BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA HỌC VÀ HÓA SINH THỰC PHẨM

- Phương pháp Wohlgemuth xác định hoạt tính enzyme amylase dựa vào việc tìm nồng độ enzyme nhỏ nhất để thủy phân một lượng tinh bột xác định với những điều kiện xác định đến các sản phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA HỌC VÀ HÓA SINH THỰC PHẨM

BÀI 6: ENZYME

GVHD: CÔ NGUYỄN THỊ NGUYÊN

NHÓM: 02

TP Hồ Chí Minh, 2023

1 Thí nghiệm 1 – Xác định hoạt tính enzyme Amylase theo phương pháp

1.1 Nguyên tắc

- Amylase la enzyme thủy phân tinh bột thành các loại dextrin, maltose, glucose

- Phương pháp Wohlgemuth xác định hoạt tính enzyme amylase dựa vào việc tìm nồng độ enzyme nhỏ nhất để thủy phân một lượng tinh bột xác định với những điều kiện xác định đến các sản phẩm không đổi màu dung dịch I2 0,3% / KI 3%

- Đơn vị đo hoạt độ Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân 1mg tinh bột sau 30 phút ở 370C có C l− ¿ ¿

làm chất hoạt hóa

1.2 Dụng cụ - thiết bị

- Ống nghiệm ϕ 18, kẹp ống nghiệm

- Chén cân, muỗng cân, bình định mức 100ml

- Phễu lọc, giấy lọc, erlen 100ml

- Pipep 1ml

- Ống bóp, bình tia, giấy thấm

1.3 Nguyên liệu, hóa chất

- Malt hạt 10g

- Dung dịch tinh bột 0,5% (đã hồ hóa hoàn toàn)

- Dung dịch NaCl 0,5%

- Dung dịch H2SO4 10%

- Thuốc thử Liugol

α dextrin + Maltose + Glucose

E α amylase (Termamyl) Tinh bột

(ⅇndondo; lk 1,4; bất kì)

3-5 glucose

1.4 Các bước tiến hành

Bước 1: Chuẩn bị dịch chiết enzyme amylase

1 Cân chính xác 10g malt hạt bằng cân 2 số lẻ, nghiền nhỏ bằng cối sau đó đem chuyển vào bình định mức 100ml, định mức đến 100ml lắc hật kỹ

2 Ngâm malt trong 60 phút, thỉnh thoảng lắc đều dịch trong bình định mức

3 Lọc dịch qua 2 lớp giấy lọc mịn thu được dung dịch trong suốt chứa enzyme amylase (nên hồi lưu khoản 5-10ml dịch lọc ban đầu, đến khi thu được dịch trong

Hình 1: Malt hạt sau khi được ngâm 60 phút và chiết

Bước 2: Khảo sát hoạt tính enzyme amylase

1 Lấy 10 ống nghiệm ϕ 18 đánh số thứ tự từ 1 đến 10

2 Hút vào mỗi ống nghiệm 1ml dung NaCl 0,5%

3 Cho vào ống nghiệm (1) 1ml dịch chiết enzyme amylase từ malt và lắc kĩ Sau đó lấy 1ml từ ống nghiệm (1) cho vào ống nghiệm (2) và lắc kỹ Lập lại tương tự cho các ống tiếp theo cho đến ống thứ (10) thì hút 1ml và bỏ đi

Lưu ý: Pipep 1ml sau mỗi lần hút phải đảm bảo khô và sạch để tránh dẫn đến kết quả có

sai số lớn và kết quả sai

4 Cho tiếp vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịc tinh bột 0,5%, lắc đều, để vào tủ điều nhiệt

ở 37°C, thỉnh thoảng lại lắc đều để lôi kéo các hạt tinh bột bám ở thành ống nghiệm xuống Sau 30 phút lấy ra, thêm vào mỗi ống nghiệm 1ml H2SO4 10% (chấm dứt hoạt tính enzyme) và 2 giọt thuốc thử Liugol, rồi lắc đều và quan sát sự thay đổi màu ở các ống nghiệm

1.5 Kết quả thí nghiệm

Hình 2: Kết quả thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme amylase

- Dựa trên kết quả thí nghiệm ta thấy: 5 ống nghiệm đầu thủy phân hoàn toàn, ống (6) thủy phân 1 nửa và ống (7) thủy phân một ít nên ta thấy màu nâu đậm, 3 ống còn lại ta thấy hầu như không thủy phân

- Khi dịch chiết enzyme được pha loãng theo cấp số nhân (qua 10 ống nghiệm) thì ta thấy đến ống số (6) và ống (7) có màu cam và nâu là vì nồng độ enzyme còn lại ít không đủ để thủy phân hoàn toàn tinh bột nên hai màu khác với 5 ống đầu Còn 3 ống cuối có màu xanh vì lượng enzyme không còn nên không thể thủy phân tinh bột

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Nồng độ enzyme n/2 n/4 n/8 n/

16

n/

32

n/64 n/

128

n/

256

n/

512

n/ 1024

Bảng 1: Kết quả thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme amylase

