Kết tủa protein bằng muối trung tính 1.Nguyên tắc Protein kết tủa khi nồng độ muối đạt đến một mức nhất định, do sự giảm hòatan trong dung dịch.. Giải thích -Ở ống nghiệm 1 khi cho 3ml d
Phản ứng biure
Các hợp chất có từ hai liên kết -CO-NH- trở lên kết hợp với ion Cu 2+ trong môi trường kiềm hoặc kiềm thổ tạo ra phức màu đỏ hoặc tím đỏ đặc trưng, được gọi là phản ứng Biure Các protein, với cấu trúc chuỗi chứa nhóm -CO-NH- (liên kết peptide), cũng tham gia vào phản ứng Biure Cường độ màu của phức hợp này tỷ lệ thuận với số lượng liên kết peptide có trong chuỗi protein.
2 Cách tiến hành Ống nghiệm 1 Ống nghiệm 2
Trong ống nghiệm 1, phản ứng Biure diễn ra tạo ra phức có màu tím đỏ đặc trưng nhờ vào sự liên kết -CO-NH- với ion Cu 2+ trong môi trường kiềm.
-Ống nghiệm 2: tạo ra dung dịch có màu xanh lam của Cu(OH)2 do NaOH phản ứng với CuSO4 tạo ra.
Biure tạo Cho từ Ure tinh thể
Thêm 1ml NaOH 10% thêm 1 giọt CuSO 4 2%
Protein là các chuỗi peptide có chứa liên kết peptide -CO-NH-, do đó chúng phản ứng với thuốc thử Biure, tạo ra phức hợp màu tím đỏ đặc trưng khi liên kết -CO-NH- kết hợp với ion Cu 2+ trong môi trường kiềm.
Kết tủa protein bằng muối trung tính
Protein kết tủa khi nồng độ muối đạt đến một mức nhất định, do sự giảm hòa tan trong dung dịch.
Lấy 2 ống nghiệm thực hiện như sau:
Cho 3ml dung dịch protein trứng vào ống nghiệm 1, sau đó thêm 3ml (NH4)2SO4 bão hòa Lắc đều và lọc để thu dịch lọc trong Tiếp theo, từ từ cho tinh thể (NH4)2SO4 vào ống nghiệm 2 cho đến khi không còn tan nữa, lắc đều để thu được tủa 2.
-Tủa 1 lọc ra ở ống nghiệm 1 là globulin.
-Tủa 2 thu được ở ống nghiệm 2 là albumin.
Khi cho 3ml dung dịch protein trứng vào ống nghiệm 1 cùng với 3ml (NH4)2SO4 bão hòa, thể tích dung dịch tăng gấp đôi, làm giảm nồng độ dung dịch (NH4)2SO4 xuống còn nửa, dẫn đến nồng độ bán bão hòa Ở nồng độ dung dịch (NH4)2SO4 bán bão hòa, globulin sẽ kết tủa, do đó tủa 1 sẽ thu được globulin.
Khi thêm từ từ tinh thể (NH4)2SO4 vào ống nghiệm 2 cho đến khi không còn tan, dung dịch sẽ đạt nồng độ bão hòa của (NH4)2SO4 Ở nồng độ này, albumin sẽ kết tủa, dẫn đến việc thu được albumin trong tủa 2.
Kết tủa bằng acid hữu cơ
Có nhiều tác nhân gây kết tủa protein không thuận nghịch, bài thí nghiệm này sẽ kết tủa protein bằng acid hữu cơ.
Lấy hai ống nghiệm, cho vào mỗi ống 1 ml protein trứng Thêm vào:
- Ống 1: 5 giọt TCA 10%, lắc nhẹ
- Ống 2: 5 giọt acid sunfolsalisilic 10%, lắc nhẹ.
- Ống 1: Sau khi lắc nhẹ, không xuất hiện kết tủa, màu trắng vẫn giữ nguyên ban đầu.
- Ống 2: Không như ống 1, ống 2 đã xuất hiện kết tủa sau vài giây, và ngày càng đậm dần.
Axit sunfolsalisilic là một axit mạnh có khả năng thay đổi pH của dung dịch protein Khi được thêm vào, axit này không chỉ làm giảm bề mặt protein mà còn làm giảm độ hòa tan của protein, dẫn đến hiện tượng kết tủa trong ống nghiệm.
Kết tủa protein bằng muối kim loại nặng
Các ion kim loại nặng tương tác với các nhóm chức của protein, gây biến tính và làm giảm tính hòa tan của protein, dẫn đến kết tủa.
