Khảo sát hàm lượng zearalenone trong bắp bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Đầu dò huỳnh quang và sắc ký lỏng Đầu dò ms

Nam Fusarium-graminearum va Fusarium — culmorum Cấu trúc phân tử Zearalenone Các dẫn xuất của Zearalenone Giao diện chân không ESI Sắc ký đồ của chudn Zon 200 ng/ml Sắc ký đồ của mẫu

Ì

ĐẠI HỌC QUÓC GIA THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÂM THỊ MỸ LINH

KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG ZEARALENONE

_ TRONG BAP BANG SAC KY LONG HIEU NANG

CAO - ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG VÀ

SẮC KÝ LỎNG - DAU DO MS

Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH

Mã số: 60 44 29

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS NGUYEN TH] XUAN MAI

THANH PHO HÒ CHÍ MINH - 09/2008

“Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS NGUYN THỊ XUÂN MAI đã hết

lòng giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quý báo cho tôi trong suốt quá trình

học tập và thực hiên đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Hóa và đặc biệt là Bộ môn

Hóa Phân Tích Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên đã tận tình truyền đạt những

kiến thức cho tôi trong suốt khóa học

Tôi cũng chân thành cảm ơn Lãnh đạo và tập thể cán bộ Sở Nông Nghiệp

và Phát Triển Nông Thôn Tỉnh An Giang và đặc biệt là Phòng Chẩn Đoán Xét

Nghiệm đã tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện

đề tài

Và cuối cùng tôi cũng xin gởi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè

đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Thành Phố Hồ Chí Minh

Lâm Thị Mỹ Linh

Study zearalenone concentration in yellow corn by hight performance liquid chromatography — flourescence detector and liquid chromatography — mass spectrum detector

Abstract

Zearalenone is a mycotoxin produced by several species of fungi belonging

to the genus Fusarium, which is well known for colonising cereals Zearalenone is toxic which effects to heath of human and domestic animals So, we need to study zearalenone contamination in cereal In this study, we analysis zearalenone concentration in yellow corn by hight performance liquid chromatography — flourescence detector (HPLC — FD) and liquid chromatography — mass spectrum detector (LC — MS) The average recovery of blank corn spiked with zearalenone

at level of 50 - 400 pg/kg were 93.46% for HPLC — FD and 94.62% for LC — MS Detection limit of zearalenone in corn samples was 4.0 ng/kg for HPLC — FD and 3.0 ng/kg for LC — MS

1.1-Ngiuồn gbe phat sinh ssisccssscsssicsscssncaimimnenianinimnmnnmnanaamaan 3

2.2.2 Phương pháp sắc ký khí - Đầu dò khối phổ

2.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

2.3 Kỹ thuật phân tích được thực hiện

CHƯƠNG 3: NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ LỎNG . -c-ccccc2 ll 3.1 Khai quat vé ly thuyét sic ky 1Ong cccsssssssssessseeseeeeensssnnmeeseeseeeeceesssssnnuneetesetee 11 3.2 Các bộ phận cơ bản của mOt may SAC KY .sesseseessssseseccsssssseneesesseeeeeecescennnnneteeseeee 12 3.2.1 Pha tinh (cOt SAC KY) ccscccssssssssscsssssecsesssssssnescessssssccesssnseecessnneeseecsssnneecesseaneeessees 12

82 ,2:Ph8 HGHỂ cu eessesennnnerersoiseoosSEOEHOIHGISHIHGBEIEIGNHISEHANRSIEEG 13

82:3: HƠI lgeieibestiocbinebig1106134601g15419488034488801314051648u.018808u803E16G1AVEeKEuEbISEST1325306L4984026 356 13

GF BIS THIẾU AD oa, sssssesstitesosnvazeecnsocemnegrecnnseennesenenossennerennocgsangaesosneonssoananoseonssectognenysecsnnaecse 13 3.3 Các thông số cơ bản của phương pháp sắc ký cccccz+z+cccrz 14

3.3;1 Thời 6lani lỮU Ẳsszsssaescofixtnlossdiigt06180811508 đit ii chiu8hiitg kg nggygg:8 nha 14

3.3.2 Hệ số dung lượng k” ccccccvvseeererteeererteeertererrrrrrerrerue TẮ

3.33, Số đĩa lý THUYỀN sisetasodeoidtodtitttstseltfgiGdifiidftuoiSqtuiqaolggiasaansaseT5

3-8?4: ĐỘ chơi [0G 0l ynaessssvetoooiettatsGliao6qpabittt digsagisGauasagrgiissopsuil5 3.3.5 Độ phân giải R; SEš50585480 ‘i NEESfgi49988558303880460055susvsssssi TỔ

CHƯƠNG 4: NGUYÊN LÝ CỦA sk Đổ F HUỲNH QUANG VÀ THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG 17

4.1 Nguyên lý hoạt động của đầu đò huỳnh quang -cccc+e++rrez 17

4.2 Thiết bị Sắc ký lỏng hiệu năng cao — Đầu đò huỳnh quang của hãng Shimadzu 18 4.2.1.Thiết bị loại khí 18

45:5: ĐẦM ổỖ nu nnnBniilbndgbibdtBGIUSUIGIGIIIAJNUHENERERISGRNGSiAAhngsa 20 CHƯƠNG 5: NGUYÊN LÝ CỦA PHỎ KHÓI LƯỢNG VÀ THIẾT BỊ SẮC KÝ

LONG — DAU DO KHOI PHỎ .222222222vvveceeerrrrrrrrrrrveeecrrrrrree, 2Í 5.1 Khái quát về phổ khối lượng -5222Svvcveverervrrrvrrrrrrrrrrrrrvrvvvvve.ve 2Í

5:1,1.Bay Hơ EHIẤ¿rssnsssadngtlidgosidoigtsoSttisbSGilGgiltg8sYdiisgagidtagassysb 21

5.1.2 Cách tạo Ïon -cccccccceerrcrrrttrrerrrrrrrrrtrrerrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrooee 21

5.1.3.Phân tích các ion - - - ¿5c Sscvcstvetereeeerreerrrrrrrrerrrrrrrrrrreecerereeev 2P

Š 2; Sắc ký lông phép khất phổ ‹:cuesaneeenbtoittiiggliiufigiRadtgodiaauaiasasaasaso2t 5.3 Thiết bị Sắc ký long — Dau dò khối phổ của Thermo -+ 25

5,3.1.B6 tim mu ter MOQ ecccssesesccsssssssssssssseccssssseccessseseessssusecesssessessssssseesssssseeessssses 25

5.3.2 Đầu đò khối phổ coseeecea 25 5.3.3 Ngudn ion h6a essssssssssssssssssssssssssssssssssssesececesecssesesescescesesessessesessssssssesseesssssesssses 20

5:3,4.2G1a6 diGn GHâN KhÔN guugsattstatdGRatiSgiggidivddiiggileissagisssso 1277

THỰC NGHIỆM

CHƯƠNG 6: HÓA CHÁT VÀ DỤNG CỤ

6.2.Dụng cụ

CHUONG 7: KHAO SAT CAC DIEU KIEN TOI UU HOA TREN MAY SAC

KY LONG HIEU NANG CAO - DAU DO HUYNH QUANG

7.1.Khao sat cdc diéu kién t6i wu héa

7.2.Đường chuẩn ciia Zearalenone sssssssessesssesssssssssssecsssssessssssssssssssssveveceeseseseeeeeeeeees 39

