Trong nghiêncứu này, đầu tiên chúng tôi sử dụng MinION, một thiết bị giải trình tự di động dựa trênOxford Nanopore Technologies ONT để phát hiện nhanh chóng các loại virus thực vật ở hoa
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu và phương pháp
3.1.1 Thu thập mẫu và chiết xuất RNA
Hoa lan Phalaenopsis từ Samcheok, Hàn Quốc, đã xuất hiện triệu chứng đốm vàng, khảm và hoại tử vào tháng 8 năm 2021 và được bảo quản ở -80 °C Tổng RNA được chiết xuất bằng bộ dụng cụ BeniPrep® Super Plant (InVirusTech Co., Gwangju, Hàn Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Nồng độ và chất lượng RNA được đo bằng máy quang phổ BioDrop (Biochrom, Ltd., Cambridge, Vương quốc Anh) RNA tinh khiết và làm giàu cho thư viện nanopore được thu nhận theo phương pháp trong nghiên cứu trước Cuối cùng, RNA cạn kiệt ribo được định lượng bằng máy đo huỳnh quang Qubit™ 4 với bộ xét nghiệm RNA HS Qubit™ và cũng được bảo quản ở -80 °C cho đến khi sử dụng.
3.1.2 Quan sát các hạt virus bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Các hạt virus trong mẫu hoa lan Phalaenopsis đã được quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) thông qua phương pháp nhuộm âm tính trực tiếp Mẫu lá hoa lan được trộn với đệm phosphate theo tỷ lệ 1:1 và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 20 phút để thu phần dịch trong cho phân tích TEM Các mẫu đã chuẩn bị được cố định trên lưới đồng, nhuộm âm tính bằng 1% amoni molybdate và phân tích tại Trung tâm Cơ sở Nghiên cứu của Đại học Quốc gia Chonnam bằng TEM với điện thế 200 kV.
3.1.3 Chuẩn bị thư viện Nanopore và giải trình tự ONT
Thư viện được tạo ra bằng bộ giải trình tự cDNA trực tiếp (SQK-DCS109) kết hợp với gói Flongle Starter của Oxford Nanopore Technologies, theo hướng dẫn của nhà sản xuất Hỗn hợp thư viện được nạp vào cell dòng chảy Flongle R9.4.1 và giải trình tự được thực hiện trên thiết bị MinION Cell dòng chảy hoạt động trong 24 giờ, được quản lý qua phần mềm MinKNOW phiên bản 21.11.7 Việc gọi cơ sở theo thời gian thực được thực hiện bằng chế độ có độ chính xác cao với điểm chất lượng 7 trong Guppy phiên bản 5.1.12.
3.1.4 Phân tích tin sinh học
Các tệp FASTQ đã được chuyển đổi sang định dạng FASTA bằng Geneious Prime (phiên bản 21.1.1), sau đó các trình tự bộ điều hợp đã được loại bỏ Để xác thực các trình tự virus thực vật, nhiều phương pháp khác nhau đã được áp dụng, bao gồm quy trình làm việc FASTQ.
Trong phiên bản 3.4.2 của EPI2ME Agent, công cụ "What's in my Pot?" (WIMP) đã được sử dụng để tìm kiếm BLASTn với định dạng đầu ra 6 so với dữ liệu bộ gen virus từ Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia (NCBI), cụ thể là Cơ sở dữ liệu RefSeq virus (VirDB) phiên bản 21.11.4 Để xác định các trình tự virus thực vật, các lần đọc trình tự đã được căn chỉnh với các bộ gen virus thực vật có điểm BLAST đáng kể, được xác định thông qua các lượt truy cập hàng đầu từ tìm kiếm BLASTn của NCBI Sự căn chỉnh này được thực hiện bằng công cụ "Ánh xạ đến tham chiếu" trong Geneious Prime với các cài đặt mặc định, bao gồm độ nhạy trung bình/nhanh, dẫn đến việc tạo ra các trình tự đồng thuận.