Cho mỗi ống nghiệm1 ml dung dịch protein rồi làm các bước theo bảng sau: Ốn g Dung dịch nhỏ vào Lần 1 Lần 2
Nhỏ 1 giọt theo thành ống cho đến khi xuất hiện kết tủa.
Cho lượng thừa để xem tủa tan.
-Lần 1: Ống 1: Kết tủa màu trắng Ống 2: Kết tủa màu trắng đục. Ống 3: Không có kết tủa. Ống 4: Kết tủa màu xanh dương.
Trong lần thử nghiệm thứ hai, tất cả các ống nghiệm từ lần đầu tiên vẫn xuất hiện kết tủa, nhưng mức độ kết tủa trở nên nhạt hơn do nồng độ protein tăng cao Nếu tiếp tục bổ sung thêm protein, chất kết tủa sẽ hoàn toàn tan.
Khi dung dịch muối kim loại nặng như AgNO3, CuSO4, hoặc Pb(NO3)2 được thêm vào dung dịch protein, hiện tượng kết tủa xảy ra, tạo thành cặn ở đáy ống nghiệm Màu sắc của cặn này phụ thuộc vào loại dung dịch kim loại được sử dụng.
7 khi tham gia phản ứng.
Các ion kim loại nặng như Ag+, Cu2+, và Pb2+ có khả năng tương tác mạnh với các nhóm chức năng trên bề mặt protein, đặc biệt là nhóm amino (-NH2) và nhóm carboxyl (-COOH) Những tương tác này gây ra sự thay đổi trong cấu trúc bậc ba của protein, dẫn đến mất cấu trúc tự nhiên và kết tủa protein.
Kết tủa protein bằng nhiệt
Nhiệt độ cao gây ra sự biến tính của protein bằng cách phá vỡ cấu trúc của chúng, dẫn đến việc giảm tính hòa tan Kết quả là, protein biến tính sẽ kết tụ lại và lắng đọng khỏi dung dịch.
2.Cách tiến hành Ống nghiệm
5 2ml 5-8 giọt 5-6 giọt Đun sôi
3.Kết quả và giải thích
Hình 4 Ống nghiệm Hiện tượng Giải thích
Nhiệt độ cao có khả năng phá vỡ cấu trúc ba chiều của protein, dẫn đến việc protein không còn hòa tan trong nước và kết tụ thành dạng gel hoặc rắn.
Thêm 1% acid acetic vào dung dịch protein trứng có thể làm giảm pH của dung dịch Khi pH thấp, protein trứng có khả năng bắt đầu kết tủa, tuy nhiên, nồng độ acid acetic 1% có thể không đủ mạnh để tạo ra kết tủa đáng kể.
Thêm acid acetic 10% vào dung dịch protein trứng sẽ làm giảm pH đáng kể Nồng độ cao của acid acetic có thể hạ pH xuống dưới điểm đẳng điện của protein, gây ra hiện tượng kết tủa protein khi đun sôi.
Thêm NaOH 10% vào dung dịch protein trứng sẽ làm tăng pH, chuyển dung dịch sang môi trường kiềm Ở pH cao, protein dễ bị biến tính và kết tủa Quá trình này sẽ diễn ra rõ ràng hơn khi đun sôi.
NaOH làm tăng pH của dung dịch, trong khi NaCl bão hòa làm tăng nồng độ ion Sự kết hợp của hai yếu tố này dẫn đến việc giảm tính hòa tan của protein, gây ra hiện tượng kết tủa protein khi đun sôi.
Xác định điểm đẳng điện của protein
Điểm đẳng điện của dung dịch protein là điểm mà tại đó protein dễ dàng bị kết tủa khi thêm một lượng nhỏ các chất gây kết tủa Tính chất này được ứng dụng để xác định điểm đẳng điện của protein.
Để thực hiện thí nghiệm, bạn cần chuẩn bị 4 ống nghiệm sạch và đã sấy khô Trong mỗi ống nghiệm, cho vào dung dịch Na2HPO4 và acid citric theo tỷ lệ quy định Sau khi lắc đều, thêm albumin vào, tiếp theo là cồn, lắc nhẹ và để yên trong 5 phút Kết quả sẽ xuất hiện kết tủa trong ống nghiệm.
Acid citric 0,1 M (ml) pH tương ứng
3 Kết quả Ống nghiệm Hiện tượng Kết luận
1 Ống nghiệm kết không có kết tủa.
Giá trị pH này không phải điểm đẳng điện. 2 Ống nghiệm sau một khoảng thời gian có xuất hiện 1 ít kết tủa.
