ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH LÝ HUYẾT SẮC TỐ

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮTARMS Hệ thống khuếch đại các đột biến bền với nhiệtASO Phương pháp sử dụng đầu dò CE Điện di mao quản DCIP Dichlorophenolindophenol DGGE Denaturing gradient gel elect

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

BỘ MÔN HUYẾT HỌC

Chuyên đề ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH LÝ

Cần Thơ, 20224

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

Chuyên đề ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN

TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH

LÝ HUYẾT SẮC TỐ

Chuyên ngành: Kỹ thuật Xét nghiệm y học

Người hướng dẫn: TS.BS LÊ THỊ HOÀNG MỸ

Cần Thơ, 2024

MỤC LỤC

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH v

DANH MỤC BẢNG vi

MỞ ĐẦU vii

NỘI DUNG 1

1 Đại cương huyết sắc tố 1

1.1 Nhắc lại cấu trúc huyết sắc tố 1

1.2 Huyết sắc tố bình thường 1

1.3 Huyết sắc tố bệnh lý 2

2 Các kỹ thuật sàng lọc 5

2.1 Tổng phân tích tế bào máu ngoại vi 5

2.2 Phết máu ngoại vi 6

2.3 Nhuộm hồng cầu lưới và thể vùi HbH 6

2.4 Khảo sát sức bền thẩm thấu hồng cầu (OF test) 7

2.5 Định lượng HbF dựa vào hiện tượng thoái biến trong môi trường kiềm 7

2.6 Phân bố HbF trong tế bào 8

2.7 Xác định HbE bằng DCIP test 8

3 Xét nghiệm chẩn đoán 9

3.1 Phân tích thành phần hemoglobin 9

3.1.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 9

3.1.2 Phương pháp điện di 10

3.1.2.1 Tập trung đẳng điện 10

3.1.2.2 Điện di mao quản 11

3.2 Tổng hợp chuỗi globin 14

3.3 Chẩn đoán phân tử 15

3.3.1 Chẩn đoán những đột biến đã biết 15

3.3.2 Chẩn đoán các đột biến chưa biết 24

3.4 Chiến lược chẩn đoán [6] 32

4 Các công nghệ mới trong sàng lọc và chẩn đoán bênh haemoglobin 39

4.1 Phân tích Microarray (Gene-chip) 39

4.2 Phân tích nóng chảy độ phân giải cao - High Resolution Melting Analysis (HRMA) 45

4.3 Giải trình tự thế hệ tiếp theo - Next Generation Sequencing (NGS) 46

KẾT LUẬN 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ARMS Hệ thống khuếch đại các đột biến bền với nhiệtASO Phương pháp sử dụng đầu dò

CE Điện di mao quản

DCIP Dichlorophenolindophenol

DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis

DNA Deoxyribonucleic acid

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

mARN Ribonucleic acid thông tin

MPLA Kỹ thuật khuếch đại đầu dò phụ thuộc nhiều ligationPCR Phản ứng chuỗi polymerase

RDB Dot blot ngược

APEX Arrayed Primer EXtension

NGS Next Generation Sequencing

HRMA High Resolution Melting Analysis

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Tran

g

Hình 1.1 Cấu trúc huyết sắc tố 1

Hình 1.2 Những thay đổi về chất và số lượng trong chuỗi globin trong quá trình phát triển của con người 2

Hình 2.1 Thay đổi hình thái hồng cầu trên phết máu ngoại vi 6

Hình 2.2 Kết quả DCIP qua các trường hợp 8

Hình 3.1 Nguyên lý hoạt động của hệ thống điện di mao quản 11

Hình 3.2 Ví dụ về điện di xenlulo axetat 13

Hình 3.3 Ví dụ về điện di trên gel agar 1 Lanes 1,4: người lớn bình thường 2 HbS/β+-thalassemia 3 HbS/β 0 -thalassemia 14

Hình 3.4 Nguyên lý của kỹ thuật lai dot blot ngược 16

Hình 3.5 Sơ đồ mô tả sự hình thành gap-primer-PCR 17

Hình 3.6 Gel ARMS-PCR để chẩn đoán bệnh betα-thalassemia 19

Hình 3.7 Cấu tạo đoạn dò 29

Hình 3.8 Nguyên tắc kỹ thuật MLPA 30

Hình 4.1 Sơ đồ tổng quan về phạm vi phủ sóng của đầu dò Nimblegen 43

Hình 4.2 Phát hiện hai đột biến mất đoạn α 0 -thalassemia bằng dãy mảnh tùy chỉnh Nimblegen: kết quả aCGH cho 3 bệnh nhân được trình bày dưới đây là sơ đồ trình bày của vùng 2Mb của 16p chứa cụm gen α-globin được bao phủ bởi các oligonucleotide 'lát gạch' chồng chéo đầu dò Bệnh nhân A và B là người mang gen mất đoạn Nam Phi ( SA) và bệnh nhân C là người mang gen mất đoạn JB 44

DANH MỤC BẢNG

TrangBảng 1 Các phương pháp phân tích đột biến đã biết trên gen globin 23Bảng 2 Các thuận lợi và bất lợi của các phương pháp được sử dụng phổ biến nhất đối với các đột biến chưa biết 30Bảng 3 Các phương pháp phân tích DNA chẩn đoán bệnh

hemoglobin 37

Chuyên đề nghiên cứu này tập trung vào "Ứng dụng kỹ thuậtsinh học phân tử trong xét nghiệm chẩn đoán bệnh lý huyết sắctố" nơi chúng ta sẽ đi sâu vào những phương pháp và ứng dụngcủa các công nghệ sinh học phân tử hiện đại trong lĩnh vực xétnghiệm huyết học Đây không chỉ là một bước quan trọng trongviệc hiểu rõ hơn về các cơ chế tế bào và các quá trình sinh học,

mà còn là chìa khóa mở ra những cơ hội lớn trong chẩn đoán, theodõi và điều trị các bệnh lý