3.1.5 Phân tích phát sinh loài Đối với phân tích phát sinh loài, trình tự gene protein vỏ hoàn chỉnh (CP) của các loại virus đã xác định được căn chỉnh với trình tự gene CP của các phân lập khác thu được từ NCBI BLASTn Việc căn chỉnh được thực hiện bằng Trình chỉnh sửa căn chỉnh trình tự BioEdit (phiên bản 7.0.5.3) với căn chỉnh nhiều ClustaIW Sau đó, các cây phát sinh loài có độ tin cậy tối đa được tạo ra bằng MEGAX (phiên bản 10.2.4), sử dụng mô hình thay thế nucleotide Tamura–Nei Độ tin cậy của cây phát sinh loài được đánh giá bằng cách tính toán các giá trị bootstrap dựa trên 1000 bản sao.
3.1.6 RT-PCR để xác nhận
RT-PCR được áp dụng để xác nhận sự hiện diện của virus thực vật đã được xác định qua giải trình tự ONT trong từng thư viện Tổng RNA được khuếch đại bằng hỗn hợp RT-PCR SuPrimeScript (Genet Bio, Daejeon, Hàn Quốc), tuân theo các quy trình của nhà sản xuất Tất cả sản phẩm RT-PCR sau đó được giải trình tự bằng phương pháp Sanger và các trình tự này được xác minh thông qua tìm kiếm BLASTn.
3.1.7 Tính khả dụng của dữ liệu
Các tệp FASTQ cho mỗi thư viện trong nghiên cứu này đã được lưu trữ trong kho lưu trữ NCBI Sequence Read Archive (SRA) thuộc cơ sở dữ liệu NCBI BioProject Đồng thời, các trình tự virus thực vật đã được xác định cũng đã được gửi vào GenBank, với mỗi trình tự được gán một số hiệu truy cập duy nhất.
3.1.8 Thiết kế mồi RT-RPA và chuẩn bị crRNA
Các đoạn mồi RT-RPA được thiết kế tỉ mỉ trong vùng CP có độ đặc hiệu cao của NELV bằng cách sử dụng PrimedRPA, theo hướng dẫn trong sổ tay TwistDX RPA RNA CRISPR (crRNA) nhắm vào vùng liền kề với mô típ protospacer (PAM) trong đoạn khuếch đại RT-RPA của NeLV, được thiết kế theo các nguyên tắc đã được thiết lập Để tổng hợp crRNA, T7-crRNA-F và NeLV-crRNA được biến tính trong 5 phút và sau đó ủ bằng cách giảm dần nhiệt độ từ 95 °C xuống 20 °C CrRNA được tổng hợp bằng oligo đã ủ làm khuôn mẫu, theo hướng dẫn của Bộ phiên mã năng suất cao TranscriptAid T7, với thời gian ủ ở 37 °C trong 4 giờ Cuối cùng, crRNA tổng hợp được tinh chế bằng bộ RNA Clean and Concentrator-5 và nồng độ crRNA tinh khiết được định lượng bằng Máy đo huỳnh quang Qubit TM 4.
Bộ xét nghiệm RNA HS Qubit TM (Thermo Fisher Scientific) Sau đó, crRNA được sử dụng ở nồng độ cuối cùng là 1 μM.
3.1.9 Chuẩn bị bản sao virus chuẩn
Bộ mồi cho gene NeLV-CP được sử dụng để tạo cDNA cho phiên mã in vitro Amplicon thu được được nhân bản bằng bộ dụng cụ T&A của Yeastern Biotech, theo giao thức hướng dẫn Phiên mã in vitro được thực hiện bằng T7 RNA polymerase từ Promega Nồng độ bản sao NeLV-CP được xác định bằng máy quang phổ BioDrop và được lưu trữ ở -80 °C cho các thử nghiệm tiếp theo.