Giá trị pH này không phải điểm đẳng điện.
3 Ống nghiệm kết tủa nhanh chóng và nhiều.
Giá trị pH này là điểm đẳng điện của protein.
4 Ống nghiệm sau một khoảng thời gian có
Giá trị pH này không phải điểm đẳng điện.
11 xuất hiện 1 ít kết tủa.
=> Điểm đẳng điện (pHi hay pI) của protein khoảng 4,7.
Trong ống nghiệm 3, kết tủa xuất hiện nhanh chóng và với số lượng lớn Dung dịch protein ở điểm đẳng điện có đặc điểm dễ bị kết tủa khi thêm một lượng nhỏ chất gây kết tủa, điều này giúp xác định điểm đẳng điện của protein một cách dễ dàng.
Đông tụ sữa bằng protease
Xác định tính khử của đường đơn bằng phản ứng Fehling
Monosaccarit chứa nhóm -CHO và -C=O có khả năng khử, cho phép chúng khử ion kim loại như Cu và Fe Khi đun với dung dịch Fehling, monosaccarit sẽ tạo ra tủa màu đỏ của Cu2O do phản ứng khử Cu(OH)2 thành Cu2O.
Dùng 2 ống nghiệm cho các chất vào theo thứ tự sau: Ống nghiệm Glucose
1 2 ml 1 ml 1 ml Đun cách thủy cho xuất hiện kết tủa
- Ống nghiệm 1: có kết tủa đỏ gạch xuất hiện vì đường đơn (monosaccarit) có chứa nhóm -CHO nên mang tính khử.
- Ống nghiệm 2: cũng có kết tủa đỏ gạch xuất hiện vì có chứa nhóm -C=O nên mang tính khử, nhưng màu đậm và lượng kết tủa nhiều hơn ống nghiệm 1.
Xác định tính khử của đường đôi bằng phản ứng Fehling
Khi 2 phân tử monosaccarit kết hợp với nhau tạo một disaccarit, nếu nhóm OH glucozit của đường đơn thứ nhất kết hợp với OH alcol của đường đơn thứ hai thì đường đôi tạo thành còn mang tính khử, còn nếu nhóm OH glucozit của đường đơn thứ nhất kết hợp với nhóm OH của đường đơn thứ hai thì đường đôi tạo thành không còn mang tính khử.
1 2 ml 1 ml 1 ml Đun cách
Fehling A là dung dịch đồng (II) sunfat (CuSO 4 )
Fehling B là dung dịch kali natri tartrat (KNaC 4 H 4 O 6 )
Ống nghiệm 1 cho thấy sự xuất hiện của kết tủa đỏ gạch, điều này xảy ra do maltose, một loại đường đôi, có nhóm OH glucozit từ đường đơn thứ nhất kết hợp với nhóm OH ancol từ đường đơn thứ hai, dẫn đến tính khử của maltose.
- Ống nghiệm 2: Kết tủa đỏ gạch xuất hiện vì lactose có nhóm OH glucozit có tính khử, thế nên khi đun nóng lactose đã khử Cu 2+ thành
Cu + , và Cu + sẽ kết tủa dưới dạng Cu 2 O.
- Ống nghiệm 3: Không xuất hiện kết tủa vì saccarose có nhóm
OH glucozit của dường đơn thứ nhất liên kết với nhóm OH glucozit của đường đơn thứ 2 nên không mang tính khử.
Công thức cấu tạo của đường đôi:
Chiết xuất glycogen
Glycogen là polysaccarit dự trữ của người và động vật, có nhiều trong gan, óc, nhộng tằm
- Kết tủa màu trắng đục
Glycogen là một polysaccarit phức tạp và quá trình chiết xuất nó đòi hỏi nhiều bước, bao gồm nghiền nát và đun nóng bằng cách thủy Sau khi tách ra, glycogen vẫn chưa hoàn toàn tinh khiết và cần phải trải qua ba lần gạn bỏ phần dịch Qua quá trình này, glycogen sẽ mất khả năng hòa tan và bắt đầu kết tủa thành các hạt nhỏ màu trắng.