Cũng như mọi công nghệ khác, sinh học phân tử không phải lúcnào cũng hoàn hảo Có những thách thức cụ thể mà lĩnh vực nàyđang phải đối mặt, bao gồm vấn đề về chi phí, độ chính xác, vàcác vấn đề đạo đức và pháp lý liên quan đến việc sử dụng thôngtin genetis Tuy nhiên, với sự tiến bộ không ngừng trong nghiêncứu và phát triển công nghệ, sinh học phân tử vẫn đang mở ranhững triển vọng mới cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh tật.Với sự đổi mới không ngừng trong lĩnh vực này, chúng ta hyvọng rằng chuyên đề này sẽ giúp độc giả có cái nhìn toàn diện và

hiểu biết sâu sắc hơn về vai trò quan trọng của kỹ thuật sinh họcphân tử trong xét nghiệm chẩn đoán bệnh lý huyết sắc tố, đồngthời thúc đẩy sự phát triển và ứng dụng ngày càng rộng rãi củachúng trong lĩnh vực y tế và nghiên cứu khoa học.

NỘI DUNG

1 Đại cương huyết sắc tố

1.1 Nhắc lại cấu trúc huyết sắc tố

Huyết sắc tố là một protein có màu, được cấu tạo do sự phốihợp của hem và globin Hem được cấu tạo bởi một khungporphyryl gắn với một nguyên tử sắt hai (Fe++) [1]

Hình 1.1 Cấu trúc huyết sắc tố

(Nguồn: Pathophysiology, 2012)Globin do 4 chuỗi polypeptid hợp thành hai đôi giống hệt nhautạo nên dây alpha, bêta, gamma và delta Sự tổng hợp các dâynày do nhiều gen khác nhau chỉ đạo, có hai loại gen chính [1]:

- Gen cấu trúc: chịu trách nhiệm về tính chất và thứ tự các acid

amin của dây polypeptid Khi gen này bị hư hại sẽ có các dâypolypeptid bất thường

- Gen kiểm soát: chịu trách nhiệm điều hoà sự tổng hợp các dây

polypeptid Nó có sự điều hoà sản xuất giữa dây alpha và các dâykhác Nếu gen kiểm soát bị hư hại thì tỷ lệ sản xuất giữa các chuỗi

sẽ bị thay đổi

1.2 Huyết sắc tố bình thường

- Huyết sắc tố A (alpha 2 beta 2): 95 - 99% trên một tuổi vàngười lớn.

- Huyết sắc tố A2 (alpha 2 delta 2): 1,5 - 3% trên một tuổi vàngười lớn

- Huyết sắc tố F (alpha 2 gamma 2): 80 - 90% lúc mới sinh, 2% sau một tuổi

1 Huyết sắc tố Bart’s chỉ có ở giai đoạn đầu thai nhi (gamma 4):nếu vẫn tồn tại

thì thai nhi sẽ chết [1]

Hình 1.2 Những thay đổi về chất và số lượng trong chuỗi

globin trong quá trình phát triển của con người

1.3 Huyết sắc tố bệnh lý

1.3.1 Thalassemia

Thalassemia là một nhóm bệnh thiếu máu tan máu bẩm sinh

do đột biến gen globin gây nên thiếu hụt tổng hợp một hay nhiều

mạch polypeptid trong chuỗi globin của hemoglobin Bình thườngphân tử huyết sắc tố là α2β2 có sự cân bằng giữa tổng hợp chuỗialpha (α), beta (β) Quá trình tổng hợp một chuỗi bị rối loạn sẽgây thiếu loại chuỗi đó và thừa chuỗi còn lại làm xuất hiện tìnhtrạng bệnh lý Nếu tổng hợp thiếu hoặc không tổng hợp đượcchuỗi α sẽ gây bệnh α-thalassemia Nếu tổng hợp chuỗi β bị hạnchế hay ngừng hẳn sẽ gây ra bệnh β-thalassemia Tùy theo sựthiếu tổng hợp chuỗi α, β mà gọi là α-thalassemia hay β-thalassemia [8].

1.3.1.1 α-thalassemia

Là do giảm hoặc mất hẳn sự tổng hợp chuỗi α-globin Các gen

α nằm trên nhiễm sắc thể số 16, nếu vùng gen đó tổn thươngkhông tổng hợp được chuỗi gọi là α0-thalassemia, nếu tổn thươngnhưng vẫn tổng hợp được chuỗi α với số lượng ít được gọi là α+-thalassemia [2], [7]

Các thể bệnh α-thalassemia được chia như sau [2]:

- Thể α2-thalassemia (α-thalassemia thể ẩn): mất một trongbốn gen α, không có biểu hiện lâm sàng và huyết học

- Thể α1-thalassemia (α-thalassemia thể nhẹ): mất hai trongbốn gen α, biểu hiện lâm sàng và huyết học nhẹ hoặc rất nhẹ

- Thể HbH: mất ba trong bốn gen α, biểu hiện lâm sàng vàhuyết học như một thalassemia trung gian

- Thể Hb Barts (thể phù bào thai): mất cả bốn gen α, biểuhiện bệnh này rất nặng, thường gây tử vong ngay từ thời kỳ thainhi hoặc sau đẻ

Do có sự giảm tổng hợp mARN cho chuỗi α, hậu quả giảmtổng hợp các chuỗi α ở các mức độ khác nhau Mức độ giảm tổnghợp chuỗi α tỉ lệ với lượng gen α bị mất chức năng và lâm sàngcũng biểu hiện các thể bệnh nặng nhẹ tương ứng Có thể xảy ra

sự kết hợp α-thalassemia với các Hb bất thường về cấu trúc ở cảchuỗi α và β, như HbQ, HbG Philadelphia, HbE, HbF.