3.1.10 Xét nghiệm RT-RPA-CRISPR/Cas12a
Phản ứng RT-RPA được thực hiện bằng Bộ TwistAmp Basic từ TwistDx, Cambridge, Vương quốc Anh Hỗn hợp phản ứng có thể tích cuối cùng là 50 μL, bao gồm 4,8 μL mồi xuôi và mồi ngược (10 μM), 1,2 μL chất ức chế RNase tái tổ hợp (40 U/μL) từ Takara, Kyoto, Nhật Bản, và 1 μL enzyme phiên mã ngược.
M-MLV từ Promega (Madison, WI, Hoa Kỳ), bột enzyme đông khô, nước đã xử lý DEPC và RNA Sau đó, thêm MgOAc (280 mM), tiếp theo là ủ ở 42 °C trong 30 phút.
Phản ứng CRISPR/Cas12a được thực hiện với các thành phần gồm 2,5 μL 10×NEBuffer r2.1, 2 μL ssDNA báo cáo, 0,5 μL chất ức chế RNase, 2 μL EnGen Lba Cas12a, 1 μL crRNA và 2 μL amplicon RT-RPA, tổng thể tích 25 μL Phản ứng diễn ra ở 37 °C trong 15 phút Tín hiệu huỳnh quang được đo mỗi 30 giây bằng Hệ thống PCR thời gian thực CFX ConnectTM và xác nhận bằng mắt thường dưới ánh sáng xanh và tia cực tím.
3.1.11 Tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian phản ứng Để xác định nhiệt độ và thời gian tối ưu cho phản ứng RT-RPA, chúng tôi đã thử nghiệm nhiệt độ trong khoảng từ 34 đến 48 °C và xác nhận thời gian phản ứng bằng cách tiến hành phản ứng ở mỗi nhiệt độ trong 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25 và 30 phút.
3.1.12 Đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy Để đánh giá tính đặc hiệu của phát hiện NeLV, phản ứng chéo được đánh giá bằng cách phân tích cường độ huỳnh quang và quan sát trực quan các phản ứng trong các mẫu bị nhiễm CymMV, ORSV, TSWV và CMV, các tác nhân gây bệnh virus phổ biến của hoa lan Hồ điệp , cũng như trong các mẫu khỏe mạnh Để đảm bảo tính đặc hiệu của crRNA của hệ thống CRISPR/Cas12a, crRNA-1(5′UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCAGGUAAGUUAGGAUGCUUCCC3′) crRNA-2(5′UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGGUAGAACUAACGAUGCCCUUU3′) crRNA3(5′UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCAGGCAAAUCCACUUCAACA3′) đã được sử dụng Độ nhạy được xác định bằng cách so sánh với RT-PCR sử dụng pha loãng 10 lần (dao động từ 100 fg/μL đến 10 zg/μL) của bản sao NeLV RT-PCR được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất bằng cách sử dụng hỗn hợp RT-PCR SuPrimeScript (Genet Bio, Daejeon, Hàn Quốc) và các đoạn mồi xuôi và ngược Mỗi xét nghiệm độ đặc hiệu và độ nhạy được lặp lại độc lập ba lần.
3.1.13 Xác thực CRISPR/Cas12 bằng cách sử dụng mẫu thực địa Để đánh giá hiệu suất của RT-RPA-CRISPR/Cas12a trong việc phát hiện NeLV,
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 21 mẫu hoa lan Phalaenopsis và 17 mẫu hoa thủy tiên vàng (Narcissus tazetta) Nước được xử lý bằng DEPC (NTC), trong khi bản sao NeLV được sử dụng làm đối chứng âm tính và dương tính.
Hình 3.1 Sơ đồ giải trình tự nanopore để xác định virus lan
Phalaenopsis và xét nghiệm RT-RPA-CRISPR/Cas12a được sử dụng để phát hiện NeLV Được tạo bằng Biorender.
Phân tích thống kê
p < 0,0001.
