Nhóm 6 th chẩn Đoán bệnh thực vật

Vi khuẩn Pantoea stewartii Pantoea stewartii là một loại vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, được biết đến là tác nhân gây bệnh xơ đen Stewart's wilt trên cây ngô, nhưng cũng đã được g

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT

PGS.TS NGUYỄN BẢO QUỐC HỒ VĂN TIẾN 21126535

HUỲNH THỊ KIM TUYẾN 21126567TRỊNH THỊ HUYỀN TRÂM 21126545

TP Thủ Đức, 12/2024

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC HÌNH iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

BÀI 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Vi khuẩn Pantoea stewartii 1

1.1.1 Đặc điểm gây bệnh 1

1.2 Bệnh xơ đen trên cây mít 2

1.2.1 Biểu hiện bệnh 2

1.2.2 Các giai đoạn phát bệnh 2

1.3 Về cây mít 3

1.3.1 Đặc điểm sinh lý và sinh học của cây mít 3

1.3.2 Đặc điểm dinh dưỡng và giá trị kinh tế của cây mít 4

1.3.3 Phân bố cây mít tại Việt Nam hiện nay 4

BÀI 2: LY TRÍCH DNA VÀ ĐIỆN DI TỔNG SỐ 5

2.1 Giới thiệu 5

2.1.1 Ly trích DNA 5

2.1.2 Điện di DNA tổng số 5

2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 5

2.2.1 Vật liệu, hóa chất và trang thiết bị 5

2.2.2 Quy trình thực hiện ly trích DNA 5

2.2.3 Quy trình thực hiện điện di DNA tổng số 6

2.3 Kết quả 7

2.4 Thảo luận 7

BÀI 3: PCR VÙNG 16S rRNA VÀ ĐIỆN DI KIỂM TRA KẾT QUẢ 8

3.1 Giới thiệu 8

3.1.1 Phương pháp PCR 8

3.1.2 Phương pháp điện di 8

3.1.3 Mục đích thực hiện 8

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 8

3.2.1 Vật liệu, hóa chất và trang thiết bị 8

3.2.3 Quy trình thực hiện điện di kiểm tra kết quả PCR 9

3.3 Kết quả 10

3.4 Thảo luận 11

BÀI 4: XÁC ĐỊNH VI KHUẨN PANTEOA STEWARTII VỚI CẶP PRIMER TỪ PHÒNG CHẨN ĐOÁN BỆNH HỌC 12

4.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 12

4.2 Nội dung thực hiện 12

4.3 Vật liệu và phương pháp 12

4.4 Kết quả và thảo luận 15

BÀI 5: XÁC ĐỊNH VI KHUẨN PANTEOA STEWARTII VỚI CẶP PRIMER THAM KHẢO TỪ TÀI LIỆU KHOA HỌC 16

5.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 16

5.2 Nội dung thực hiện 16

5.3 Vật liệu và phương pháp 16

5.4 Kết quả và thảo luận 19

TÀI LIỆU THAM KHẢO 20

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Vi khuẩn dưới kính hiển vi.

Hình 1.2 Biểu hiện bệnh xơ đen trong quả mít.

Hình 2.1 Kết quả điện di DNA tổng số.

Hình 3.1 Kết quả điện di PCR vùng 16S rRNA.

Hình 3.2 Kết quả điện di PCR vùng 16S rRNA.

Hình 4.1 Kết quả điện di mẫu vi khuẩn Pantoea stewartii Hình 5.1 Kết quả điện di mẫu vi khuẩn Pantoea stewartii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR vùng 16S rRNA 9Bảng 4.1 Thành phần phản ứng PCR với cặp primer của phòng Lab 13Bảng 4.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp primer của phòng Lab 14Bảng 5.1 Thành phần phản ứng PCR với cặp primer tham khảo từ tài liệu khoa học 17Bảng 5.2 Chu trình phản ứng PCR với cặp primer tham khảo từ tài liệu khoa học 17

BÀI 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vi khuẩn Pantoea stewartii