1.3.1.2 β-thalassemia

Là bệnh do giảm hoặc mất hẳn sự tổng hợp chuỗi β globin.Gen chỉ đạo tổng hợp chuỗi β (gen β) nằm trên cánh ngắn nhiễmsắc thể 11 cùng các gen δ, γ, ε Nếu nhiễm sắc thể tổn thươngmất hoàn toàn khả năng chỉ đạo tổng hợp chuỗi β gọi là β0 Nếugen β tổn thương làm giảm tốc độ tổng hợp chuỗi β gọi là β+.[3],[7]

Có nhiều khuyết tật ở gen β gây β-thalassemia đến nay pháthiện được khoảng 200 đột biến gen tổng hợp chuỗi β globin

- Các đột biến ở vùng khởi động làm giảm tốc độ sao chép,dẫn đến tình trạng β+-thalassemia

- Đột biến ở một số bộ 3 mã hóa làm thành mã chấm hếtkhông tạo mARN đầy đủ gây β0-thalassemia

- Các đột biến ở đoạn đầu hay đoạn cuối sao chép rối loạnquá trình sao chép

mARN, gây giảm tốc độ tổng hợp chuỗi β gây β+-thalassemia

- Các đột biến ở vùng intron làm chậm quá trình chín củamARN gây beta thalassemia

Chuỗi β giảm hoặc không tổng hợp được sẽ làm cơ thể tăngcường tổng hợp các chuỗi khác để bù:

- Tổng hợp chuỗi δ tạo α2/δ2 đó là HbA2

- δβ-thalassemia đồng hợp tử.

- Tồn tại HbF

- δγ-thalassemia: nguyên nhân của thể bệnh này là do khôngtổng hợp được chuỗi δ và γ, bệnh ít gặp và ít có ý nghĩa lâmsàng

1.3.1.3 Thể phối hợp β-thalassemia/HbE

Là bệnh kết hợp giữa β-thalassemia và Hb bất thường dothay đổi cấu trúc mạch polypeptid của globin, Glutamin ở vị trí 26của mạch beta thay bằng Lysin Globulin của HbE là α2β2 26glu-lys,bệnh HbE dù dị hợp hay đồng hợp tử thường không có biểu hiệnlâm sàng hay thiếu máu nhẹ dễ bỏ qua, nhưng khi HbE kết hợpvới β-thalassemia thành bệnh HbE/β-thalassemia thì bệnh biểuhiện nặng gần giống beta thalassemia đồng hợp tử

1.3.2 Bệnh rối loạn huyết sắc tố về chất lượng

Do hư hại gen cấu trúc, gen cấu trúc chịu trách nhiệm về tínhchất và thứ tự các acid của dây polypeptid Khi gen này bị hư hạithì một acid amin bị thay thế bằng một acid amin khác trong dâypolypeptid và vì thế cho dây polypeptid bất thường và dẫn đếncác bệnh sau đây:

Đồng hợp tử: thể này cả hai dây bêta đều bất thường

Dị hợp tử: thể này chỉ có một bêta bất thường do arginin thaythế histedin ở vị trí 63, còn gọi là bệnh huyết sắc tố Zurich, bệnhnày có huyết sắc tố C từ 20 - 49% và huyết sắc tố A bình thường.Trong thể dị hợp tử kép có huyết sắc tố S tăng cao, huyết sắc tố Ftăng ít, huyết sắc tố A còn rất ít

Điều trị không đặc hiệu:

+ Vitamin B12

• Bệnh huyết sắc tố M: do dây beta bất thường còn gọi là bệnh

Hydepark Saskloon, Milwankee chỉ có triệu chứng tím đơn thuần.Bệnh không có điều trị đặc hiệu

• Bệnh huyết sắc tố E (alpha A/2 beeta E/2): Bệnh gặp ở vùng

Đông Nam Á, Thái Lan gặp tỉ lệ 13% Thể đồng hợp tử ít gặp

• Bệnh huyết sắc tố Lepore: hai dây alpha của huyết sắc tố

Lepore bình thường, còn hai dây còn lại, đầu dây có tính chất dâydelta nhưng cuối dây có tính chất dây beta

2 Các kỹ thuật sàng lọc

2.1 Tổng phân tích tế bào máu ngoại vi

Các chỉ số hồng cầu thường được sử nhất trong sàng lọc gồmMCV và MCH Nhiều tác giả cho rằng, MCH được tin cậy hơn MCV

do sự thay đổi kích thước của MCV theo thời gian Ngoài ra, 2 chỉ

số này có thể được sử dụng riêng lẽ hoặc dưới dạng các công thứcsàng lọc

Ngưỡng cut-off được sử dụng rộng rãi nhất của MCV và MCHcho chẩn đoán thal lần lượt là MCV<80 fl và MCH<27 pg [9] Cácgiá trị dưới ngưỡng gợi ý α- hoặc β-thal hoặc thiếu sắt và cần xácđịnh chẩn đoán với các phương pháp khác Đối với β-thal, mức độhồng cầu nhỏ, nhược sắc liên quan đến mức độ nặng của đột biếntrên gen globin β quyết định sự sản xuất chuỗi globin β: đột biếngây ra β-thal càng nặng (mất cân bằng chuỗi globin càng nhiều),

chỉ số hồng cầu càng giảm, tuy nhiên, cũng có sự trùng lắp giữacác mức độ này Người mang β-thal gen lặn có các chỉ số hồngcầu giảm nhẹ hoặc bình thường.

