhưng nhờ vào kha năng sinh tổng hop IAA của chúng nên cũngđược xem là vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật, góp phần làm tăng năng suất câytrồng (Kloepper vả ctv, 1989)

Hầu như các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng cé định đạm đều thé hiện khanăng tong hợp IAA Tuy nhiên, hàm lượng IAA sinh tổng hợp được phụ thuộc vào từngdòng vi khuẩn, từng loài thực vật chủ, điều kiện nuôi cấy như pH, nồng độ oxy và giaiđoạn phát triển Như trong nghiên cứu của Văn Thị Phương Như (2015) đã phân lậpđược 457 dòng vi khuan nội sinh cây lúa vừa có khả năng có định đạm và hòa tan lânkhó tan vừa có khả năng sinh tổng hợp IAA

2.7 Tình hình nghiên cứu gần đây

2.7.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Các dòng vị khuẩn nội sinh thực vật đã được nghiên cứu từ rất lâu và Việt Namtrong thời gian gần đây cũng đạt được thành tựu nhất định Cao Ngọc Điệp và NguyễnThành Dũng (2010) bằng kỹ thuật PCR 16S-rRNA đã xác định được 85 trên tổng số 103

dong vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây khóm trồng ở huyện Vinh Thuận, tỉnh Kiên

Giang, có 38 dong vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tong hợpIAA tốt Trần Đình Minh và Nguyễn Thị Huyền (2024) phân lập vi khuẩn nội sinh câychuối Cavendish được trồng ở tỉnh Dak Lak, Việt Nam đặc biệt chi chính thuộcSphingobium và nhiều chi khác được cho rằng có khả năng sinh tổng hợp IAA và cố

định đạm trong các nghiên cứu khác.

Vi khuẩn nội sinh trên cây chuối cũng đạt được kết quả khá khả quan Nghiêncứu của Nguyễn Hữu Hiệp và ctv (2013) đã phân lập được 43 dòng vi khuẩn nội sinh

trên cây chuôi già va chuôi xiêm được thu tai Bên Tre, Trà Vinh, Vinh Long và Hậu

12

Giang, trong đó, có hai dòng Achromobacter sp và Pseudomonas aeruginosa có khả

năng cố định đạm và sinh tổng hợp IAA tốt

2.7.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trên cây khóm và chuối đã phân lập được các chung vi khuẩn nội sinh có đặc

tính tương tự Azospirillum amazonense, Azospirillum lipoferum, Burkholderia,

Herbaspirillum Trong đó Azospirillum brasilense va hai nhóm thuộc loài

Herbaspirillum được tìm thay ở cây chuối (O.B Weber và ctv, 1999) Ở Kenya, các nhànghiên cứu đã phân lập và xác định vi khuẩn nội sinh cây chuối có tiềm năng làm phânbón sinh học dé sản xuất chuối bền vững, trong nghiên cứu tìm được 43 dòng vi khuẩn

được xác định thuộc chi Serratia, Pseudomonas, Rahnella, Enterobacter, Raoultella,

Yokenella có khả năng thúc đây tăng trưởng thực vật, khả năng cô định đạm va hoa tanlân tốt Ngamau và ctv (2012) Nghiên cứu da dang vi khuẩn nội sinh ở rễ chuối (Souza

và ctv, 2013) phân lập được 201 v1 khuẩn nội sinh thuộc 10 chi khác nhau, phần lớn

thuộc chi Bacillus, được xác định có khả năng thúc đây tăng trưởng, hòa tan lân, kiểmsoát sinh học và có định dam trong cây chuối Jimtha va ctv (2014) phân lập vi khuẩn

nội sinh từ nuôi cấy huyền phù chuối được xác định là Bacillus sp và Ralstonia sp được

phát hiện có khả năng hòa tan lân, cô định đạm và tổng hop JAA Karthik va ctv (2017)

đã phân lập được 352 vi khuan nội sinh trên cây chuối trồng ở Tamil Nadu, miền Nam

Ấn Độ Rahayu và ctv (2023) đã phân lập 3 chủng vi khuẩn nội sinh (K10, K324 vàK111) từ cây Musa balbisiana dé cải thiện sự phát triển và năng suất của cây lúa den,cũng có các đặc điểm tiềm năng sinh tổng hợp IAA và có định đạm

13

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 12 năm 2022 đến tháng 12 năm 2023

Đề tài được tiễn hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ lên men, phòng thinghiệm Nam ăn va Nắm dược liệu — Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môitrường, Trường Dai học Nông Lâm Thành Phó Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Mẫu thí nghiệm

Mẫu đất và rễ cây chuối già được thu thập ở Nông trường chuối Đăk Ram thuộc

xã Đăk Yă, huyện Mang Yang, tỉnh Gia Lai.