Pantoea stewartii là một loại vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, được biết đến

là tác nhân gây bệnh xơ đen (Stewart's wilt) trên cây ngô, nhưng cũng đã được ghi nhậngây bệnh cho một số cây khác, bao gồm cây mít Đây là một vi khuẩn Gram âm, có hìnhthái dạng que ngắn, di động Các tế bào vi khuẩn có thể tập trung lại với nhau và cùng dichuyển nhờ lông, roi (Hình 1.1) Khuẩn lạc có màu vàng hoặc trắng và có khả năng sinh

ra enzym tiêu hóa tinh bột và protein Vi khuẩn này thường có kích thước khoảng 0,5-0,8micromet chiều rộng và 1-2 micromet chiều dài Ngoài ra, vi khuẩn này còn có khả năngtạo thành các biofilm trên các bề mặt thực vật, tạo điều kiện thuận lợi cho sự lây lan củabệnh

Hình TỔNG QUAN TÀI LIỆU.1 Vi khuẩn dưới kính hiển vi.

Pantoea stewartii phân bố rộng rãi trên các vùng có khí hậu ấm và ẩm, đặc biệt là ở

các khu vực trồng cây ngô, nhưng nó cũng có thể gây bệnh cho nhiều loại cây khác Trêncây mít, sự phân bố của vi khuẩn này có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như

độ ẩm cao, nhiệt độ ổn định và sự hiện diện của các tổn thương cơ học hoặc sự xâm nhậpcủa côn trùng trung gian

1.1.1 Đặc điểm gây bệnh

Vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh chủ yếu thông qua việc xâm nhập vào cây

qua các vết thương cơ học, như các vết xước do côn trùng hoặc các phương tiện canh tác.Sau khi xâm nhập, vi khuẩn sẽ sinh sôi trong mô thực vật, đặc biệt là trong các mạch dẫn,gây tắc nghẽn, dẫn đến triệu chứng vàng lá, héo úa, và cuối cùng làm cây chết

1.2 Bệnh xơ đen trên cây mít

1.2.1 Biểu hiện bệnh

Bệnh xơ đen (Stewart's Wilt) do vi khuẩn Pantoea stewartii gây ra có biểu hiện ban

đầu là các vết cháy trên lá, sau đó lá sẽ bị héo và chuyển sang màu vàng Ở giai đoạnnặng, các mô của cây sẽ bị hoại tử, gây tắc nghẽn dòng chảy nước và dinh dưỡng trongcây, dẫn đến chết cây Các triệu chứng bệnh chỉ xuất hiện bên trong quả và không cótriệu chứng bên ngoài trên bề mặt quả hoặc triệu chứng trên gai không rõ ràng Bệnhcũng có thể gây hiện tượng rụng trái ở giai đoạn cuối, xuất hiện gây hại nặng ở các giốngmít có độ ngọt cao (Ismail & Kaur, 2013; Gapasin & ctv., 2014) Loài vi khuẩn này cũnggây bệnh trên cây ngô, khóm và dưa leo (Abidin & ctv., 2021)

Hình TỔNG QUAN TÀI LIỆU.1 Biểu hiện bệnh xơ đen trong quả mít.

1.2.2 Các giai đoạn phát bệnh

Giai đoạn đầu: Vi khuẩn xâm nhập vào cây qua các vết thương hoặc côn trùngtrung gian Các dấu hiệu ban đầu thường thấy là sự xuất hiện của các vết đen, hoại tử ởphần cuống lá hoặc gốc

Giai đoạn phát triển: Các triệu chứng bệnh trở nên rõ rệt hơn khi cây bắt đầu héo, láchuyển màu vàng và các mô cây bị chết dần

Giai đoạn nặng: Cây sẽ chết, đặc biệt là khi bệnh lan đến các phần quan trọng củacây như rễ, thân và các mạch dẫn của cây

Bệnh đen xơ có thể xảy ra theo từng phần hoặc toàn bộ trái, trong trường hợp bệnhphát triển nặng, các vết đen chen giữa múi và xơ làm cho mũi và xơ dính chặt với nhau