5g gan tươi (đã nghiền nát) + 20ml KOH 30% đã đun nóng
Cho vào cốc thủy tinh Đun và khuấy liên tục đến khi gan tan hết Để nguội, thêm 2ml Na 2 SO 4 10% + 50ml cồn 96
Tủa hình thành Để lắng, sau đó gạn bỏ phần nước
96 Để lắng, gạn bỏ phần dung dịch bên trên (lặp lại 3 lần)
Thu tủa Dồn vào lọ, để khô
Thủy phân tinh bột
Khi tinh bột được đun nóng trong môi trường acid, quá trình phân giải diễn ra, bắt đầu từ các sản phẩm trung gian và cuối cùng tạo ra maltose và glucose Các sản phẩm dextrin trung gian có phân tử lượng khác nhau và khi tác dụng với iod, chúng sẽ tạo ra các màu sắc khác nhau.
Tinh bột + iod màu xanh Amylodextrin + iod màu tím Eritodextrin + iod màu đỏ nâu Achrodextrin + iod màu vàng nâu Maltose và glucose + iod màu vàng của iod
2.1 Thủy phân tinh bột: cho vào cốc thủy tinh 10ml tinh bột 1%
+ 5ml HCl 10% đun cách thủy khoảng 7-10 phút 2.2 Kiểm tra dịch thủy phân: sau khi kết thúc phản ứng thủy phân, làm nguội rồi tiến hành như sau: Ống nghiệm
Dung dịch có màu vàng iot.
2 1ml 0,5ml 1,5ml Đun Có kết tủa đỏ gạch.
3 Giải thích: Ống nghiệm 1: dung dịch có màu vàng vì tinh bột trải qua các quá trình đun nóng trong môi trường axit thì bị phân giải hoàn toàn thành glucose và maltose nên khi cho thuốc thử I 2 /KI vào sẽ cho ra màu vàng iot. Ống nghiệm 2: xuất hiện kết tủa vì tinh bột đã bị phân giải qua quá quá trình đun nóng với axit tạo nên maltose và glucose mà những chất hữu cơ này lại mang tính khử do có nhóm -CHO, -C=O nên khử các ion kim loại của Fehling A và B (gồm có CuSO4, KNaC 4 H 4 O 6 ) nên có kết quả hiện tượng kết tủa màu đỏ gạch của Cu 2 O.
4 So sánh các giai đoạn qua hình ảnh:
Trong giai đoạn 1, ống nghiệm số 1 chứa dung dịch tinh bột chưa được đun sôi, vẫn giữ nguyên trạng thái và chưa xảy ra phản ứng hóa học với môi trường axit, do đó dung dịch có màu xanh.
Giai đoạn 2, đánh số 2, diễn ra sau khi tinh bột được đun nóng trong 10 phút Quá trình này tạo ra phản ứng với môi trường axit, dẫn đến sự xuất hiện màu tím.
Giai đoạn 3: được đánh số 3, sau khi đun với thời gian là 20 phút, tinh bột bắt đầu bị phân giải ở môi trường axit khiến nó bị màu đỏ nâu.
Giai đoạn 4, được đánh số 4, là giai đoạn trong ống nghiệm mà dung dịch đã được đun nóng trong 35 phút Thời gian đun nóng kéo dài này đã làm cho dung dịch tham gia phản ứng với Iot chuyển sang màu vàng nâu.
Việc đun nóng tinh bột trong môi trường axit đã tạo ra nhiều sản phẩm dextrin trung gian Qua các thử nghiệm phản ứng trong từng khoảng thời gian đun nóng, chúng ta có thể xác định giai đoạn của phản ứng mà mình mong muốn.
TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH
Bài 3 ĐỊNH LƯỢNG NITO TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJENDAHL
3 Nguyễn Hoàng Tiểu Mẫn – 623H0045THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2024
- Giai đoạn vô cơ hóa:
Nitơ tổng số bao gồm tất cả các dạng nitơ có trong mẫu Khi mẫu được đốt nóng với H2SO4 đậm đặc và có mặt chất xúc tác, tất cả các dạng đạm trong mẫu sẽ chuyển hóa thành dạng vô cơ (NH4)2SO4 hòa tan trong dung dịch.
Sau khi thực hiện quá trình vô cơ hóa, NH3 được loại bỏ khỏi dung dịch bằng cách sử dụng NaOH Lượng NH3 thu được được dẫn qua máy Parnas và chuyển đến một bình Erlen chứa H2SO4 với nồng độ đã biết chính xác Phản ứng giữa (NH4)2SO4 và NaOH tạo ra Na2SO4, nước và NH3.
H2O + NH3 + H2SO4 H2SO4 dư + (NH4)2SO4 Định lượng H2SO4 còn lại bằng NaOH, qua đó tính được lượng nitơ có trong mẫu.