2.2 Phết máu ngoại vi

Các thay đổi hình thái hồng cầu có thể được phát hiện tronghầu hết các trường hợp mang gen thalassemia, do đó, kiểm traphết máu một cách cẩn thận có thể giúp đánh giá các trường hợpmang gen [4]

Hình 2.1 Thay đổi hình thái hồng cầu trên phết máu ngoại

vi 2.3 Nhuộm hồng cầu lưới và thể vùi HbH

Trong sàng lọc người mang gen thalassemia, hồng cầu lướikhông có giá trị chẩn đoán Tuy nhiên, trong chẩn đoán α-thalassemia, đặc biệt bệnh lý HbH, nhuộm BCB (Brilliant cresylblue) phát hiện thể vùi HbH đặc trưng Tỉ lệ thể vùi HbH thườngkhá cao trong bệnh lý Hb H (từ 5-50%), nhưng khá thấp trong cáckiểu hình α-thalassemia thể nhẹ (các dạng dị hợp tử a+-thalassemia, α0-thalassemia, hoặc dạng không xóa đoạn), chỉchiếm khoảng 1/1.000-10.000 hồng cầu [10]

2.4 Khảo sát sức bền thẩm thấu hồng cầu (OF test)

OF test là phương pháp đầu tiên được sử dụng cho sàng lọcthalassemia và được giới thiệu như một tiếp cận đơn giản để pháthiện người mang gen thalassemia bởi Silvestroni và Bianco vàonhững năm 1940 Phương pháp nhanh chóng và đơn giản nàyđược áp dụng như 1 test sàng lọc trong những cộng đồng lớn [11]

Nguyên lý: các hồng cầu kích thước nhỏ đề kháng với hiện

tượng ly giải khi tiếp xúc với các dung dịch nhược trương

Kết quả: OF test dương tính trong cả người mang gen α- và thalassemia, hồng cầu hình liềm thể nhẹ và thiếu máu thiếu sắt.Các kết quả dương tính giả có thể gặp trong hồng cầu nhỏ dothiếu máu thiếu sắt và do đó những người dương tính vớiNESTROFT cần điều tra thêm để xác định chẩn đoán Các kết quả

β-âm tính giả cũng được ghi nhận

2.5 Định lượng HbF dựa vào hiện tượng thoái biến trong môi trường kiềm

Nguyên lý: HbF đề kháng tương đối với sự thoái biến bởi các

tác nhân kiềm tính so với HbA Phương pháp được mô tả cho kếtquả đáng tin cậy trong ngưỡng từ 0,8% – 25,0%, nồng độ đượctìm thấy phổ biến nhất trong những người mang gen δβ-thalassemia và hầu hết các dạng HPFH [11]

Phát hiện và định lượng nồng độ HbF tăng có ý nghĩa quantrọng trong tư vấn di truyền và tiên lượng β-thalassemia và thiếumáu hồng cầu liềm Sự gia tăng nồng độ HbF có thể kết hợp vớikiểu hình nhẹ hơn Bởi vì ngưỡng của HbF có thể từ 1% - 95%,không có phương pháp đơn độc nào có thể định lượng chính xáctoàn bộ ngưỡng Một số phương pháp có thể được sử dụng để xácđịnh HbF như thoái biến ở môi trường kiềm, các kỹ thuật miễn

dịch (khuếch tán miễn dịch, ELISA và đo miễn dịch phóng xạ), IEFhoặc sắc ký cột.

2.6 Phân bố HbF trong tế bào

Nguyên lý: HbF được phân bố không đồng nhất trong các tế

bào hồng cầu, ngoại trừ trong tình trạng HPFH do xóa đoạn Các

tế bào với số lượng HbF có thể phát hiện được được gọi là các “tếbào F” trong phết máu ngoại vi bởi hai kỹ thuật: kỹ thuật rửa giảiacid Kleihauer, và miễn dịch huỳnh quang sử dụng các kháng thểđơn dòng khác HbF đặc hiệu Định lượng các tế bào F có thể hữuích trong sàng lọc HPFH, để theo dõi các tế bào F trong các bệnhnhân thiếu máu hồng cầu hình liềm được điều trị với hydroxyurea

và phát hiện các tế bào thai trong máu người trưởng thành nhưtrong trường hợp xuất huyết (fetal-maternal haemorrhage) Gầnđây có thể sử dụng tế bào dòng chảy để đếm tế bào F [11]

2.7 Xác định HbE bằng DCIP test

Nguyên lý: đột biến HbE có thể xảy ra trên gen globin β ở

condon 26, GAG>AAG, gây thay đổi acid amin từ Glu>Lys, làm Hồkhông bền nhẹ và bộc lộ gốc -SH, gốc này có thể bị oxy hóa bởicác tác nhân hóa học gồm thuốc nhuộm DCIP(dichlorophenolindophenol) ở pH trung tính (7,5) DCIP là mộtdung dịch thuốc nhuộm có màu xanh dương đậm, có thể oxy hóa

và gây kết tủa HbE và những phân tử Hb không bền khác như

HbH khi tiếp xúc với thuốc nhuộm ở 37C Hb kết tủa có thể đượcnhìn thấy bằng mắt thường ở đáy tube [11]