7.2.1.Đường chuẩn của Zearalenone trên máy Sắc ký lỏng hiệu năng cao- Đầu đò

Huỳnh QUAHEssosseesoeeinisnikSDASi0E01161606501201611161606116000110515518856100031488000088pg1088 058 030G 39

7.2.2 Đường chuẩn của Zearalenone trên máy Sắc ký long — Dau do khối phé 39

7.3.Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương PUDAD aveasexvsrsasswevssvaavsssecayseausnsnceanaiaaiassaisiasaneecnonneneoanereaneonsennesnnensnsnssessonesonvoonssenceracensvonne 40

CHUONG 8: KHAO SÁT CAC QUI TRÌNH CHIẾT MẪU 41

8.1.Khảo sát qui trình chiết mẫu dya theo Food Chemistry (Hod học thực phẩm) 41

§.2 Khảo sát qui trình chiết mẫu dựa theo Cục Dược Phẩm và Thực Phẩm Mỹ (FDA)

8.4 Đánh giá hiệu suất thu hồi của qui trình .44

8.4.1 Đánh giá hiệu suất thu hồi của qui trình trên máy Sắc ký lỏng hiệu năng cao-

Đầu: dỗ huỳnh dU4ĐẾ sa non nho hn G8 1GG8001088610xrrrrdeieraiie 44

8.4.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi của qui trình trên máy Sắc ký lỏng —

Đầu dò khối phổ -c2222ttrt 2 22221 2111 11- 1 1 0yee 46

CHƯƠNG 9: KHẢO SÁT TRÊN MẪU THẬTT -c:¿c:c2 2222222222225 51 9.1 Mau Mt ta oe eccccsssssssssssessnseesessssvsssesessssessssssssssssssssssssssssssssessessssseseeceeeeeeeee 51

9.1.1 Hinh anh bap lén méc trong mOt tudn cccccssssseeessssesssssseseeeeesssnsssseseeesssseses 51 9.1.2 Thi 0.0 ốố.ố 52 L2, Sẽ ẻẽ cố cố 52

Š'33, HA: coannnctinnnnticisliseotrtsntdicitesS08018S0,E88888888suoloEniclirgAGHN/T04000.500100143 54 9/2: Kế RUB I s66 1á G2 tac ghyid e46414801ÐỀGISG3xt4t|2180G3G181631085808300016303.QgUànggiapdsee 56

BEET DUAN secs sce cesses czcssssnacgncenscancsccicancs sss sassnasbasbcnussssousesssanssssosasnesh 62 TAI LIEU THAM KHAO

PHU LUC

8.2 Nồng độ và hiệu suất thu hồi của năm mẫu thêm chuẩn trên máy HPLC-DE 46

§.3 _ Nồng độ và hiệu suất thu hồi ba điểm trên đường chuẩn của Zearalenone trên

8.4 Nồng độ và hiệu suất thu hồi của năm mẫu thêm chuẩn trén may LC-MS 49

9.1 Kết quả phân tích mẫu lên mốc hai tuần bằng máy HPLC-DE 55 9.2 Kết quả phân tích mẫu lên mốc hai tuần bằng máy LC-MS_ „ 56 9.3 Kết quả phân tích mẫu lên mốc ba tuần bằng máy HPLC-DE 57 9.4 Kết quả phân tích mẫu lên mốc ba tuần bằng máy LC-MS 58 9.5 Kết quả phân tích mẫu lên mốc bốn tuần bằng máy HPLC-DE 60

9.6 _ Kết quả phân tích mẫu lên mốc bốn tuần bằng máy LC-MS 61

Nam Fusarium-graminearum va Fusarium — culmorum

Cấu trúc phân tử Zearalenone

Các dẫn xuất của Zearalenone

Giao diện chân không ESI

Sắc ký đồ của chudn Zon 200 ng/ml

Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn ở chế độ đẳng dòng

Sắc ký đồ của chuẩn Zon 200 ng/ml 6 thanh phan pha động 1

Sắc ký đồ của mẫu trắng them chuẩn ở thành phần pha động 1

Sắc ký đồ của chuẩn Zon 200 ng/ml ở thành phần pha động 2

Sắc ký đồ của mẫu thêm chuẩn ở thành phần pha động 2

Sắc ký đồ của chuẩn Zon 200 ng/ml ở thành phần pha động

Sắc ký đồ của mẫu thêm chuẩn ở thành phần pha động 3

Sắc ký đồ của chuẩn Zon 200 ng/mI ở tốc độ dòng 0.5 ml/phút

7.10 Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn ở tốc độ dòng 0.5 ml/phút

7.11 Chuẩn Zearalenone nồng độ 400 ng/ml trên máy HPLC

7.12 Chuẩn Zearalenone nồng độ 400 ng/ml trên máy LC-MS

7.13 Đường chuẩn zearalenone trên máy HPLC-ED

7.14 Đường chuẩn zearalenone trên máy LC-MS

8.1

8.2

Sắc ký đồ của mẫu trắng không thêm chuẩn trên máy HPLC-DF

Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn 50 ng/mI trên máy HPLC-DF

8.3 Sac ky dé cla mau tring thêm chuẩn 200 ng/ml trên máy HPLC-DE

8.4 Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chudn 400 ng/ml trén HPLC-DF

8.5 Sắc ký đồ của mẫu trắng thứ nhất thêm chudn 200 ng/ml trên may HPLC-DF

8.6 Sắc ký đồ của mẫu trắng thứ hai thêm chudn 200 ng/ml trén may HPLC-DF

87 Sắc ký đồ của mẫu trắng thứ ba thêm chuẩn 200 ng/ml trén may HPLC-DF

8.8 Sắc ky đồ của mẫu trắng thứ tư thêm chuẩn 200 ng/mI trên máy HPLC-DE

§.9_ Sắc ký đồ của mẫu trắng thứ năm thêm chuẩn 200 ng/ml trên máy HPLC-DF

8.10 Sắc ký đồ của mẫu trắng không thêm chuẩn trên máy LC-MS

8.11 Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn 50 ng/ml trên máy LC-MS

8.12 Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn 200 ng/ml trén may LC-MS

8.13 Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn 400 ng/mI trên máy LC-MS

§.14 Sắc ký đồ của mẫu trắng thứ nhất thêm chudn 200 ng/ml trên máy LC-MS 8.15 Sắc ký đồ của mẫu trắng thứ hai thêm chuẩn 200 ng/ml trén may LC-MS

§.16 Sắc ký đồ của mẫu trắng thứ ba thêm chuẩn 200 ng/ml trên máy LC-MS 8.17 Sắc ký đồ của mẫu trắng thứ tư thêm chuẩn 200 ng/ml trên máy LC-MS

8.18 Sắc ký đồ của mẫu trắng thứ năm thêm chuẩn 200 ng/ml trên may LC-MS 9.1 Bắp lên mốc trong một tuần

9.2 Sắc ký đồ của mẫu thứ nhất lên mốc trong một tuần trên máy HPLC-DF 9.3 Sắc ký đồ của mẫu thứ hai lên mốc trong một tuần trên máy HPLC-DF