Bên trong múi và hạt của trái bệnh không ghi nhận xuất hiện các vết đen Bên cạnh đó,con đường từ nướm đi vào vòi nhụy đến bầu noãn cũng không có dấu hiệu của các vếtđen Điều này chứng tỏ vi khuẩn xâm nhập vào trái không theo con đường từ nướm.Điều này mâu thuẫn với kết quả nghiên cứu của Nguyen (2018), rằng triệu chứng củahiện tượng đen xơ là xơ, thịt trái và hột bị đen hoặc trường hợp nặng cả ba phần đều cótriệu chứng, và theo nước mưa vi khuẩn đi vào cửa ngỏ là nướm, đi vào vòi nhụy và đếnbầu noãn làm cho múi không thụ tỉnh và hột bị lép Ngược lại, ở các khe hở giữa các múimít tìm thấy nhiều vết đen Đặc biệt, ở những trái có gai dạng tàn ong thường có khe hởgiữa các múi rất lớn, vì vậy rất dễ quan sát các vết đen từ bên ngoài trái vào thông quacác khe hở này Khẽ hở giữa các múi mít là con đường vi khuẩn có thể xâm nhập vào trái.

1.3 Về cây mít

Cây mít (Artocarpus heterophyllus Lam., thuộc họ Dâu tằm Moraceae) có nguồn

gốc phía Tây Nam Ấn Độ, Đông Nam Á, và vùng nhiệt đới Châu Phi (Love & Paull,2011) Cây mít phát triển tốt ở các khu vực có khí hậu nhiệt đới ẩm, với nhiệt độ từ 25°Cđến 35°C và lượng mưa đều đặn

1.3.1 Đặc điểm sinh lý và sinh học của cây mít

Hình thái cây: Cây mít là cây thân gỗ lớn, có thể cao tới 20–25m, với tán lá rộng

Lá cây có hình bầu dục, có thể thay đổi kích thước tùy thuộc vào tuổi cây và điều kiệnmôi trường

Hoa và quả: Hoa mít là hoa đơn tính, mọc thành chùm Quả mít có hình dạng to,

vỏ ngoài dày, có gai, khi chín có màu vàng tươi và có mùi thơm đặc trưng Quả mít được sử dụng làm thực phẩm chế biến dưới dạng tươi hoặc khô

Quả mít: Quả mít là một quả lớn, có thể nặng từ 10kg đến 50kg, và có một lớp

vỏ dày bao bọc bên ngoài với những gai nhỏ Bên trong quả mít có nhiều múi, mỗi múi chứa một hạt lớn và cùi mít ngọt Sinh trưởng và phát triển: Mít là cây trồng nhanh, có thể ra quả từ năm thứ 3 đến thứ 5 khi được chăm sóc đúng cách Cây có thể

ra quả quanh năm, nhưng chính vụ thường vào mùa hè

1.3.2 Đặc điểm dinh dưỡng và giá trị kinh tế của cây mít

Giá trị dinh dưỡng: Mít là một nguồn thực phẩm giàu vitamin A, C, kali, và các chất xơ Cùi mít có giá trị dinh dưỡng cao và được sử dụng trong nhiều món ăn, từ cácmón ăn mặn đến ngọt Mít cũng có thể dùng để chế biến các món ăn vặt, thực phẩm chế biến sẵn như kem, mứt, và đồ khô

Giá trị kinh tế: Cây mít đóng vai trò quan trọng trong nền nông nghiệp của nhiềuquốc gia nhiệt đới, cung cấp nguồn thu nhập cho nông dân Mít cũng là sản phẩm xuấtkhẩu có giá trị, đặc biệt là các sản phẩm chế biến từ mít (như mít sấy khô, mít đông lạnh, hoặc chế phẩm từ mít)

1.3.3 Phân bố cây mít tại Việt Nam hiện nay

Tại Việt Nam, mít được trồng rộng rãi từ Bắc vào Nam, trừ những vùng cao miềnBắc Những năm gần đây, giống mít Chiang Rai hay còn gọi là mít Thái siêu sớm đượctrồng phổ biến ở nước ta Giống mít này có thời gian bắt đầu cho trái rất sớm, chất lượng

và năng suất khá cao, có giá trị về mặt kinh tế nên đã được nông dân ưa chuộng Songtrong thời gian gần đây, bệnh đen xơ mít đã ghi nhận xuất hiện tại nhiều tỉnh canh tác míttrong đó có Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, TP Hồ Chí Minh, Long An, Tiền Giang, HậuGiang (PPD, 2021)