- Tính kết quả:

Lượng enzyme cho vào ống nghiệm (1): n = mV 1 V 2 = 101004×1 = 100

Trong đó: V1 – thế tích dịch chiết enzyme amylase cho vào ống nghiệm (1), ml

V2 – thể tích dịch chiết enzyme amylase, ml

m - Khối lượng malt dùng để trích chiết enzyme amylase, mg

Một đơn vị Wohlgemuth: W = 5 F n = 5× 32100 = 0,625

Trong đó F – độ pha loãng chọn được từ bàng trên

Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzyme: Nw = V 1 W n = 1× 0,625100 = 160

1.6 Nhận xét và biện luận

2 Thí nghiệm 2 – Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ và pH đến khả năng thủy phân tinh bột của enzyme amylase

2.1 Nguyên tắc

- Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, vì thế hoạt tính xúc tác của enzyme

bị giới hạn bởi những điều kiện phản ứng như nhiệt độ, pH nồng độ enzyme

- Amylase là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột thành các loại dextrin, maltose

và glucose Trong hệ tiêu hóa, enzyme alpha amylase có trong nước bọt sẽ bắt đầu thủy

phân tinh bột đã hồ hóa trong thức ăn, và các amylase còn lại sẽ kết thúc quá trình thủy phân tạo glucose thấm qua thành ruột

- Mục đích của thí nghiệm là kiểm tra ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ, nồng độ pH đến khả năng thủy phân của enzyme amylase

2.2 Dụng cụ - thiết bị

- Ống nghiệm ϕ 18, kẹp ống nghiệm

- Pipep 1ml, pipep 5ml

- Ống nhỏ giọt

- Tủ ấm

- Đĩa thủy tinh

2.3 Hóa chất

- dung dịch tinh bột 1,0%

- dung dịch glucose 0,5%

- thuốc thử Liugol: 0,3% I2 / dd KI 3%

- dịch chiết enzyme amylase

- dung dịch đệm pH=3,0 – 4,0 – 5,0 – 6,0

2.4 Cách tiến hành

1.Tạo ống màu mẫu

Bước 1: Ở ống nghiệm (1) cho 2ml dung dịch tinh bột 1,0% + 3 giọt thuốc thử Liugol Bước 2: Ở ống nghiệm (2) cho 2ml dung dịch glucose 0,5% +3 giọt thuốc thử Liugol

Hình 3: Ống mẫu

TN2.1 Kiểm tra ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme amylase

Bước 1: Lấy 2 ống nghiệm ϕ 18 và đánh dấu

Bước 2: Hút vào mỗi ống nghiệm theo thứ tự: 5,5 ml dung dịch đệm pH=6,0 + 4 ml dung

dịch tinh bột 0,5% + 0,5 ml dịch chiết enzyme amylase (tổng cộng 10 ml)

Bước 3: Cho 2 ống nghiệm vào môi trường nhiệt độ tương ứng (1)-50 ℃ và (2)-70℃

Bước 4: Kiểm tra kết quả: sau 15 phút phản ứng, lấy từ mỗi ống nghiệm 1 giọt mẫu, nhỏ

phân biệt trên đia thủy tinh, thêm một giọt thuốc thử Liugol và xem màu

- Xác định thời gian thủy phân: Lấy mẫu định kỳ sau mỗi 3 phút, lấy từ mỗi ống nghiệm một giọt mẫu, nhỏ phân biệt trên đĩa thủy tinh, thêm 1 giọt thuốc thử Liugol và xem màu Tiếp tục cho đến khi màu giọt mẫu giống ống màu mẫu số 2

TN2.2 Kiểm tra ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme amylase

Bước 1: Lấy 4 ống nghiệm ϕ 18 và đánh dấu từ 1 - 4

Bước 2: Hút vào mỗi ống nghiệm theo thứ tự: 5,5 ml dung dịch đệm + 4 ml dung dịch

tinh bột 0,5% + 0,5 ml dịch chiết enzyme amylase (pH thí nghiệm: 3,0 – 4,0 -5,0 – 6,0)

Bước 3: Kiểm tra kết quả: sau 15 phút phản ứng, lấy từ mỗi ống nghiệm 1 giọt mẫu, nhỏ

phân biệt trên đia thủy tinh, thêm một giọt thuốc thử Liugol và xem màu

- Xác định thời gian thủy phân: Lấy mẫu định kỳ sau mỗi 3 phút, lấy từ mỗi ống nghiệm một giọt mẫu, nhỏ phân biệt trên đĩa thủy tinh, thêm 1 giọt thuốc thử Liugol và xem màu Tiếp tục cho đến khi màu giọt mẫu giống ống màu mẫu số 2

2.5 Kết quả thí nghiệm

Hình 4: Kết quả TN2.1

Hình 5: Kết quả TN2.2

Ở thí nghiệm này cả 4 ống nghiệm với pH thí nghiệm lần lượt là 3,0 – 4,0 -5,0 – 6,0 sau 3 phút khi nhỏ dung dịch Liugol vào đều không xuất hiện màu tím mà chỉ có vàng nhạt của Liugol, điều này chứng minh enzyme amylase đã thủy phân hoàn toàn tinh bột