9.4 Sắc ký đồ của mẫu thứ ba lên mốc trong một tuần trên may HPLC-DF

9.5 Sắc ký đồ của mẫu thứ nhất lên mốc trong một tuần trên may LC-MS

9.6 Sắc ký đồ của mẫu thứ hai lên mốc trong một tuần trên máy LC-MS

9.7 Sắc ký đồ của mẫu thứ ba lên mốc trong một tuần trên máy LC-MS

9.8 Bap lên mốc trong hai tuần

9.9 Sắc ký đồ của mẫu thứ nhất lên mốc trong hai tuần trên máy HPLC-DF 9.10 Sắc ký đồ của mẫu thứ hai lên mốc trong hai tuần trên máy HPLC-DE

9.11 Sắc ký đồ của mẫu thứ ba lên mốc trong hai tuần trên may HPLC-DF

9.12 Sắc ký đồ của mẫu thứ nhất lên mốc trong hai tuần trên máy LC-MS

9.13 Sắc ký đồ của mẫu thứ hai lên mốc trong hai tuần trên máy LC-MS

9.14 Sắc ký đồ của mẫu thứ ba lên mốc trong hai tuần trên máy LC-MS

9.15 Bắp lên mốc trong ba tuần

9.16 Sắc ký đồ của mẫu thứ nhất lên mốc trong ba tuần trên máy HPLC-DF /

Vil

9.17 Sắc ký đồ của mẫu thứ hai lên mốc trong ba tuần trên máy HPLC-DF 9.18 Sắc ký đồ của mẫu thứ ba lên mốc trong ba tuần trên máy HPLC-DF

9.19 Sắc ký đồ của mẫu thứ nhất lên mốc trong ba tuần trên máy LC-MS

9.20 Sắc ký đồ của mẫu thứ hai lên mốc trong ba tuần trên máy LC-MS

9.21 Sắc ký đồ của mẫu thứ ba lên mốc trong ba tuần trên máy LC-MS

9.22 Bắp lên mốc trong bốn tuần

9.23 Sắc ký đồ của mẫu thứ nhất lên mốc trong bốn tuần trên máy HPLC-DF

9.24 Sắc ký đồ của mẫu thứ hai lên mốc trong bốn tuần trên máy HPLC-DF

ứ Á rên máy HPLC-DF ay SIPC:

9.25 Sắc ký đề củ

9.26 Sắc ký đồ của mẫu thứ — lên mốc trong bốn tuần trên máy LC-MS

9.27 Sắc ký đồ của mẫu thứ hai lên mốc trong bốn tuần trên máy LC-MS

9.28 Sắc ký đồ của mẫu thứ ba lên mốc trong bốn tuần trên máy LC-MS

DANH MUC CHU VIET TAT VA KY HIEU

LC-MS: Sac ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography Mass Spectrophy)

HPLC-DF: Sắc ký lỏng hiệu năng cao-Đầu dò huỳnh quang (High Performance

Liquid Chromatography — Flourescence Detector)

APCi: ion héa héa hoc & 4p suai thudng (Aimospheric Pressure Chemicai

Ionization)

ESI: ion hóa phun điện tử (Electron Spray Ionization)

MS: Phổ khối lượng (Mass Spectrometry)

TLC: Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography)

GC: Sắc ký khí (Gas Chromatography)

GC-MS: Sắc ký khí ghép khối phổ (Gas Chromatography Mass Spectrophy)

LOD: Gidi han phat hién (Limit of Detection)

LOQ: Giới hạn dinh lugng (Limit of Quantitation)

CI: Ion héa héa hgc (Chemical Ionization)

EI: lon hóa bằng bắn phá dién tir (Ionization by Electron Impact)

FAB: Bắn phá nhanh nguyén ttr (Fast Atom Bombardment)

MALDI: lon hóa bằng cách giải hợp chất ra khỏi chất mang bằng tia laser (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)

FI: lon hóa trường (Field Ionization)

Zon: Zearalenone

FDA: Cục Thực Phẩm và Dược Phẩm Mỹ (Food and Drug Administration)

OTA: Ochratoxin A

Afla: Aflatoxin

PPM: M6t phan triéu (Part Per Million)

PPB: M6t phan ti (Part Per Billion)

LOI MO DAU

Hiện nay độc tố nắm đã trở thành vấn đề được mọi người quan tâm và nghiên

cứu Nắm mốc và những sản phẩm biến chất của chúng sản sinh ra một độc tố gọi

chung là Mycotoxin Mycotoxin là hợp chất được sinh ra khi hạt bị nắm hoặc mốc Mycotoxin và những sản phẩm biến chất của chúng có thể gây độc đối với con người

và vật nuôi Sự phá hoại của nắm và kéo theo là việc sản sinh ra mycotoxin có thể xuất

hiện trong suốt quá trình gieo trồng, thu hoạch, lưu trữ, và phương pháp sản xuất hay

chế biến hạt Và điều này bị ảnh hưởng chủ yếu bởi độ ẩm, nhiệt độ, và oxy hiệu dụng

Thêm vào đó, những hạt bị hư hại, chưa chín, hoặc những tác động khác thì r

mốc Mốc có thể làm giảm thành phần dinh dưỡng và chất lượng hạt, nhưng vấn đề

được quan tâm hàng đầu là những ảnh hưởng độc tính của những sản phẩm biến chất

của chúng

Cho tới nay các nhà khoa học đã xác định được từ 300 — 400 loại mycotoxin,

nhưng chỉ một số ít được cho thấy gây nguyên nhân đáng kể, bất lợi đến sức khỏe và gây rắc rối Những loại này bao gồm: Aflatoxin, Deoxynivalenol, Zearalenone, Fumonisin, Ochratoxin, và độc tố T-2 Nhưng cũng không phải tất cả nắm mốc đều

san sinh ra mycotoxin Những loại nấm có khả năng sản sinh ra mycotoxin là:

Aspergillus, Penicillium, Claviceps, va Fusarium

Zon là sản phẩm biến chất được sản sinh chủ yếu từ hai loại ndm Fusarium là

Fusarium — graminearum va Fusarium — culmorum [21] Nam Fusarium xuất hiện trên các loại ngũ cốc khác nhau như bắp, gạo, lúa mì, lúa mạch mà thường xuyên và

chủ yếu nhất là trên bắp [14][21] Ở đất nước nông nghiệp như nước ta, bắp vừa được dùng làm thực phẩm vừa làm thức ăn gia súc Do đó cần phải xác định độc tố nắm này

trên bắp

Zon 1a chat độc gây ảnh hưởng đến khả năng sinh sản, thuộc họ Zearalenone

Sự nhiễm độc zearalenone di 6 hàm lượng nào cũng gây hại cho người và vật nuôi

Theo tổ chức WHO hàm lượng cho phép đối với thực phẩm dùng cho con người là:

30-1000 ug/kg (1998) Do đó cần phải có phương pháp có độ nhạy và độ chính xác

cao để xác định hàm lượng chất này ở nồng độ thấp Trong đề tài này có hai phương pháp được chọn để xác định zearalenone.Để đáp ứng được những yêu cầu đó và trong điều kiện cho phép, chúng tôi chọn phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao — Đầu dò huỳnh quang và Sắc ký lỏng - Đầu dò khối phổ.