BÀI 2: LY TRÍCH DNA VÀ ĐIỆN DI TỔNG SỐ

2.1 Giới thiệu

2.1.1 Ly trích DNA

Ly trích DNA là phương pháp chiết tách được sử dụng phổ biến trong sinh họcphân tử bằng cách phá vỡ thành tế bào để thu nhận DNA từ mẫu Quá trình này đượcxem là bước khởi đầu quan trọng cho nhiều ứng dụng từ nghiên cứu cơ bản đến việc pháttriển các phương pháp sàng lọc trong chẩn đoán, điều trị bệnh Phương pháp tách chiết

đã ứng dụng để hỗ trợ cho nhiều kỹ thuật sinh học phân tử như: giải trình tự bộ gen, pháthiện vi khuẩn và virus trong môi trường và xác định quan hệ huyết thống, …

2.1.2 Điện di DNA tổng số

Điện di DNA tổng số là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để kiểm tra, đánh giá chất lượng, độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số vừa ly trích được từ mẫu Kỹthuật này dựa trên nguyên tắc di chuyển của các phân tử trong trường điện phụ thuộc vàokích thước, hình dạng và điện tích của chúng Tiến hành điện di DNA tổng số với thuốcnhuộm Gelred và quá trình điện di thực hiện trên gel agarose 1% tại hiệu điện thế 100V trong 30 phút

2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu, hóa chất và trang thiết bị

Vật liệu: mẫu N

Hóa chất: Dung dịch STE buffer (Sodium chloride/Tris/EDTA), Lysis buffer, CI(chloroform/isoamy alcohol), Isopropanol , Ethanol 70, Elution buffer, Gel agarose 1%,TBE buffer 0,5X, Gelred, Loading dye

Thiết bị: Tube, micropipette, máy votex, máy ly tâm, bồn điện di

2.2.2 Quy trình thực hiện ly trích DNA

Tăng sinh khuẩn lạc trên môi trường LB ở 28C trong 24 – 48h tiến hành ly tríchthu DNA của vi khuẩn (Sambrook và Russell, 2001)

Bước 1: Thu cặn khuẩn, hút 1 ml dịch tăng sinh vi khuẩn và tube 1,5 ml ly tâm10.000 vòng/ phút trong 3 phút, loại bỏ dịch nổi thu kết tủa (lặp lại 3 lần)

Bước 2: Hút 400 l dung dịch STE buffer (Sodium chloride/Tris/EDTA) vào tube

và vortex để rửa sinh khối khuẩn Sau đó dung dịch được ly tâm 10.000 vòng/ phút trong

3 phút, loại bỏ dịch nổi (lặp lại 2 lần)

Bước 3: Hút 400 l lysis buffer vào phần kết tủa thu được, vortex hỗn hợp, ủ 65C trong 1 giờ

Bước 4: Hút thêm 300 l CI (chloroform/isoamy alcohol, 24:1), đảo đều và ly tâm13.000 vòng/ phút trong 10 phút

Bước 5: Hút 300 l dịch nổi phía trên cho vào tube 1,5 ml sạch thêm 100 l dungdịch chloroform Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 8 phút

Bước 6: Thu kết tủa DNA bằng isopropanol: Hút 200 l dịch nổi phía trên cho vàotube 1,5 ml sạch mới Thêm 100 l isopropanol, đảo đều, ủ lạnh -20C trong 1 giờ, sau

đó ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 13 phút

Bước 7: Sau khi ly tâm và loại bỏ dịch nổi, tủa DNA được rửa bằng ethanol 70:Loại bỏ dịch nổi, thêm 480 l ethanol 70, ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 10 phút (lặplại 2 lần), loại bỏ dịch nổi và để DNA khô tự nhiên

Bước 8: Tủa DNA được hòa tan hoàn toàn trong 50 l elution buffer Bảo quản -20

Bước 2: Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút

Bước 3: Chụp hình gel dưới tia UV và đọc kết quả

2.3 Kết quả

N6

Hình LY TRÍCH DNA VÀ ĐIỆN DI TỔNG SỐ.2 Kết quả điện di DNA tổng số.