Hình 2.2 Kết quả DCIP qua các trường hợp

Kết quả: trong đồng hợp tử HbE, có một lượng lớn Hb lắng xuống đáy ốngnghiệm Trong HbE dị hợp tử, HbE/β-thalassemia, sự kết tủa của HbE gây ra hiện

tượng mờ hoặc phân bố dạng tinh thể Test cũng dương tính trong bệnh HbH vànhững Hb không bền khác Test được nhận thấy có độ nhạy và độ đặc hiệu thayđổi, tuy nhiên, nhìn chung cao, với độ nhạy từ 93,2% đến 100%.

3 Xét nghiệm chẩn đoán

3.1 Phân tích thành phần hemoglobin

3.1.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Nguyên lý: Trong phương pháp này, đệm phosphate ở các

nồng độ khác nhau (pha động), được đây qua một cột trao đổi ion(pha tĩnh) bằng một bơm áp suất Pha tĩnh gồm một hộp phân tíchsắc ký có hệ thống điều nhiệt chứa các hạt nhựa trao đổi iondương hoặc ion âm (đường kính từ 3-5 um) Trạm sắc ký phát ramột sự chênh lệch về độ mạnh ion và pH tăng dần trong đệm đãđược lập trình đến hộp sắc ký bằng 2 bơm piston kép, và Hb đượctách ra tùy thuộc vào sự tương tác ion với pha tĩnh [6]

- Kết quả và giải thích:

+ Các Hb tách ra sau đó sẽ được phát hiện bởi bộ phận đầu dò(detector), mỗi Hb được đặc trưng bởi một thời gian lưu riêng, làthời gian từ khi tiêm mẫu vào cột đến khi xuất hiện đỉnh Hb Kếtquả thu được là biểu đồ sắc ký (chromatogram), với tất cả cácthông số về thành phần Hb được rửa giải, thời gian lưu, vùng củacác đỉnh Hb và giá trị của các thành phần Hb khác nhau Bảng kếtquả thể hiện tỉ lệ phần trăm của HbF, Alc, A và A2; định tính vàđịnh lượng các Hb bất thường

+ Ngưỡng bình thường đối với HbA2 nằm trong khoảng từ 1,7%

- 3,2% ở người bình thường, trong khi ở người mang gen thalassemia, HbA2 nằm giữa 4,0%-7,0% Giá trị HbA2 được xem làranh giới khi nó nằm giữa 3,2%-3,8% Các mẫu với nồng độ nàycần được điều tra thêm để xác định các trường hợp thalassemia

β-với HbA2 bình thường Ngưỡng bình thường của HbF thường <1,5% Các máy HPLC có các cửa sổ xác định thành phần phân tíchgiúp giải thích các loại Hb bình thường và bất thường được pháthiện trong mẫu máu Các cửa sổ được xác định các khoảng thờigian lưu mà các Hb biến thể phổ biến được rửa giải Tuy nhiên,cần biết rằng bởi vì các biến thể Hb khác có thể có thời gian rửagiải tương tự với các biến thể phổ biến nên việc xác định Hb biếnthể chỉ có tính chất giả định và phân tích DNA là cần thiết để xácđịnh các biến thể H [6].

- Nhược điểm:

+ Hb Lepore và HbE cùng được rửa giải với HbA2, nên sự hiệndiện đồng thời của chúng trong mẫu máu cho kết quả HbA2 caogiả (HbA2 >10%) Tỉ lệ này hầu như không bao giờ có trong β–thalassemia thể nhẹ, nên khi HbA2 >10%, cần tiến hành thêm cácxét nghiệm để xác định sự hiện hiện của các biến thể Hb chạycùng đỉnh với HbA2

+ HbH và Hb Bart’s có thể được phát hiện trên sắc ký phổnhưng không được định lượng vì chúng được rửa giải trước khi tíchphân

3.1.2 Phương pháp điện di

3.1.2.1 Tập trung đẳng điện

Là một kỹ thuật tách protein dựa trên các điểm đẳng điện Kỹthuật ứng dụng đặc điểm của protein là điện tích thực của mộtphân tử protein phụ thuộc vào pH của môi trường xung quanhchúng Điện tích thực của một phân tử protein là tổng các điệntích âm và dương của các chuỗi acid amin và các gốc ion hóa (đầutận amino và carboxyl) Điểm đẳng điện là pH mà ở đó, điện tíchthực của phân tử bằng 0 Nếu số lượng gốc acid trong phân tử

protein lớn hơn số lượng gốc kiềm, điểm đẳng điện của protein đó

sẽ ở mức pH thấp và protein được phân loại là có tính acid, vàngược lại là protein có tính kiềm Các protein tích điện dương ởgiá trị pH dưới điểm đẳng điện và tích điện âm ở giá trị pH trênđiểm đẳng điện của chúng Vì vậy, ở giá trị pH thấp hơn điểmđẳng điện, protein sẽ di chuyển về phía cực âm và ngược lại ở giátrị pH cao hơn điểm đẳng điện, protein sẽ di chuyển về phía cựcdương, và một protein ở vị trí điểm đẳng điện sẽ không di chuyểntrong môi trường điện [6]