2.Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu theo các bước sau:

Khảo sát các điều kiện tối ưu hoá trên máy HPLC-DF

Áp dụng các điều kiện tối ưu hoá ở trên cho máy LC-MS

Khảo sát khả năng tách chiết và làm sạch mẫu trên các loại cột khác nhau

Tạo mẫu bắp lên mốc

Áp dụng các điều kiện đã khảo sát ở trên lên mẫu tự tạo

TÔNG QUAN

3

CHUONG 1: GIỚI THIỆU VỀ ZEARALENONE

1.1 Nguồn gốc phát sinh:

Zearalenone (Zon) là sản phẩm biến chất được sản sinh từ một vài loại nắm

Fusarium, ma chi yếu 1a nam Fusarium graminearum va Fusarium culmorum Viéc

lưu trữ ngũ cốc bị nhiễm nắm #2sarizm dưới điều kiên ẩm ướt có thể cho ra sản phẩm

có nồng độ Zearalenone cao, mà bắp là loại lương thực thường xuyên bị nhiễm nhất

Bên cạnh đó, cũng có một vài báo cáo về việc sản sinh Zearalenone trên các loại hạt

trên đồng ruộng, trong suốt quá trình thu hoạch và/ hoặc là trong suốt quá trình lưu trữ của lương thực và thức ăn gia súc [14]

Hình 1.1 Nam Fusarium —graminearum và Fusarium — culmorum ([18] và [19])

Zon có mối liên hệ với bệnh tăng nội tiết tố và sự rối loạn chức năng sinh sản ở

gia súc, heo và gia cầm, mà trong đó heo là loài bị ảnh hưởng mạnh nhắt.Hội chứng

tăng nội tiết tố có thể làm nở rộng tử cung, sưng âm hộ, tuyến vú, sa âm hộ hoặc trực

tràng, hoặc có hiện tượng mang thai giả.21]

Khi gia súc và gia cầm ăn phải thức ăn nhiễm Zon có thể làm giảm khả năng tình dục, thai chết lưu, sẩy thai, và làm giảm số lượng con trong một lứa đẻ Ảnh

hưởng nghiêm trọng khác trên lợi nhuận là làm giảm khả năng sinh sản của heo và ngành chăn nuôi heo như là kết quả của sự không đậu thai có liên quan đến sự hiện diện của Zon trong bắp Mặc dù những cuộc nghiên cứu xa hơn cũng yêu cầu xác nhận

có hay không việc Zon là nguyên nhân gây ra bệnh ung thư tiềm tàng ở người, mà đã

có bằng chứng xác thực gây ra ung thư đối với động vật.[12]

1.2 Cấu trúc phân tử Zearalenone:[27]

5 Ÿe33esvie

Hình I.2.Cấu trúc phân tử Zearalenone

~Công thức phân tử: C¡sH;;Os

-Khối lượng phân tử: 318.36 g/mol

-Tén theo IUPAC: [6-(10-hydroxy-6-oxo-trans-1-undecenyl)-B-resorcylic-acid- lactone]

-Zearalenone có tất cả 5 dẫn xuất với công thức cấu tạo như sau:

Zexijenece a-Zeslendl Brewster

nơ

“oH “ou

Zewsisnore atewsianal Be2eaa'erot

Hình 1.3.Các dẫn xuất của Zearalenone ([20])

- Vi Zearalenone 1a san phẩm chính dugc san sinh tir ndm Fusarium [24], là chất bền nhiệt [27] và vì chỉ có một chất chuẩn duy nhất nên trong đề tài này chúng tôi chỉ khảo

sát Zearalenone

1.3 Tính chất hóa lý của Zearalenone: [27]

- Zearalenone là các chất ở dang tinh thé mau trắng, có điểm nóng chảy ở 164-

165°C

~ Zearalenone không tan trong nước, tan trong dung dịch kiềm và một vài dung môi hữu cơ như: benzen, chloroform, acetonitril, methanol,

- Zearalenone là hợp chất bền trong suốt quá trình lưu trữ, nghiền, chế biến và nấu

thành thức ăn và nó vẫn không bị phân hủy ở nhiệt độ cao

~ Zearalenone là hợp chất phát huỳnh quang tự nhiên màu xanh lục

1.4 Những độc tính của Zearalenone:

- Những ảnh hưởng của Zearalenone đối với con người:[27]

+ Zearalenone đi qua màng tế bào và có thể kết nối với một số hocmon sinh

dục Phức hình thành nhanh chóng chuyển sang nhân tế bào và ở đó nó liên kết với các

cơ quan nhận cảm oestrogen và làm hoạt hóa quá trình sao chép gen (Riley, 1998) Độc tố Zearalenone là nguyên nhân làm giảm ảnh hưởng của hóc môn sinh dục lên cơ

thể các loài động vật có vú, ảnh hưởng đến sự thụ thai, sự rụng trứng, sự phát triển của

bào thai và khả năng sống sót của con vật sơ sinh (Riley, 1998)

+ Zearalenone bị nghỉ ngờ làm sự dậy thì xảy ra sớm hơn tự nhiên ở các trẻ nhỏ

ở Puerto Rico giữa năm 1978 và 1981(Sàenz de Rodriguez, 1984, 1985) và ở Hungary (Szuetz, Mesterhazy, Falkay, và Bartok, 1997)

+ Một vài tác giả cho rằng có sự liên quan giữa độc tố Zearalenone và bệnh ung

thư cỗ ở người (Tomaszewski, Mitursky, Semczuk, Kotarshy, và Jakowicki, 1998)

+ Những tác giả khác (Gao và Yoshizawa, 1997; Luo, Yoshizawa, và Katayama, 1990) cũng đã tìm thấy mối quan hệ có thể có giữa Zearalenone và bệnh

ung thư thực quản ở Trung Quốc

- Những ảnh hưởng của Zearalenone đối với động vật:[7]

+ Nhiều triệu chứng mơ hồ, ví dụ như hiệu quả thấp khi dùng vaccine, kháng

sinh và các phương pháp chữa trị khác

+ Sự tăng trưởng không đồng đều trong bầy đàn (con nhiễm độc nhiều, con

không nhiễm)

+ Ăn ít và bỏ ăn

+ Tỉ lệ tăng trưởng và cho sữa kém

+ Kháng thể không thể truyền từ mẹ sang con

+ Tiêu chảy hoặc tiêu chảy ra máu mà không sốt

+ Tỉ lệ sẩy thai tăng cao ở nhiều giai đoạn mang thai

+ Hệ miễn dịch bị tổn thương hoặc không hoạt động

+ Lông xù đặc biệt đối với heo con

- Đối với thực phẩm dùng cho con người: 30-1000 ug/kg (WHO 1998)

- Đối với thức ăn cho động vật: 60-200 ug/kg (EU 1988)