Kết quả điện di ở giếng số 6 cho thấy trên gel agaose có xuất hiện band sáng, rõràng (vạch thứ 2), bên trên có một vạch mờ hơn có thể là các chất tạp nhiễm hoặc protein

do quá trình ly trích chưa tinh sạch hoàn toàn

2.4 Thảo luận

Kết quả điện di trên gel agarose ở giếng số 6 có xuất hiện band sáng chứng minhquá trình ly trích DNA tổng số thành công Ngoài ra, bên trên còn xuất hiện một vạchsáng mờ hơn do các chất tạp nhiễm hoặc protein nguyên nhân có thể quá trình ly tríchkhi hút dịch nổi người thao tác thực hiện chưa đúng dẫn đến phần cặn bên dưới được hútlên nên DNA chưa được tinh sạch hoàn toàn

BÀI 3: PCR VÙNG 16S rRNA VÀ ĐIỆN DI KIỂM TRA KẾT QUẢ

3.1 Giới thiệu

3.1.1 Phương pháp PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật sinh học phân tửphổ biến được sử dụng để khuếch đại đoạn DNA mục tiêu một cách nhanh chóng Kỹ thuậtnày do nhà sinh học người Mỹ là Kary Mullis phát triển vào những năm 1980 và đã đem lạinhững đóng góp quan trọng trong nhiều lĩnh vực như gen học, y học và nhiều lĩnh vựcnghiên cứu khác Kể từ khi Kary Mullis phát minh PCR, phương pháp này đã trải quanhiều cải tiến và biến thể Các phiên bản hiện đại của PCR kết hợp các công nghệ và thuậtngữ mới để cải thiện độ chính xác, độ nhạy và tốc độ thực hiện

Quá trình PCR thường gồm nhiều chu kỳ nhiệt, bao gồm các giai đoạn thăng nhiệt,giảm nhiệt và giữ ổn định nhiệt để tạo ra các bản sao của DNA mẫu Các chu kỳ nhiệtthường được thực hiện bằng cách sử dụng máy PCR có khả năng kiểm soát nhiệt độ mộtcách chính xác như: RT-PCR, qPCR, và nested PCR

3.1.2 Phương pháp điện di

Điện di trên gel agarose (Agarose gel electrophoresis) là kỹ thuật được sử dụng chủyếu để phân tách DNA, RNA hoặc protein trong mẫu dựa trên trên nguyên tắc di chuyểncủa các phân tử trong điện trường và phụ thuộc kích thước của chúng Thực hiện quá trìnhđiện di trên gel agarose 1% với hiệu điện thế 100V trong thời gian 20 phút

3.1.3 Mục đích thực hiện

Sử dụng phương pháp PCR trình tự gen 16S rRNA (vùng gen mục tiêu của vi khuẩn)

và điện di kiểm tra kết quả PCR mẫu DNA mục tiêu để xác định nhanh mẫu có hay không

có sự xuất hiện của vi khuẩn

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu, hóa chất và trang thiết bị

Vật liệu: mẫu N đã ly trích DNA

Hóa chất: Taq polymerase, H2O, buffer, Primer xuôi: 63F, Primer ngược: 1489R, Gelagarose 1%, Ladder 1Kb, TBE buffer 0,5X, Gelred, Loading dye

Thiết bị: máy votex, máy luân nhiệt, bồn điện di.

3.2.2 Quy trình thực hiện PCR

Bảng PCR VÙNG 16S rRNA VÀ ĐIỆN DI KIỂM TRA KẾT QUẢ.1 Chu trình nhiệt

Bước 1: Votex mẫu DNA

Bước 2: Pha loãng mẫu DNA 20 lần (tỉ lệ 2: 18, DNA: H2O)

Bước 3: Chuẩn bị Master mix bao gồm 5,9 µL H2O, 2 µL buffer, 0,5 µL primer F, 0,5

µL primer R, 0,1 µL Taq polymerase cho vào tube

Bước 4: Hút 1 µL DNA mẫu cho vào tube chứa 9 µL Master mix, sau đó dùngmicropipette trộn đều mẫu

Bước 5: Tiến hành PCR với chu trình nhiệt ở bảng 3.1

3.2.3 Quy trình thực hiện điện di kiểm tra kết quả PCR

Bước 3: Lấy lược ra, đưa gel vào bồn điện di đã có sẵn dung dịch đệm TBE

Chuẩn bị mẫu và tiến hành điện di

Bước 1: Trộn đều mẫu DNA vừa PCR xong trước khi hút Hút 4 µL mẫu trộn với 1

µL hỗn hợp Gel red và loading dye Cho toàn bộ hỗn hợp trên vào giếng