Khi protein được đặt trong một môi trường có gradient pHtuyến tính và được đặt trong môi trường điện, nó sẽ di chuyển vềphía điện cực trái dấu Trong quá trình di chuyển qua gradient pH,protein sẽ lấy hoặc mất proton Khi đó, điện tích thực sẽ giảm vàprotein sẽ di chuyển chậm lại Cuối cùng, protein sẽ đến điểm cógradient pH bằng với điểm đẳng điện Ở đó, nó không tích điện vàdừng lại và protein tập trung thành các band rõ nét trong gradient

pH ở giá trị gradient đặc trưng riêng của chúng

Kỹ thuật tập trung đẳng điện cần một môi trường hỗ trợ dạngrắn như gel agarose và gel polyacrylamide Polyacrylamide là mộtpolymer với những khe hở – tương đương kích thước của nhữngphân tử protein nên ngoài điện tích bề mặt, sự phân tách còn phụthuộc vào kích thước phân tử Gel tập trung đẳng điện chứanhững dung dịch đệm tổng hợp được gọi là ampholyte làm giảmgradient pH [6]

Giải thích: Việc xác định những Hb chưa biết đạt được bằng

cách đo giá trị điểm đẳng điện với một tỷ trọng kế laser Giá trịđiểm đẳng điện của những Hb đã độ phân giải biết được tách ratrên cùng một plate, được đo và sử dụng như mẫu chứng Bất

chấp pI cao đạt được bởi kỹ thuật IF, việc định lượng chính xác làkhông thể [6]

Tập trung đăng điện là một kỹ thuật tốt để tách các Hb biếnthể nhưng đòi hỏi trình độ chuyên môn kỹ thuật để giải thích kếtquả hơn phương pháp điện di vì các thành phần phức hợp cũngđược tách

Không định lượng chính xác được

3.1.2.2 Điện di mao quản

Điện di mao quản (CE – Capillary Electrophoresis) là một công cụ tích hợp trongnhiều phòng xét nghiệm hóa sinh lâm sàng để tách các thành phần Hb và tính tỷ lệcủa mỗi thành phần

Hình 3.1 Nguyên lý hoạt động của hệ thống điện di mao

quản

- Nguyên lý: CE là kỹ thuật điện di thực hiện trong những ống

mao quản hẹp, đường kính 25-100 um, chứa đầy dung dịch đệm

Sự phân tách phụ thuộc vào tốc độ di chuyển của các ion hoặccác dung dịch, nhưng đặc điểm quan trọng nhất của CE là sự dichuyển của khối dung dịch trong mao quản silica dưới tác dụngcủa điện trường được gọi là dòng điện thẩm [6]

Bề mặt bên trong của mao quản có các nhóm silanol (SiOH),

dễ dàng giải ra H+ vào dung dịch và bề mặt thành mao quản sẽmang điện tích âm Điện tích âm hút các ion dương từ dung dịch

đệm, tạo ra lớp kép mang điện và một hiệu điện thể gần thànhmao quản Khi áp thế vào mao quản, các ion dương trong lớp điệnkép khuếch tán sẽ tự do di chuyển về phía cực âm, mang theo cảkhối dung dịch đệm theo chúng Kết quả là có một dòng điệnthẩm và sự phân tách các thành phần Hb mang điện khác nhau.Các thành phần này được phát hiện trực tiếp tại bước sóng hấpthụ 415 nm, tối ưu đối với Hb, theo thứ tự từ cực âm đến cựcdương HbC, A2, E, S, D, F, A, Bart's và HbH.

Trái với dòng chảy áp suất trong HPLC, dòng chảy của EOFđược phân bố một cách đồng nhất dọc theo ống mao quản, không

có hiện tượng giảm áp, do đó hiệu quả phân tách cao hơn

Kết quả: máy điện di tự động nhận diện các đỉnh Ao, F, C và

Az Các đỉnh khác có vị trí đặc trưng như HbS, HbD, HbE, HbH vàHbJ, nhưng đều được đánh dấu là HbX Người đọc có thể gõ thêmvào tên của một Hb biến thể nghĩ đến nhiều nhất

3.1.2.3 Điện di xenlulo axetat  [6]

Đây là muối axetat của xenlulo được sản xuất bằng cách xử lýbông bằng axit axetic sử dụng axit sunfuric làm chất xúc tác Quátrình di chuyển diễn ra trên màng đệm trên bề mặt của tấm hoặcmàng cellulose axetat Việc tách protein chủ yếu bằng điện tích.Điện di xenlulo axetat có thể được sử dụng để xác định định tínhcác biến thể, nhưng cũng có thể dùng để rửa giải để định lượnghuyết sắc tố, A 2 , A, S, D, Lepore, các biến thể chuỗi α, HbH và

Hb Bart's Vị trí của các phân đoạn hemoglobin khác nhau trên

điện di cellulose acetate được thể hiện ở Hình 3.2.