Hai thành phần chính là Clinoptilolite và Glucomannan este héa được chiết xuất từ

vách tế bào Saccharomyces cerevisiae Sự hiệp lực cộng hưởng độc đáo của hai hoạt

chất này tạo nên cách kết chặt hiệu quả nhất đối với mọi loại độc tố nắm phổ biến Microbond chứng tỏ có khả năng hấp thụ mạnh nhiều loại độc tố nắm khác nhau

Các cuộc thí nghiệm sau cho thấy khả năng hấp thụ của Microbond trong thức ăn

nhiễm độc:

Bảng 1.1 Khả năng hắp thụ độc tố nắm của Microbond

+ Phương pháp ELISA được thực hiện dựa trên tiến trình được đề nghị trong bộ

kit Zearalenone Mẫu nền được chiết bằng hỗn hợp MeOH-H;O (70:30) bằng cách lắc hỗn hợp trong 10 phút Dung dịch mẫu được lọc qua giấy lọc và dịch lọc được chiết lại

bằng dichlorometan Lớp dichlorometan được hóa hơi đến khô hoàn toàn và được phân giải bằng cách thêm vào liên tục MeOH, H;O và n-Heptan Lớp MeOH được pha

loãng với dung dịch đệm được cung cấp trong bộ kit Kế đó dung dịch mẫu được xử lý

theo bộ kit Zearalenone Ridascreen và độ hấp thu được đo tại bước sóng 450 nm Độ

thu hồi được thực hiện bằng việc thêm chuẩn Zearalenone vào mẫu trắng với nồng độ

+ Đôi khi cho đương tính giả vì vậy thường dùng phương pháp ELISA để sàng

lọc bớt mẫu khi có số lượng lớn mẫu

2.2 Các phương pháp sắc ký:

2.2.1 Phương pháp sắc ký bản mồng:

- Nguyên tắc:

Mẫu bắp đầu tiên được đồng nhất và được chiết Kế đó dịch chiết được chấm

lên trên bản sắc ký bản mỏng Những dịch chiết từ một vài mẫu bắp có thể được chấm trên cùng một bản sắc ký bản mỏng Bản sắc ký bản mỏng được phát triển, được ngâm

vào dung dịch nhôm clorua và được gia nhiệt Kế đó mycotoxin được hiện hình bằng

việc nhìn bản dưới bức xạ tử ngoại bước sóng dài Chuẩn mycotoxin cũng được làm

tương tự để định lượng sự hiện diện của mycotoxin Mẫu bắp bên dưới minh họa nồng

độ aflatoxin gấp khoảng ba lần chuẩn

+ Cũng trãi qua ba bước: chiết, làm sạch và phát hiện

+ Ở giai đọan chiết: sử dụng hỗn hợp ACN-H;O (3:1;v:v) sau đó được chiết lại bằng dung môi CHC];

+6 giai đoạn làm sạch: sử dụng cột Florisil, sau đó cô quay Cuối cùng cặn

được hòa tan bằng thuốc thử TMS [N-Trimetylsilylimidazole-trimetylchlorosilane- etylacetate (1:0.2:9)]

+ Ở giai đoạn phát hiện: sử dụng hệ thống sắc ký khí, đầu dò MS

+ Trên mẫu nền là lúa mì và bắp thì phương pháp này xác định được đồng thời

8 loai mycotoxin (Deoxynivalenol, 3- acetyl- Deoxynivalenol, Nivalenol, Fusarenon —

9

X, T— 2, Neosolaniol, Diacetoxyscirpenol và Zearalenone) ở nồng độ ppb và hiệu suất

thu hồi là 81 %

+ Giới hạn phát hiện của phương pháp này đối với Fusarium trong ngũ cốc là 5

— 10 ng/g; Deoxynivalenol và Nivalenol là 10 ng/g; những chất còn lại là 5 ng/g

2.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao :

Vì các hợp chất zearalenone có khả năng phát huỳnh quang tự nhiên nên hầu

hết các phương pháp xác định đều dùng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao — đầu

đò huỳnh quang trên các nền mẫu khác nhau như: ngũ cốc và thức ăn cho heo [21],

thức ăn động vật [26], hạt [17], bắp [12][14][22][24][29]

Sau đây là một số phương pháp tiêu biểu:

® Dựa theo AOAC: [17]

+ Ở giai đoạn làm sạch: sử dụng cột ái lực miễn dịch Afla-Ochra-Zea

+ Sau khi tạo dẫn xuất với acid trifluoroacetic, các mycotoxin như: aflatoxin

(Afla), ochratoxin A (OTA), va zearalenone (Zon) được phát hiện đồng thời bằng sắc

ký lỏng cột C-18 với đầu đò huỳnh quang

+ Trong những nền khác nhau sau khi rửa giải với cột ái lực miễn dịch đã cho

giới hạn phát hiện rất thấp: Afla (0.002-0.7 ng/kg); OTA (0.07-0.25 ng/kg); Zon (1-3

tg/kg) Giới hạn định lượng là: Afla (0.25 ug/kg); OTA (0.5 ug/kg); Zon (5 ug/kg)

+ Hiệu suất thu hồi đối với Afla, OTA và Zon trong lúa mạch đen và gạo

khoảng 86-93% khi sử dụng 0.5 gam vật mẫu trên cột ái lực miễn dịch.

~- Ưu điểm:

+ Xác định được đồng thời Aflatoxin, OTA và Zearalenone ở nồng độ ppb + Xác định được trong nhiều loại nền mẫu khác nhau

- Nhược điểm:

+ Sử dụng cột ái lực miễn dịch Afla-Ochra-Zea thì đắt tiền

+ Chỉ thực hiện với một lượng nhỏ mẫu vật (nếu thực hiện với lượng mẫu vật >

0.5 gam thì cột bị quá tải)

© Dựa theo Cục Thực Phẩm và Dược Phẩm Mf (FDA): [29]

- Nguyên tắc:

+ Cũng trãi qua ba bước: chiết, làm sạch và phát hiện

+ Ở giai đọan chiết: sử dụng hỗn hợp MeOH- HO (50+50, v/v) để chiết mẫu

+ Qui trình xử lý mẫu tương đối đơn giản

+ Sử dụng cột C-§ chất ra nhanh nên ít tốn dung môi và thời gian phân tích

- Nhược điểm:

+ Chỉ có hiệu suất cao khi thực hiện với từ 0.5 — 1.25 gam vật mẫu Trên khối lượng này cột bị quá tải nên hiệu suất rất thấp

+ Sử dụng cột C-18 trong quá trình xử lý mẫu tốn nhiều kinh phí

2.3 Kỹ thuật phân tích được thực hiện:

Vì điều kiện có giới hạn và mẫu nền phức tạp nên cần có phương pháp xác định có

độ chính xác cao và giới hạn phát hiện thấp Do đó tôi chọn phương pháp xác định

Zearalenone trong bắp bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao- Đầu dò huỳnh quang và phương pháp Sắc ký lỏng - Đầu dò khối phổ.