Tuy nhiên về mặt lý thuyết thì enzyme amylse hoạt động tối ưu trong vùng pH 5,8 – 6,5 nhưng kết quả mà nhóm có được với thời gian nhanh nhất mà 4 ống nghiệm đều cho ra kết quả như nhau có thể là do các thao tác trong phòng thí nghiệm như:

3 Thí nghiệm 3 – Tính đặc hiệu của enzyme

3.1 Nguyên tắc

- Tính đặc hiệu của enzyme thể hiện khả năng lựa chọn xúc tác chuyển hóa một hay một

số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định tùy vào cấu tạo của TTHĐ, chẳng hạn

ở thí nghiệm này enzyme amylase chỉ thủy phân tinh bột, enzyme invertase chỉ thủy phân saccharose

- Saccharose không phản ứng với dung dịch thuốc thử Fehling vì trong phân tử không có chức aldehyde hoặc keton, nhưng phản ứng này có thể xảy ra khi saccharose bị thủy phân

- Khi đun đường khử với dung dịch thuốc thử Fehling thì sẽ xuất hiên kết tử đỏ gạch

Cu2O (vì đưởng khử đã khử Cu (OH )2 có trong dung dịch thuốc thử Fehling tạo thành

Cu2O)

3.2 Dụng cụ - thiết bị

- Ống nghiệm

- Pipep 10ml

- Tủ ấm

- Nồi cách thủy

- Bếp điện

3.3 Hóa chất

- Dung dịch enzyme amylase, enzyme invertase

α dextrin + Maltose + Glucose

E α amylase (Termamyl) Tinh bột

(ⅇndondo; lk 1,4; bất kì)

3-5 glucose

E invertase, t°

Glucose + Fructose Saccharose

- Thuốc thử Liugon, hồ tinh bột 1%, saccharose 5%

- Thuốc thử Fehling

3.4 Cách tiến hành

Bước 1: Chuẩn bị 4 ống nghiệm, ống (1) và (2) cho 5 ml dung dịch saccharose 5%, ống

(3) và (4) cho 5 ml dung dịch hồ tinh bột 1%

Bước 2: Thêm tiếp vào ống (1) và (3) mỗi ống 1 ml dung dịch enzyme invertase, ống (2)

và (4) mỗi ống 1ml dung dịch enzyme amylase, lắc đều và để vào tủ ấm ở 37℃ trong 15 phút

Bước 3: Lấy ống nghiệm ra khỏi tủ, cho vào ống (1) và ống (2) mỗi ống 5 ml dung dịch

Fehling và đặt vào bể điều nhiệt đang sôi trong 2 phút thì lấy ống nghiệm ra, làm nguội tới nhiệt độ phòng Cho vào ống (3) và (4) mỗi ống 2 giọt tuốc thử Liugon

Hình 5: Qúa trình phản ứng với thuốc thử Fehling

3.5 Kết quả thí nghiệm

Hình 6: Kết quả thí nghiệm tính đặc hiệu của enzyme -Theo kết quả thí nghiệm: ống (1) xuất hiện kết tủa nâu đỏ Cu2O, ống (2) dưới đáy ống nghiệm có xuất hiện 1 ít kết tủa nâu đỏ, ống (3) có màu tím và ống (4) dung dịch trong suốt ánh vàng (vì dung dịchh thuốc thử lugol đã pha loãng 10 lần để tránh màu quá đậm)

Biện luận:

- Ở ống nghiệm (1) xuất hiện kết tủa nâu đỏ vì enzyme invertase đã xúc tác cho phản ứng thủy phân saccharose tạo thành glucose và fructose (chứa nhóm aldehyde và keton) Khi đun đường khử với dung dịch thuốc thử Fehling thì sẽ xuất hiên kết tử đỏ gạch Cu2O

- Riêng ở ống nghiệm (2), về mặt lý thuyết amylase không xúc tác cho phản ứng thủy phân saccharose cho nên không có sự xuất hiện của nhóm OH glucoside tự do nên không

có tính khử dẫn đến không tạo kết tủa Tuy nhiên, ta lại thấy có 1 ít kết tủa ở đáy ống nghiệm điều này có thể là do hóa chất không tinh khiết hoặc nhiệt độ quá cao dẫn đến việc thủy phân một phần saccharose tạo thành glucose và fructose

- Ở ống nghiệm (3) có màu tím là vì enzyme invertase không có khả năng xúc tác cho phản ứng thủy phân tinh bột, khi này nhỏ dung dịch liugol vào thì xuất hiện màu tím Ở ống nghiệm (4) thì ta lại thấy dung dịch trong suốt ánh vàng là vì enzyme amylase xúc tác

cho phản ứng thủy phân tinh bột, khi này tinh bột đã được thủy phân hoàn toàn vì vậy khi nhỏ dung dịch Liugol vào không thấy màu xanh xuất hiện