3.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm

Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: Tủ cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng, tủ lạnh, cânphân tích, kính hiền vi, lò vi sóng, và các dụng cụ phòng thí nghiệm như dia petri, ốngđong, pippet các loại, ống nghiệm, giá dé ống nghiệm, đèn cồn, que cấy trang, que cay

Lugol, Bromothymol Blue, Kovac, v.v.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Thu thập mẫu và phân lập dòng vi khuẩn nội sinh

3.3.1.1 Chuẩn bị mẫu

Mẫu rễ chuối được thu thập độ sâu khoảng 20 — 30 cm, độ rộng khoảng 30 cm

Rễ có thể được lấy từ vị trí thân chính và đào dần ra ngoài đến chóp tận cùng của rễ,

ưu tiên chọn những rễ mới phát triển, rễ còn non và có màu trắng, có nhiều rễ phụ Cácmẫu rễ cây chuối sau khi thu thập được rửa dưới vòi nước để làm sạch đất, loại bỏ rễcon, cắt thành các đoạn 5 — 7 cm, rửa mẫu rễ này dưới vòi nước chảy trong 5 phút Tiếptheo ngâm trong nước rửa chén pha loãng 5 phút, rửa mẫu thật sạch rồi để khô Khử

14

mẫu bề mặt bằng cồn 70° trong 2 phút, xong ngâm trong Natri hypoclorit 8%, thêm vài

giọt Tween 20 trong 5 phút Rửa lại mẫu 6 lần với nước cất vô trùng, làm khô bằngkhăn giấy vô trùng Kiểm tra vi khuẩn còn sót trên bề mặt mẫu bằng cách lay 50 uLnước rửa mau lần cuối cấy trang trên môi trường PDA (khoai tây 200 g/L, dextrose 20g/L, agar 20 g/L và pH 6.5), sau 24 giờ ủ ở 30°C không thấy xuất hiện vi khuẩn pháttriển chứng tỏ mẫu rễ đạt yêu cầu Sau đó dùng cối nghiền mau rễ cho vi khuẩn thoát

ra ngoài, ép lay dich mẫu Dùng micropipet hút lay phần dịch huyền phù cho vào ốngnhiệm và dé lắng trong (Nguyễn Thi Huynh Như và ctv, 2013)

Đất tang mặt được thu thập ở độ sâu 20 — 30 em sát vùng bộ rễ cây chuỗi nơi vikhuân tiếp xúc với rễ có khả năng di chuyển vào vùng rễ thành vi khuẩn nội sinh thựcvật Thu mẫu theo hình chữ nhật, 5 mẫu đất cho diện tích 500 m? trộn thành 1 mẫu đạidiện Bao quản trong bịch nilon bit kin đưa đến phòng thí nghiệm (Thi Thanh Thang va

Trần Đức Long, 2022)

Mẫu được thu thập khi cây chuối trong giai đoạn trưởng thành 3 - 5 tháng, khi

đó hệ rễ đã phát triển hoàn thiện và khả năng hấp thụ dinh dưỡng mạnh mẽ Quy trình

lay mẫu sẽ được thực hiện ba lần, cách nhau khoảng 1 - 2 tháng, nhằm mục đích theodõi sự thay đối đa dạng hệ vi sinh vật theo thời gian Vùng địa lý lay mẫu được chon lànông trường chuối Đăk Ram, nằm tại xã Đăk Yă, huyện Mang Yang, tỉnh Gia Lai vàđược quản lý bởi tập đoàn Hoàng Anh Gia Lai Việc chọn vùng lấy mẫu này được dựatrên sự đại điện của khu vực này đối với cây chuối, cũng như sự đảm bảo về không sửdụng các chế phẩm vi sinh và dư lượng phân bón hóa học, từ đó đảm bảo tính đáng tincậy của mẫu thu thập.