H2SO4 dư + NaOH Na2SO4 + H2O
Hút 1ml nước mắm hoặc nước tương
H 2 SO 4 đậm đặc và 0,5g xúc tác
Dùng 1 trong các hỗn hợp:
3) Se kim loại Đun nhẹ hỗn hợp, tránh sôi Chỉ đun trào mạnh khi dung dịch chuyển sang lỏng
Thỉnh thoảng lắc nhẹ, tráng khéo léo sao cho dung dịch không dính lên thành bình Đun cho tới khi dung dịch hoàn toàn trắng
Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch định mức
Chú ý làm nguội và lắc đều
A) Rửa sạch bình Parnas-Wagner:
-Cho nước vào bình A khoảng nửa bình, thêm vài giọt methyl đỏ; thêm dung dịch
H2SO4 2N cho đến khi nước trong bình hóa đỏ, khóa van (1).
-Cho nước qua ống sinh hàn D, khóa van (2) và (3)
Đun A cho sôi đều và cho một ít nước cất vào C, mở van (2) để nước chảy nitơ xuống B, lưu ý không để nước chảy hết mà giữ lại một ít để duy trì hệ thống kín Hơi nước từ A sẽ từ từ qua E cho đến khi đạt khoảng 5 ml Cuối cùng, tắt bếp ở A để hơi nước trong máy nguội, giúp giảm áp suất.
A và B do đó nước ở B sẽ rút qua G Khi nước rút hết thêm nước vào C, mở van
(2) nước sẽ bị rút hết qua G Ta có thể làm như vậy vài ba lần Nếu nước ở G đầy, mở van (3) xả hết Xong khóa van (1), (2), (3)
-Chú ý: khi để erlen E vào hoặc lấy ra không đƣợc để hệ thống bị hở, đặc biệt là các vị trí nối 4,5,6.
-Lấy vào erlen E 10ml dung dịch H2SO4 0.1N thêm ba giọt phenolphthalein , lấp vào hệ thống
-Hút 10ml dung dịch đã vô cơ hóa nitơ từ bình định mức cho chảy từ từ vào phễu
C Đun sôi A, mở van (2) cho dịch chảy từ từ vô B Tráng phễu với nước cất (không cho nước cất ở C chảy xuống hết) Đóng van (2) Cho 10 ml NaOH đậm đặc vào C và mở (2) cho NaOH chảy từ từ, tráng phễu với một ít nước cất, đóng van (2) Quá trình cất kết thúc sau khoảng 25 phút Có thể kiểm tra xem NH3 đã cất hoàn toàn chưa bằng cách lấy E ra, đưa mẫu giấy quỳ vào đầu ống xem có đổi màu không nếu không coi như NH3 đã được cất hoàn toàn
-Tráng vòi bằng nước cất và lấy erlen E ra Tắt bếp, rửa hệ thống
-Định phân lượng H2SO4 0,1N thừa bằng dung dịch chuẩn NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt.
3.1 Tính hệ số hiệu chuẩn F của dung dịch NaOH
H2SO4(dư) + NaOH + 3 giọt phenolphtalein -> Na2SO4 + H2O
-Khi dung dịch dần chuyển sang màu hồng nhạt thì thể tích đo được là 10,3 ml
-Tính hệ số hiệu chuẩn F: F = Nồng độ thực tế c ủa NaOH
Nồng độ lí thuyết của NaOH ¿ 0 , 097
Hàm lượng nitơ trong mẫu được tính theo công thức:
X : hàm lượng nitơ. a : số ml H2SO4 đem hấp thụ NH3. b : số ml NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ H2SO4 thừa.
V : số ml mẫu đem vô cơ hóa.
0,0014 : lượng gam nitơ ứng với 1 ml H2SO4 0,1N.
F : hệ số hiệu chỉnh nồng độ dd NaOH 0,1 N.
TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH
Bài 4 ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG
3 Nguyễn Hoàng Tiểu Mẫn – 623H0045 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2024
I Định tính acid amin bằng Ninhhydrin 3
II Định lượng Nito acid amin theo phương pháp Sorensen 4
2.1 Chuẩn bị thang màu có pH 7 và pH 9,2 5 2.2 Chuẩn bị dung dịch có formol trung tính 7 2.3 Tiến hành định phân mẫu 8 2.4 Tính kết quả 9
Hình 1 4Hình 2 6Hình 3 7Hình 4 8Hình 5 8
I Định tính acid amin bằng Ninhhydrin
Khi phản ứng Ninhydrin diễn ra ở nhiệt độ cao, các acid amin sẽ bị dezamin hóa, dẫn đến sự oxy hóa nhóm COOH, tạo ra NH3 và aldehyde tương ứng Trong quá trình này, Ninhydrin cũng bị khử, hình thành diceto oxyhidren.