CHƯƠNG 3: NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ LỎNG

3.1 Khái quát về lý thuyết sắc ký lỏng: [5]

Sắc ký lỏng dùng để phân tích các chất có khối lượng phân tử lớn, ít bay hơi và

kém bền nhiệt

- Pha tĩnh: chất rắn hay chất lỏng

- Pha động: chất lỏng di chuyển dưới tác dụng của áp suất

- Mẫu phân tích hòa tan trong pha động

* Nguyên lý của phương pháp: Dựa vào ái lực khác nhau giữa các chất cần xác

định với pha tĩnh và pha động mà chúng được tách nhau ra nhờ thay đổi độ phân cực

của dung môi pha động cùng với cột tách thích hợp Việc định lượng được thực hiện

bằng phương pháp ngoại chuẩn (so sánh mẫu với mẫu thêm chuẩn đã biết hàm lượng

trong cùng điều kiện phân tích)

* Ưu điểm:

- Có khả năng tách và định lượng đồng thời các chất có độ phân cực gầẦn nhau

Vì vậy tách được đồng phân và đồng đẳng của nhau

- Các đầu đò dùng trong Sắc ký lỏng hiệu năng cao có độ nhạy cao, đặc biệt là đầu dò huỳnh quang và đầu dò khối phổ có khả năng định tính và định lượng ở hàm

3.2 Các bộ phận cơ bản của một máy sắc ký:

Vật liệu nhôi, 3-10um

Hình 3.2 Cột sắc ký

- Thường làm bằng thép không rỉ, có đường kính cột: 2.1 — 7.6 mm; chiều dài cột:

1 -30 cm, đường kính hạt: 3 — 10 pm

- Yêu cầu đối với cột sắc ký: cột phải trơ, có thành phẳng và chịu được áp suất cao

- Cột phân tích thường nối với một cột bảo vệ có thành phần chất nhồi cột tương tự cột phân tích để làm tăng tuổi thọ cột

Vật liệu chế tạo pha tĩnh:

Silica gel: tính phân cực cao do chứa nhóm silanol mang tính acid (pH = 3-5, do đó

sẽ giữ mạnh các chất có tính baz), dùng chủ yếu trong sắc ký hấp phụ dưới dạng hạt

nhỏ (ø = 20 — 800 m’/g)

Silica có gắn nhóm hữu cơ: dùng chủ yếu trong sắc ký phân bố

- R là nhóm alkyl, nếu nhóm alkyl có mạch carbon càng dài thì độ phân cực càng giảm, dùng cho sắc ký phân bố pha đảo

- R là nhóm aminoalkyl, cyanoalkyl sẽ có độ phân cực cao hơn, dùng cho sắc

ký phân bố pha thuận

Vật liệu polime: dùng trong sắc ký trao đổi ion

13

3.2.2 Pha động

4 4 À, 4 {, tA A À Xe thx wile att icin

Dùng chuyên chat can phân tích từ loop tiêm đến đầu đò, có tương tác với chất cần phân tích, đóng vai trò quan trọng trong việc tách các chất Pha động phải có độ tỉnh

khiết cao, cần loại bỏ các khí hòa tan trong pha động để tránh hiện tượng tạo bọt khí làm thay đổi tốc độ dòng Lưu lượng dòng phụ thuộc vào cột sắc ký sử dụng, được

kiểm soát bởi bơm và thiết bị đo áp suất

3.2.3 Bơm:

Dùng tạo áp lực giúp pha động di chuyển trong hệ thống, tạo dong ổn định ngay cả

khi thành phần pha động thay đổi Áp lực bơm sử dụng tùy thuộc vào tốc độ dòng, độ

nhớt pha động và kích thước pha tĩnh Có hai chế độ hoạt động:

Chê độ đăng dòng — isocratic mode Chê độ gradient dòng — gradient mode Thành phân pha động không thay đôi Thành phân pha động thay đổi trong

- Bộ phận tiêm mẫu được sử dụng phổ biến nhất gồm một van sáu lỗ trên có gắn

một vòng chứa mẫu (sample loop) Mẫu được tiêm vào loop bằng một xy lanh

- Yêu cầu đối với bộ phận tiêm mẫu: thể tích cho vào phải rất đều, độ lặp lại cao

3.2.5 Đầu đò:

Đầu đò là bộ phận phát hiện và ghi tín hiệu của chất cần phân tích khi nó ra khỏi

cột

- Nguyên tắc phát hiện:

+ Dựa vào sự thay đổi tính chất của pha động như chỉ số khúc xạ, độ dẫn, chất

phân tích được phát hiện gián tiếp qua sự thay đổi tính chất pha động

+ Dựa vào đặc tính của chất phân tích như độ hấp thu, sự phát huỳnh quang +Có nhiều loại đầu đò được sử dụng như: UV, UV/Vis, Photo Diode Array

(PDA), huỳnh quang (FD), điện hóa (ECD), khối phổ (MS), khúc xạ (RFD), độ dẫn

(CDD)

Bảng 3.1 Cách chọn đầu dò:

[ Đầu đò Loại hợp chất

UV/PDA Với chromophore như vòng thơm hoặc nhiều nối đôi liên hợp

FD Các hợp chất phát huỳnh quang, thường có nhiều vòng hoặc nhiều nỗi

đôi liên hợp

CDD Những hợp chất tích điện như các acid hữu cơ, các ion vô cơ

ECD Cho những hợp chat dé oxy hóa như quinon hoặc amin

RFD

3.3 Các thông số cơ bản của phương pháp sắc ký:

3.3.1 Thời gian lưu tạ:

Là thời gian để chất phân tích sau khi tiêm vào cột đến đầu dò, được tính bằng

Voi: tạ›: thời gian lưu hiệu chỉnh

tụ: thời gian lưu chết của cấu tử không bị giữ lại trên cột ( có thể được tính gần đúng theo công thức:

Hệ số dung lượng k là đại lượng quan trọng nhất trong sắc ký, mô tả tốc độ lưu của chất phân tích trong cột, được tính theo công thức:

Cs: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh, Cụ: nồng độ cấu tử trong pha động

k: tùy thuộc vào bản chất của chất tan, bản chất của pha tĩnh và pha động

Ke ov nhanh, cột Không có Khả năng giữ chất lại cột khôn, ø có kh: Xa the 122

k’ càng lớn, thời gian phân tích càng kéo dài, mũi có khả năng bị dãn rộng do

chất phân tích bị giữ lâu trong cột

Khoảng k` lí tưởng là từ 2 — 5; nhưng khi phân tích hỗn hợp phức tạp, k` có thể

œ phụ thuộc rất nhiều vào yếu tố: bản chất pha tĩnh, thành phần pha động, pH

môi trường, nhiệt độ

17

CHUONG 4: NGUYEN LY CUA DAU DO HUYNH QUANG VA

THIET BI SAC KY LONG HIEU NANG CAO - DAU DO

chuẩn đo trong cùng điều kiện

+ Phương pháp quang phổ huỳnh quang được áp dụng để phân tích các chất có khả năng phát huỳnh quang tự nhiên hoặc các chất có thể tạo ra dẫn xuất thích hợp có

khả năng phát huỳnh quang Phương pháp quang phổ huỳnh quang thường nhạy hơn

phương pháp quang phổ hấp thụ, có thể phát hiện được nồng độ chất từ 107 - 10°

Hình 4.1 Sự phát huỳnh quang của hợp chất đa vòng antracen

Do hv; thường lớn hơn hv; nên 2; thường nằm về phía sóng dài hơn so với 3

Sự địch chuyển này được gọi là sự dịch chuyển Stocke

4.2 Thiết bị Sắc ký lỏng hiệu năng cao - Đầu dò huỳnh quang của hãng

Shimađzu:

Hình 4.2.Máy HPLC

4.2.1 Thiết bị loại khí:

Thiết bị DGU-12A/DGU-14A là thiết bị loại khí trực tuyến mà khí hòa tan di

chuyển liên tục từ pha động qua buồng chân không, và từ đó đi ra khỏi thiết bị loại khí

Nối kết bộ phận này với bơm day dung môi làm cho sự loại khí liên tục của khí hòa

tan vào pha động mà không làm thay đổi thành phần pha động Kết quả là ngăn cản sự

phát sinh bọt khí từ khí hòa tan và làm giảm độ nhiễu va sự dao động nền gây ra bởi sự

thay đổi trong nồng độ khí hòa tan

Do đó cải tiến độ ổn định và độ lặp lại của qui trình phân tích HPLC

4.2.2 Bơm:

Vận hành

pittông

Bit pitting

Pha động

Hình 4.3.Cấu tạo của bơm

- Bơm LC-10ADvp có bộ đôi ống hút và đẩy dung môi Nó làm tăng độ chính xác

và độ nhạy của hệ thống HPLC

- Ưu điểm:

+ Dao động áp suất thấp

19

+ Thay đổi dung môi một cách dễ dàng

~ Nhược điểm: thay đổi cái chặn pittông

- Cột phân tích 1a c6t C-18 cia Shimadzu (25 cm x 4.6 mm x 5 pm)

- Các điều kiện của cột C-18 là:

+ pH: Độ hoạt động của silicagel và cột silicagel trong khoảng pH từ 2.0 đến 7.5 Cao hơn khoảng pH này sẽ hòa tan silicagel, tăng những lỗ trống trong cột Thấp hơn khoảng pH này có thể làm mất một vài nối Những ảnh hưởng này sẽ là nguyên nhân làm thay đổi thời gian lưu và cột mắt khả năng giữ chất phân tích

+ Dung môi: Cột pha đảo silicagel có thể được sử dụng với tất cả dung

môi hữu cơ loại HPLC thông dụng Các muối đệm acetat, citrat, format và phosphat

nồng độ trên 0.2 M được sử dụng mà không gây ảnh hưởng bắt lợi Thuốc thử cặp ion

và modifier hữu cơ cũng có thể tồn tại mà không gây trở ngại nếu không vượt khoảng

pH trên

Các acid và baz mạnh thì cần phải xem sao cho độ pH của pha động

thích hợp Phải thật cẩn thận không được trộn, hoặc sử dụng trong trình tự nào đó, mà dung dịch có thể kết tủa hoặc tạo thành thể gel trong cột hoặc trong hệ thống

+ Bảo quản cột: Khi bảo quản cột một vài ngày hoặc lâu hơn, ngâm cột với 100 - 200 ml dung môi, kế đó bịt lại bằng cái chốt đã được cung cấp Không được

bảo quản cột trong đệm, dung dịch muối, pha động có acid, hoặc tetrahydrofuran quá vài ngày

+ Bảo vệ cột: Bảo vệ tắt cả cột dự bị và cột phân tích với đầu lọc thủy

tỉnh bên trong đây thép và một cột bảo vệ

+ Thời gian sống của cột: Thời gian sống của cột cao hay thấp là tùy thuộc vào mẫu và điều kiện, và không thể được khái quát hóa

+ Áp suất: Cột HPLC chứa silicagel có thể hoạt động tại áp suất lên đến

4000 psi, ngoại trừ những cột có đường kính hơn 4.6 mm thì hoạt động ở áp suất thấp hơn 3000 psi

+ Nhiệt độ: Cét silicagel Supelco được sử dụng tốt ở nhiệt độ lên đến 75°C Nếu sử dụng ở nhiệt độ trên 75°C có thể làm giảm đời sống của cột

4.2.5 Đầu dò:

~ Độ nhạy cao:

Hệ thống quang học RF - 10AXL cung cấp độ nhạy gia tăng đáng kẻ ( tỉ số tín hiệu/ nhiễu cao hơn 300 lần phổ Raman của nước) Xa hơn nữa, việc sử dụng điều

kiện quét phổ kích thích và phát xạ thích hợp cùng với chương trình thời gian bước

sóng cho sự phát hiện có độ nhạy cao của nhiều thành phần ở nồng độ vết

~ Gia tăng độ chính xác của bước sóng:

Hệ thống quang học RF - 10AXL cho bước sóng có độ chính xác cao (không vượt quá + 2 nm) và khả năng lặp lại tốt

~ Độ an toàn cao:

Cả con cảm biến sự rò và nhiệt được cung cấp như là cấu hình chuẩn Thêm vào

đó, đèn có thể tắƯ/mở thông qua hệ thống điều khiển (SCL — 10A) hoặc Trạm làm việc: chương trình thời gian, sự tiêu hao đèn không cần thiết nhỏ nhất trong suốt quá trình

chạy không được giám sát một cách liên tục

21

CHƯƠNG 5: NGUYÊN LÝ CỦA PHỎ KHÓI LƯỢNG VÀ

THIET BI SAC KY LONG - DAU DO KHOI PHO

5.1 Khái quát về phổ khối lượng:[8][9]

Nói một cách đơn giản, máy phổ khối lượng được chế tạo để thực hiện ba

nhiệm vụ cơ bản:

~ Chuyển chất nghiên cứu thành thể khí (làm bay hơi mẫu nghiên cứu ở áp suất thấp và ở nhiệt độ thích hợp)

~ Tạo ra các ion từ các phân tử khí đó

- Phân tách các ion đó rồi ghi lại tín hiệu theo tỉ số khối lượng/điện tích (m/ze)

của chúng Bởi vì xác suất tạo thành các ion có z > 1 là rất nhỏ và vì e = const (ela điện tích của mét electron) do đó thông thường m/ze chinh 1a khdi lượng của ion Như vậy máy phổ khối lượng là một thiết bị “sản xuất” ra các ion và xác định

khối lượng của chúng (phân tích các ion)

5.1.1 Bay hơi mẫu:

Mẫu có thể được đốt nóng tới 200 — 300°C ở áp suất thấp, do đó có thể làm bay hơi cả những chất có khối lượng phân tử lớn tới 1000 nếu nó không chứa các nhóm

phân cực, hoặc có khối lượng phân tử tới 300 nếu là những phân tử phân cực vừa phải

Khối lượng mẫu chỉ cần vài micro gam

5.1.2 Cách tạo ion:

Có nhiều cách tạo ion thường được áp dụng cho máy sắc ký có đầu dò khối phổ

* lon hóa bằng bắn phá điện tử: (EI)

- Nguyên tắc:

+ Trong buồng ion hóa chân không sâu (< 10 Nm) mau phân tích ở thể khí bị

các điện tử có năng lượng cao 70 eV va chạm mạnh làm mất một điện tử, biến thành

ion đương ( ion phân tử) ( cũng có khi mẫu biến thành ion âm, nhưng khả năng này ít

- Ưu điểm: Cho biết khối lượng phân tử của mẫu phân tích, cấu trúc hóa học của phân tử mẫu thông qua các thông tin cung cấp bởi các mãnh ion