3.3.1.2 Phân lập và làm thuần các dòng vi khuẩn

Phân lập mẫu rễ: hút 100 ul dịch huyền phù đã lắng trong mẫu rễ cho vào ông

nghiệm có chứa 10 ml môi trường NFb bán đặc đã khử trùng nhiệt ướt 121°C trong 20

phút Dùng hai bàn tay se mạnh ống nghiệm có chứa dịch mẫu Ủ mẫu ở 28 — 30°C sau

2 đến 3 ngày sẽ thấy vòng sáng (pellicle) gần bề mặt môi trường (cách bề mặt 2 — 4mm) Đó là dấu hiệu sự phát triển của vi khuẩn nội sinh Khi đó ho nóng kim cấy trênngọn lửa đèn cồn, dé nguội, cham đầu kim vào vòng pellicle sau đó cấy trên dia petri có

môi trường NFb (BAz) đặc đã khử trùng Ủ ở 28 — 30°C trong 48 — 72 giờ Quan sát

15

kích thước, hình dang và màu sắc khuẩn lạc, chọn những khuẩn lạc rời tiến hành caychuyền nhiều lần để làm thuần dòng vi khuẩn (Nguyễn Thị Huỳnh Như và ctv, 2013).

Phân lập mẫu đất: cân 10 g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa sẵn 90 ml

nước cất vô trùng, đồng nhất mẫu trong 30 phút ở tốc độ 120 vòng/phút, xong đề yên 3phút sau khi lắc Tiến hành pha loãng mẫu dat ở nồng độ 107! đến các nồng độ cần thiết.Hút 1 ml địch mẫu ban đầu vào ống nghiệm có chứa 9 ml dung dich pha loãng chuẩn bịsẵn thu được dịch huyền phù có nồng độ pha loãng 107 Cứ tiếp tục làm như vậy ta cócác độ pha loãng tiếp theo, pha loãng đến nồng độ cần thiết, thích hợp dé khuẩn lạc mọclên tách rời nhau ra Sau đó hút 100 ul ở các nồng độ pha loãng khác nhau cho vào đĩapetri đã có sẵn môi trường nuôi cấy NFb và BAz ở mỗi nồng độ lặp lai 3 lần Dùng quecấy trang trang đều dịch trên bề mặt thạch đến khi khô Dem ủ ở nhiệt độ 28 — 30°C, sau

48 — 72 giờ Quan sát kích thước, hình dang và mau sắc khuẩn lạc trên đĩa petri, tách vàlàm thuần các dòng vi khuẩn (Tran Đức Long và Thi Thanh Thang, 2022)

3.3.1.3 Quan sát khuẩn lạc và làm thuần các dòng vi khuẩn

Phương pháp làm thuần tùy theo cách phát triển của từng nhóm vi sinh vật trên

môi trường chuyên biệt mà khuẩn lạc có hình dang, dang bìa, độ nổi, màu sắc, kích

thước khác nhau Chọn các khuẩn lạc rời trên đĩa petri và dùng phương pháp cây chuyểnnhiều lần trên môi trường chuyên biệt cho đến khi khuẩn lạc tách rời ra, có bề mặt vamàu sắc đồng nhất thì chọn Loại bỏ những khuẩn lạc không đồng nhất Kiểm tra độthuần khiết của dòng vi khuẩn Quan sát dòng vi khuẩn dưới kính hiển vi nếu các tế bào

vi khuẩn được quan sát đồng nhất thì chứng tỏ dòng thuần

3.3.1.4 Bảo quản giống vi khuẩn

Giống thuần được cấy vào ống thạch nghiêng môi trường chọn lọc (TCVN6166:2002) sau 3 tháng cấy chuyền giữ giống

3.3.2 Quan sát hình thái tế bào và nhuộm Gram vi khuẩn

Nhằm xác định hình dạng, kích thước tế bào trên cơ sở sơ bộ phân chia cácnhóm vi khuẩn dé tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình định danh

Khuân lạc của nhiêu nhóm vi khuân có những đặc điềm gân giông nhau nên

không thể dùng phương pháp quan sát khuẩn lạc trên mặt thạch để phân loại chúng mà