Kết quả được tính như sau:

Các huyết sắc tố di chuyển trên màng cellulose axetat từ cực

âm đến cực dương theo thứ tự sau: HbA 2 , HbE, HbC, HbD, HbS,

Hb Lepore, HbF, HbA và các huyết sắc tố chuyển động nhanhBart's và HbH (xem Hình 3.2 ) Phạm vi bình thường của HbA 2 là2,4% đến 3,2% Một ví dụ điển hình của điện di cellulose axetatđược trình bày:

Hình 3.2 Ví dụ về điện di xenlulo axetat

Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả là: độ pH chính xác, nồng độđệm chính xác và nhiệt độ của đệm, có thể bị ảnh hưởng bởi điện

áp hoặc nhiệt độ môi trường Đặc biệt ở những nơi có khí hậunóng, nên bảo quản bể điện di với dung dịch đệm ở nhiệt độ 4°C

Lý tưởng nhất là phương pháp nên được tiến hành ở nhiệt độ môitrường dưới 23°C Do đó, ở những nơi có khí hậu ấm áp, cần phải

có máy điều hòa không khí trong phòng thí nghiệm Chất lượngmàng mang phải tốt, chất lượng kém cần được nhận biết và loại

bỏ Màng phải được giữ ẩm

3.1.2.4 Điện di agar

Agar là một chất keo có nguồn gốc từ thành tế bào của tảo biển

đỏ Nó bao gồm một ma trận các phân tử liên kết chéo với khoảngcách giữa chúng Trong điện trường, các phân tử hemoglobin sẽ dichuyển qua ma trận sao cho tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kíchthước và hình dạng của phân tử cũng như điện tích Điều này cónghĩa là các phân tử tuyến tính nhỏ hơn có điện tích cao sẽ dichuyển qua gel với tốc độ nhanh hơn [6]

Điện di trên gel agar không phải là kỹ thuật sàng lọc thỏa đáng

vì nó không thể phân biệt được nhiều loại huyết sắc tố bất thườngvới HbA Tuy nhiên, nó có thể tách nhóm C thành ba phần: HbC,O-Arab và HbE cộng với HbA 2  Phương pháp này cũng có thểphân biệt HbS với HbD, HbF với HbA, Hbs Little Rock, Rainier vàBethesda với HbA, và HbH với HbI [6]

Hình 3.3 Ví dụ về điện di trên gel agar 1 Lanes 1,4: người lớn bình thường 2 HbS/β+-thalassemia 3 HbS/β 0 -

thalassemia.

3.2 Tổng hợp chuỗi globin

Tổng hợp chuỗi globin được giới thiệu trong nghiên cứu hộichứng thalassemia hơn 30 năm Nó góp phần to lớn để hiểu cơchế sinh lý bệnh của các hội chứng thalassemia khác nhau Hơnnữa, ngay cả trong kỷ nguyên của DNA vẫn còn một công cụ chẩnđoán rất nhạy cảm, rất hữu ích để xác định một số dạngthalassemia phức tạp hoặc không điển hình Có hai phương phápđược thiết lập để phân tích tổng hợp chuỗi globin: một là phươngpháp cổ điển của Weatherald và Clegg, dựa trên sắc ký cellulosecarboxymethyl để phân tách chuỗi globin [2]

3.3 Chẩn đoán phân tử

3.3.1 Chẩn đoán những đột biến đã biết

Khi phân tích các đột biến gen globin, điều cần thiết là tiến hànhPCR đối với vùng DNA có đột biến Bởi vì các gen globin quá lớn,nên chỉ một hoặc hai đoạn nhỏ được khuếch đại

3.3.1.1 Phương pháp sử dụng đầu dò ASO (Allele specific oligonucleotide - probe)

Nguyên lý của phương pháp lai dot blot (DB) và dot blot ngược(RDB) là một phân tử DNA chuỗi đơn của trình tự được xác định(“đầu dò oligo”) có thể lại với một phân tử DNA thứ hai có chứatrình tự bổ sung (chuỗi “đích”) với tính ổn định tùy thuộc vào độlớn của base bắt cặp [2]

Dot blot ASO

Dot blot là kỹ thuật cố định DNA đã được khuếch đại trên màngnylon hoặc màng nitrocellulose Hiện tượng lại có thể được thựchiện để xác định chuỗi đích tương đối trong các mẫu DNA đã đượcchuẩn bị Kỹ thuật được mô tả đầu tiên bởi Kafatos và cs Qui trìnhnày được sử dụng đầu tiên để xác định số lượng tương đối củanhững chuỗi đích trong một loạt mẫu DNA Một số lượng lớn mẫu

có thể được tiến hành đồng thời trên bề mặt của màng, có thểnhiều DNA khác nhau được sàng lọc trong một thí nghiệm lai,hoặc trong một loạt thí nghiệm lai để tìm nhiều đột biến khácnhau [6].

Phương pháp này cần sử dụng một phân tích cho một đột biến

Do đó, cần nhiều thời gian để sàng lọc nhiều đột biến Hơn nữa,nhiệt độ lai và nhiệt đô rửa của mỗi oligonucleotide khác nhau.Trong cùng một phương pháp có thể nghiên cứu cho nhiều mẫuvới cùng một đột biến

Hình 3.4 Nguyên lý của kỹ thuật lai dot blot ngược Lai dot blot ngược

Dot blot là kỹ thuật cố định nhiều đầu dò oligonucleotide đặchiệu allele trên màng nylon Đây là một phương pháp khôngphóng xạ Theo nguyên lý này, nhiều cặp đầu dò ASO bình thường

và đột biến được phát hiện trên những dải màng nylon Đối vớimỗi test chẩn đoán, một dải màng được thấm các oligonucleotideđột biến và bình thường, lai với một mẫu DNA đặc hiệu để sànglọc đột biến RDB được mô tả đầu tiên bởi Saiki và cộng sự, và sau

đó được phát triển để sàng lọc nhiều đột biến β thalassemia trongcộng đồng người Sicily và sử dụng trong chẩn đoán trước sinh [2],[6].