- Nhược điểm: Không áp dụng được cho những chất không bền nhiệt hoặc không

bay hơi, không phân biệt được các đồng phân

+ lon hóa hóa học: (Cl)

- Nguyên tắc:

Một khí phản ứng ( metan, iso-propan hoặc amoniac), khi được cho vào buồng

áp suất 10? Nm” sẽ bị ion hóa bằng bắn phá điện tử với nang lugng 300 eV:

- Ưu điểm: Dùng CI khi phương pháp EI không cho thấy mũi ion phân tử

- Nhược điểm: Không áp dụng được cho những hợp chất không bền nhiệt hay không bay hơi Dễ gây nhầm lẫn trong xác định ion phân tử

+ Bắn phá nhanh nguyên tử: (FAB)

- Nguyên tắc:

Trước tiên nguyên tử khí hiếm (Xenon hoặc Argon) được ion hóa, đi vào điện trường, tăng tốc va chạm các nguyên tử khí hiếm trong buồng

Xe (nhanh) + Xe (chậm) —› Xe (nhanh) + Xe" (chậm)

Các nguyên tử Xe nhanh mới hình thành, giữ nguyên động nang, di chuyển theo

hướng cũ, đập vào kim loại phủ sẵn một lớp mẫu phân tích làm ion hóa mẫu

-Uu điểm: Không cần hóa hơi mẫu, dùng được cho những chất có khối lượng phân

tử lớn và phân cực

- Nhược điểm: Xuất hiện mũi tạp, gây khó khăn cho việc giải đoán phổ Không

thích hợp cho những chất không phân cực

* Ion hóa bằng cách phun điện tir: (ESI)

- Nguyên tắc:

Kỹ thuật ion hóa bằng cách phun điện tử biến đổi ion ở thể lỏng thành ion ở thể

hơi

23

- Uu điểm: Thích hợp để phân tích các hợp chất kém bền nhiệt, khối lượng phân tử

lớn như các polymer sinh học (ví dụ như: protein, acid amin, glucoprotein,và nucleotide), c6 tính phân cực

- Nhược điểm: Những hợp chất không mang nhóm chức dễ bị ion hóa cần phải tạo

muối dẫn đến việc thành lập các sản phẩm cộng gây khó khăn trong giải đoán phổ

* lon hóa học ở áp suất khí quyển: (APCI)

- Nguyên tắc:

Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển là một kỹ thuật ion hóa mềm, nhưng không mềm như ESI

Trong loại ion dương, mẫu ion hóa xuất hiện trong một chuỗi hoạt động mà bắt

đầu với sự hình thành cation bắt nguồn từ electron Những ví dụ tiêu biểu của sự hình

thành ion ghép cặp, thứ yếu và chủ yếu được trình bày bên dưới:

Trong loại ion âm, (M - H} được hình thành một cách tiêu biểu bằng cách lấy 1

proton béi OH’

- Uu điểm: Được sử dụng để phân tích các chất có độ phân cực trung bình và dễ bay hơi

~ Nhược điểm: Không phân tích được những chất khó bay hơi

* lon hóa bằng cách giải hấp hợp chất ra khỏi chất mang bằng tia laser:(MALDI) Hợp chất khảo sát trộn với chất mang (thường là acid sinapinic, hoặc acid gentisic) Hỗn hợp này hấp thu mạnh ở bước sóng tỉa laser 355 nm Khi chiếu tia laser lên, do hỗn hợp hắp thu năng lượng lớn, chất phân tích được giải hấp ra khỏi chất mang và rồi

có sự trao đổi proton giữa chất mang bị quang hoạt với hợp chất khảo sát, biến hợp

chất khảo sát thành ion.

* Ion hóa trường: (Fl)

- Ưu điểm: Không cần phải hóa hơi mẫu Mũi ion M+ hay MH+ có cường độ mạnh Thích hợp cho những hợp chất có khối lượng phân tử lớn, ít phân cực

~ Nhược điểm: ít phân mãnh ion nên ít có thông tin về cấu trúc hóa học

5.1.3 Phân tích các ion:

Việc phân tích các ion được thực hiện ở hai khối: khối phân tách ion, khối thu nhận tín hiệu và ghi phổ

+ Khối phân tách ion:

Có nhiệm vụ phân tách chùm ion (gồm ion phân tử và rất nhiều các ion mãnh khác nhau) sao cho ở bộ phận tiếp theo có thể thu nhận được tín hiệu của từng loại ion để

ghi lại thành phổ Để đảm bảo chuyển động tự do cho các ion, ở buồng ion hóa cũng

như ở khối phân tách người ta phải hút chân không tới ~ 10-7 mmHg (thông thường

tới 10-6 mmHg) Có nhiều cách phân tách chùm ion dựa vào các định luật vật lí khác

nhau

+ Khối thu nhận tín hiệu và ghi phổ:

Để thu nhận và khuyếch đại tín hiệu của các ion người ta dùng những thiết bị khác nhau phù hợp với các cách phân tách ion Các thông tin được đưa vào máy tính Ở bộ nhớ của máy tính có chứa phổ của hàng loạt hợp chất hữu cơ có chọn lọc Khi phổ của một hợp chất nghiên cứu vừa được ghi xong, máy tính tự động so sánh với các phổ

trong bộ nhớ để nhận biết hợp chất nghiên cứu

+ Áp suất cao + Chân không sâu

+ Nhiệt độ tương đối thấp + Nhiệt độ cao

+ Các chất khảo sát ở thể lỏng + Các chất khảo sát phải ở thể khí

+ Vận tốc dòng chảy lớn (vài ml/phút | + Vận tôc dòng chảy nhỏ ( vài nl/phút)

25

Do đó, để ghép hai loại máy này với nhau cần có một giao diện:

Kỹ thuật quan trọng nhất

| HPLC

+ Các dung môi + Chân không rất

pha hữu cơ hoặc + Loại bỏ dung + Phân tích dựa

+ Các hợp chất + lon hóa phân tử ion, đặc trưng

Có hai loại giao điện API (Ion hóa áp suất thường) chinh 1a: ESI (Ion hóa phun

điện tử) và APCI (Ion hóa hóa học áp suất thường)

5.3 Thiết bị Sắc ký lỏng - Đầu đò khối phổ của Thermo:

5.3.1 Bộ tiêm mẫu tự động:

Bộ tiêm mẫu tự động được sử dụng để tiêm mẫu một cách tự động vào trong buồng

LC Bộ tiêm mẫu tự động của Thermo Electron Finnigan (Surveyor, AS3000, va

AS3500), Waters (Alliance 2690), va Agilent (1050, 1090 va 1100) có thể được điều

khiển trực tiếp từ hệ thống máy tính LCQ Với một bộ tiêm mẫu tự động như vậy,

chúng ta có thể tự động hóa việc phân tích LC/MS của mình

5.3.2 Đầu dò khối phổ:

Đầu dò khối phổ cung cấp mẫu đã được ion hóa và phân tích khối của mẫu được

tiêm vào hoặc mẫu được tách rửa từ sắc ký lỏng Đầu đò MS — LCQ sử dụng một dụng