16

phải quan sát hình thái và nhuộm Gram Mẫu vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường phân

lập được nhuộm Gram và quan sát hình thái ở 24 — 48 giờ sau cấy

Dựa vào khả năng lưu giữ phâm màu Crystal Violet trên thành tế bao vi khuẩn

Vi khuẩn Gram dương có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan, nhờ đó mà màu củaCrystal Violet được gắn chắc vao tế bào nên không bị khử bởi cồn, vì vậy van giữ đượcmàu tím Còn vi khuẩn Gram âm có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (it peptidoglycan), nhưnglại có mật độ lipid cao, khi rửa bằng cồn lớp chất béo này sẽ bị hòa tan kéo theo mauthuốc nhuộm ban dau, tế bao không màu lại bắt màu hồng đỏ của thuốc nhuộm Safranin.Nhu vậy, sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram âm có màu hồng, còn vi khuân Gram dương

có màu tím.

Phương pháp thực hiện: Làm tiêu bản bằng cách nhỏ một giọt nước cất vô trùnglên giữa lame kính Dùng que cấy khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn rồi lấy một ít sinhkhối vi khuẩn trải mỏng lên lame kính Dé khô tự nhiên hoặc ho nhanh mặt đưới củalame kính có mẫu trên ngọn lửa đèn cồn dé cố định vi khuẩn trên lame kính Nhuộmbằng 1 — 2 giọt Crystal Violet trong 1 phút, rửa sạch nhanh thuộc nhuộm bằng nước cat,dùng giấy thấm khô nước Nhuộm tiếp bằng 1 — 2 giọt dung dịch Lugol dé trong 1 phút,rửa với nước cất và dùng giấy thấm khô nước Rửa lại bằng cồn thật nhanh đề tây màu

cho đến khi không còn màu tím nữa thì ngưng, rửa sạch với nước cat, dùng giấy thắm

khô nước Cuối cùng nhuộm tiếp bằng 1 — 2 giọt Safranin và dé 1 phút, rửa lại bằngnước cất và dùng giấy thâm khô Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X và vật kính100X có sử dụng giọt dầu kính

3.3.3 Khảo sát một số đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn

trường bị đục bởi sinh khối chứng tỏ vi khuẩn không có khả năng di động, kết luận thử

Hydrogen peroxide (H202) thành H2O va O2 ngăn can sự tích tụ của phân tử có độc tính

cao trong tê bào.

Phương pháp tiến hành: thí nghiệm được tiến hành trên các dòng vi khuẩn đãphân lập trong điều kiện vô trùng, dùng que cấy lay một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuầnđặt lên lame kính sạch Nhỏ trực tiếp HaO2¿ 30% lên sinh khối vi sinh vật trên lame kính

Ghi nhận kết quả: thử nghiệm dương tính (+) khi có hiện tượng sủi bọt khí do

O2 tạo ra và ngược lại âm tính (-) khi không có sủi bọt khí.

3.3.3.3 Thử nghiệm khả năng lên men các loại đường

Nguyên tắc: vi khuẩn có khả năng lên men nhưng không phải có khả năng lênmen tat cả loại đường Sản pham của quá trình lên men có thé là các loại acid hữu co,rượu hay một sô hợp chất không có tính acid Xác định khả năng lên men đường bằngcách bé sung vào môi trường thuốc thử Phenol Red, acid tạo ra làm pH trong môi trườnggiảm sẽ làm cho Phenol Red chuyên từ màu đỏ thành màu vàng Nếu môi trường sau

khi lên men không tao acid thì Phenol Red giữ nguyên màu đỏ.

Phương pháp tiến hành: các đòng vi khuẩn phân lập được kiểm tra khả năng lênmen các loại đường dựa trên sự chuyên màu của thuốc thử Phenol Red Sau 24 giờ pháttriển sinh khối trong môi trường chuyên biệt 6 30°C, hút 1 ml dung dich vi khuẩn vàoống nghiệm chứa 9 ml dung dịch đường 2% (lactose, saccarose, glucose) đã được hap

khử trùng ở 121°C trong 15 phút, ủ ở 30°C.

Ghi nhận kết quả: sự chuyển màu thuốc thử Phenol Red được ghi nhận phản

ứng dương tính (+) và ngược lại là âm tính (-).

18