-Sau đó, diceto oxyhidren và NH3 mới tạo thành tiếp tục phản ứng với phân tử Ninhydrin thứ 2 tạo phức hợp có màu xanh tím.
2) Tiến hành Ống nghiệm Protein trứng Ninhydrin Gia nhiệt
1 1mL 1mL Đun nhẹ (cách thủy)
-Ống nghiệm 1: Dung dịch trong ống nghiệm chuyển sang màu xanh tím.
-Ống nghiệm 2: Không có hiện tượng gì xảy ra.
Khi Ninhydin được đưa vào phản ứng với protein ở nhiệt độ cao, nó tương tác với các nhóm amin tự do của axit amin trong protein, dẫn đến việc hình thành một phức hợp có màu xanh tím đặc trưng.
Trong ống nghiệm 2, do không có gia nhiệt, phản ứng giữa ninhydrin và protein diễn ra chậm hoặc không xảy ra, dẫn đến dung dịch trong ống nghiệm này không có sự thay đổi màu sắc rõ rệt, chỉ có sự biến đổi nhẹ nhưng không rõ ràng.
Hình 1: Định tính acid amin bằng Nihydrin.
I Định lượng Nito acid amin theo phương pháp Sorensen
Under the influence of formaldehyde (formol), amino groups undergo methyleneation, resulting in the formation of methylene derivatives of amino acids, a process known as the formal titration method.
Các hợp chất tạo thành từ acid amin là những acid mạnh hơn, có khả năng dễ dàng định phân bằng kiềm Qua đó, có thể tính toán gián tiếp lượng nito amin có trong nguyên liệu.
Khi dùng phương pháp này cần chú ý những điểm sau:
Xác định hàm lượng lipid thô bằng phương pháp Soxhlet
Lipid trong nguyên liệu được chiết xuất bằng Ether ethylic hoặc ether dầu hỏa thông qua máy Soxhlet Để xác định lượng lipid, có thể tính toán lượng mẫu bị mất đi sau khi quá trình chiết xuất hoàn tất hoặc cân khối lượng của chất béo thu được sau khi loại bỏ hoàn toàn dung môi.
Để kiểm tra xem nguyên liệu đã trích hết lipid hay chưa, bạn có thể thực hiện một trong hai cách sau: Thứ nhất, nhỏ vài giọt dung môi vào miếng giấy lọc; nếu vết loang dung môi sau khi khô không còn phân biệt được trên nền giấy trắng, điều đó có nghĩa là lipid đã được trích hết Thứ hai, nhỏ vài giọt dung môi lên miếng thủy tinh; nếu sau khi bay hơi không còn vệt chất béo nào, tức là quá trình trích xuất lipid đã hoàn tất.
3) Tính toán a) Trực tiếp: Sau khi thu hồi ether, sấy bình đến trọng lượng không đổi, phần còn lại là chất béo, cân rồi tính ra hàm lượng chất béo trong 100g chất khô của mẫu Công thức tính toán: L = ( b − a ) 100 m %.
Trong đó: a: trọng lượng bình không (g) b: trọng lượng bình không + lipid. m: trọng lượng mẫu.
Lấy khoảng 3 – 5 g nguyên liệu nghiền nhỏ, sấy khô nguyên liệu đến khối lượng không đổi ở 105°C
Cân chính xác m g đậu đã sấy( khoảng 3 -4 g), cho mẫu vào giấy, gói chặt, tránh rơi rớt, ghi lại kết quả cân m.
Cho gói mẫu vào tủ sấy khoảng 0,5h lấy ra cho vào bình hút ẩm rồi cân c (g) là khối lượng cả giấy và mẫu
Lắp đặt hệ thống hoàn lưu và cho mẫu vào trụ chiết Đổ ether vào bình cầu, đảm bảo rằng thể tích ether đạt khoảng 2/3 bình Trước khi chiết, cần rửa sạch và sấy khô bình cầu.
Mở nước ống sinh hàn và bắt đầu quá trình chiết Đảm bảo ether sôi đều và nhẹ, điều chỉnh số lần rút ether từ trụ chiết vào bình cầu khoảng 15 lần trong 1 giờ.
Quá trình chiết tiến hành khoảng 10 – 12h
Để thu hồi ether, trước tiên lấy bình cầu chứa ether và lipid hòa tan ra khỏi hệ thống, sau đó lắp ống sinh hàn và tiến hành chưng cất Đối với phương pháp gián tiếp, lấy gói mẫu ra khỏi trụ, sấy khô đến khi đạt trọng lượng không đổi, cân trọng lượng d(g) và tính toán theo công thức: L = (c − d) 100 m %.
Trong đó: m: trọng lượng mẫu (g.) c: trọng lượng giấy lọc + mẫu trước khi chiết (g) d: trọng lượng giấy lọc + mẫu sau khi chiết (g).
*Theo kết quả thí nghiệm thu được, ta có: c = 1,7483(g) ; d =1,4556 (g) ; m = 1,054 (g).
Xác định các chỉ số của chất béo
Để đảm bảo quy trình an toàn và hiệu quả, tất cả các dụng cụ cần phải được vệ sinh sạch sẽ và sấy khô trước khi sử dụng Thực hiện chỉ số xà phòng trước và trong quá trình đun cách thủy sẽ giúp tiết kiệm thời gian và kiểm soát chỉ số acid một cách hiệu quả.
1) Chỉ số acid a) Nguyên tắc
- Chỉ số acid là số mg KOH cần để trung hòa các acid béo tự do có trong
1 g chất béo RCOOH + KOH → RCOOK + H2O.
- Dựa vào lượng KOH dùng để trung hòa các acid, tính chỉ số acid. b) Thực hiện
Lấy vào erlen sạch và khô chính xác 3g chất béo (dầu ăn), thêm vào 30mL (dùng ống đong) hỗn hợp rượu ethylic – ether ethylic (tỉ lệ
1:1), lắc đều để hòa tan chất béo
Nếu sau khi lắc chất béo chưa hòa tan hết có thể vừa đun cách thủy nhẹ, vừa lắc đều rồi làm nguội
Cho vào 3 giọt phenolphtalein rồi chuẩn độ bằng dung dịch KOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng
Thực hiện 3 lần, tính ra 3 giá trị Ax rồi lấy giá trị
Ax trung bình vì m có thể khác nhau
Dùng HCl 0,1N chuẩn để tìm F của dung dịch KOH 0,1N( xem trang
Chỉ số acid (Ax) được tính theo công thức:
Ax = 5,611 m F b Với b: số mL dung dịch KOH 0,1N dùng để chuẩn độ m: lượng mẫu dùng để thí nghiệm
F: hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch KOH 0,1N.
Hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch KOH 0,1N: F = 0,88.
= Chỉ số axit trung bình: 0,656 (mg)
2) Chỉ số xà phòng hóa a) Nguyên tắc
Chỉ số xà phòng hóa là số mg KOH cần để trung hòa các acid béo tự do cũng như các ester có trong 1 g chất béo.
Để xác định chỉ số xà phòng hóa của chất béo, cần cho mẫu chất béo tác dụng với lượng dư KOH để xà phòng hóa hoàn toàn Sau đó, xác định phân lượng KOH còn dư bằng cách sử dụng HCl.
Cho vào erlen nút nhám (hay bình cầu) sạch và khô 1g chất béo Thêm 20mL (dùng
Pipett) dung dịch KOH 0,5N trong rượu và 20mL (dùng ống đong) rượu ethylic
Lắc đều, đậy bình bằng nút có lắp ống sinh hàn và đun sôi cách thủy trong 1h Làm nguội hỗn hợp
Cho 3 giọt phenolphtalein rồi chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,5N cho đến khi mất màu hồng
Thực hiện ít nhất 1 lần lặp lại, tính ra các giá trị Xp rồi lấy giá trị Xp tung bình vì m có thẻ khác nhau
Làm mẫu trắng để kiểm chứng: tương tự thay khối lượng chất béo, bằng nước cất, không cần đun cách thủy
Dùng dung dịch HCl 0,5N để tìm F1 của KOH( xem trang
Với: a : lượng dung dịch HCl 0,5N dùng để chuẩn độ mẫu kiểm chứng b : lượng dung dịch HCl 0,5N dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm.
F1 : hệ số hiệu chỉnh nồng độ KOH 0,5N
28,05 : lượng mg KOH có trong 1mL KOH 0,5N m : khối lượng mẫu cân chất béo (g)
*Kết quả thu được sau thực nghiệm: a = 12,8 (mL); b= 0,4 (mL); F= 0,92; m = 1,0454(g)
Là số mg KOH cần dùng để xà phòng hóa các ester có trong 1g chất béo
TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH
Bài 8 ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C VÀ KHẢO
SÁT CÁC ENZYME HÔ HẤP
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2024
II CÁC ENZYME HÔ HẤP 6
Acid ascorbic, hay còn gọi là vitamin C, là một hợp chất chưa no có chứa nhóm endiol Hợp chất này rất dễ bị phá hủy bởi các chất oxy hóa, nhưng lại có độ bền cao trong môi trường acid.
Phương pháp xác định acid ascorbic dựa trên nguyên tắc oxy hóa thuận nghịch của nó, nhờ vào nhóm endiol - C(OH)=(OH)C- trong phân tử Chúng tôi sử dụng phương pháp chuẩn độ KIO3/KI để xác định nồng độ của acid ascorbic thông qua các phản ứng hóa học liên quan.
Cho mẫu vào cối, đổ HCl
Lọc chuyển vào bình định mức Hút 10mL dịch chứa vitamin
C từ bình định mức vào erlen.
Thêm vài giọt hồ tinh bột 1% vào dung dịch KIO 3/KI 0,01N cho đến khi xuất hiện màu xanh Lặp lại quá trình định phân này ba lần Tiến hành kiểm chứng bằng cách thay dịch chứa vitamin C bằng HCl.
Sau khi chuẩn bị các bình erlen với hồ tinh bột, hãy theo dõi sự xuất hiện của màu xanh nhạt Ghi lại thể tích cần chuẩn độ của bình mẫu để đảm bảo kết quả chính xác.
3 bình chứa vitamin Từ đây, ta áp dụng công thức tính toán để biết hàm lượng của vitamin C trong mẫu.
Hàm lượng vitamin C trong mẫu được tính theo công thức: x = ( a− b ) 0 , 88 100 Vdm
Hàm lượng vitamin C (mg/100mL hoặc mg/100g) được tính bằng công thức: Vm = a - b, trong đó a là số mL KIO3/KI 0,01N dùng để chuẩn độ mẫu chứa vitamin C, và b là số mL KIO3/KI 0,01N dùng để chuẩn độ mẫu kiểm chứng.
0,88 là số mg acid ascorbic ứng với 1mL dung dịch KIO3/KI 0,01N
Vdm là thể tích bình định mức.
Vm là thể tích hoặc khối lượng mẫu ban đầu.
*Tiến hành thí nghiệm với bình định mức 50 ml và thể tích dung dịch mẫu ban đầu là 10ml:
Lần đo V(ml) dd KIO3/KI
*Ta có: a tb ¿ V 1+ V 3 2+ V 3 = 0 , 50+ 0 , 3 55+ 0 ,50 ≈ 0,52 (ml) a= 0,52(ml) ; b=0,10(ml) ; V dm P(ml) ; V m (ml) x= ( a− b ) 0 , 88 100 Vdm
Vậy hàm lượng vitamin C có trong mẫu là 18,48 mg/100ml
CÁC ENZYME HÔ HẤP
Dehydrogenase là nhóm enzym oxi hóa khử, có chức năng xúc tác phản ứng tách H từ cơ chất trong giai đoạn đầu của chuỗi hô hấp Enzym này đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp.
Cho ống nghiệm 1: vài lát củ cải cắt mỏng Ống nghiệm 2: không chứa củ cải
Thêm dung dịch xanh Methylene 0,01% ngập củ cải 1 cm Đổ lên trên một lớp dầu lửa Đặt ống nghiệm vào nước ấm 40 0 C trong 30 phút
3 Kết quả: Ống nghiệm 1: Hiện tượng mất màu xanh của Methylene. Ống nghiệm 2: Vẫn còn màu xanh của Methylene.
Khi xanh methylene (C₁₆H₁₈ClN₃S) tương tác với các chất chống oxy hóa có trong củ cải, như vitamin C hoặc polyphenol, quá trình oxy hóa xảy ra, dẫn đến sự hình thành chất bị oxi hóa và làm mất màu xanh của dung dịch.
Ống nghiệm 2: Sự hiện diện của nhóm Cl- trong Methylene khi hòa tan trong dầu lửa tạo ra một lớp màu xanh đặc trưng tại vùng tiếp xúc, trong khi phần lớn dung dịch vẫn duy trì màu xanh này.
Catalase là loại enzyme Hemoproteit Ở tế bào thực vật catalase chứa một nhóm Hem Khi enzyme xúc tác Fe nhóm ngoại không thay đổi hóa trị.
Thêm 10mL nước cất nghiền đều
Hút 0,5mL dịch lọc cho vào một ống nghiệm đã có 2mL