RDB về mặt lý thuyết có thể được thiết kế để phát hiện bất kỳđột biến điểm nào hiện diện ở một quốc gia xác định sau khi cácđiều kiện đã được thiết lập RDB cũng được sử dụng ở Sicily đểphân tích các đột biến điểm a thalassemia và 8 thalassemia, vàxác định kiểu gen của các biến đổi gen B-globin phổ biến (HbS,HbC, HbD )

sẽ được điều tra bằng giải trình tự trực tiếp

3.3.1.2 Gap-PCR [2],[6]

Gap-PCR phát hiện các đột biến có thể bị bỏ sót bởi giải trình

tự chuỗi DNA Các đoạn mồi đặc hiệu được thiết kế bổ sung với 2đầu của đột biến đã biết Gap- PCR dựa trên nguyên lý: các đoạnmồi không thể tạo ra một sản phẩm PCR trừ khi có một đột biếnnối các trình tự ở hai đầu lại với nhau

Đây là một phương pháp không phóng xạ, đơn giản, nhanh,cho phép xác phát hiện các mất đoạn α-thal, ö-thal tái sắp xếp HbLepore Giới hạn của phương định các đột biến DNA hoặc tái sắpxếp lại gen Phương pháp này được sử dụng để pháp này là các

(endpoints)

Hình 3.5 Sơ đồ mô tả sự hình thành gap-primer-PCR

Phương pháp này thường được sử dụng để phát hiện các độtbiến mất đoạn như mất đoạn SEA, THAI, -a37, -a42, trongbệnh a thalassemia và một số đột biến mất đoạn của Bthalassemia

Phương pháp tiến hành: tương tự như phản ứng PCR thôngthường Kết quả đánh giá dựa trên sự có mặt hay vắng mặt củasản phẩm PCR thông qua điện di và nhuộm gel

Ưu điểm: đây là một phương pháp không phóng xạ, đơn giản

và nhanh để phát hiện được các đột biến mất đoạn lớn, có thểtriển khai thành multiplex PCR để sàng lọc các đột biến mất đoạnlớn phổ biến trong bệnh thalassemia

Nhược điểm: đòi hỏi thiết kế mồi đặc hiệu với sự chính xáccao

có nucleotide ở đầu tận 3 tương ứng với chuỗi bình thường vàchuỗi đột biến PCR khuếch đại một đoạn DNA chỉ khi có một sựkết hợp hoàn hảo với chuỗi gen mà đoạn mồi đang bắt cặp(annealing)

Kỹ thuật này gồm 2 phản ứng PCR và sử dụng 3 loại mồi Mộtloại có tính ổn định và có trình tự bổ sung với khuôn, sử dụngtrong cả 2 phản ứng để tạo ra một đoạn chứng Sự hình thành sảnphẩm chứng cho thấy hỗn hợp phản ứng và máy chu kỳ nhiệt

đang hoạt động tối ưu Hai loại mồi còn lại có sự thay đổi ở đầu 3'(mồi suy biến) Trong đó, một loại đặc trưng cho trình tự DNA bìnhthường (wild type) và một loại đặc trưng cho trình tự DNA độtbiến.

Hình 3.6 Gel ARMS-PCR để chẩn đoán bệnh

betα-thalassemia.

- Phương pháp tiến hành:

- Hai phản ứng PCR được tiến hành đồng thời nhưng riêng rẽtrong 2 ống khác nhau Mỗi phản ứng gồm 1 mồi ổn định và 1 mồisuy biến

- Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose và nhuộmethidium bromide Nếu mẫu là đồng hợp tử đột biến hay đồng hợp

tử wild type, sản phẩm PCR chỉ xuất hiện ở 1 trong 2 ống Nếumẫu là dị hợp tử, sản phẩm xuất hiện ở cả hai ống

Ưu điểm: là một phương pháp không phóng xạ, đơn giản và

nhanh Có thể phát triển thành phương pháp multiplex PCR sử

dụng nhiều cặp mồi trong 1 phản ứng PCR và sử dụng các cặpmồi gắn huỳnh quang.

Nhược điểm: tính không ổn định của mồi suy biến có thể gây

ảnh hưởng tới kết quả đánh giá đột biến đồng hợp tử hay dị hợp

tử Do đó, đòi hỏi phải có kinh nghiệm để hiểu các trường hợp âmtính giả

Phương pháp này thường được sử dụng để phát hiện các loạiđột biến điểm trong thalassemia Chiến lược sàng lọc được bắtđầu từ các đột biến phổ biến trong các cộng đồng dân tộc thiểu số

ở các nước, và sau đó sàng lọc những đột biến hiếm hơn Các độtbiến không đặc trưng sau đó sẽ được xác định bằng giải trình tự

bộ gen Các đoạn mồi cho chẩn đoán những alen bình thường đốivới nhiều đột biến này được liệt kê trong bảng 5.6 Những đoạnmồi này cần khi cả hai cặp cha mẹ cần chẩn đoán β-thal trướcsinh mang cùng đột biến

3.3.1.5 Phân tích men giới hạn (RE-PCR)

Nguyên lý: Các men giới hạn cắt chuỗi DNA kép tại những trình

tự nhận biết đặc biệt Kỹ thuật dùng men cắt đòi hỏi khuếch đạiđoạn DNA đích bằng các kỹ thuật PCR, sau đó dùng các men cắt

để cắt các sản phẩm này Những vị trí cắt trên DNA có thể thay

đôi tùy theo có hay không có đột biến dẫn đến tạo ra các đoạn cókích thước khác nhau Phát hiện các đoạn khác nhau này bằng kỹthuật điện di trên gel agarose hay gel polyacrylamide Sự cắt mộtphần hoặc không hoàn toàn có thể là vấn đề đối với một số mengiới hạn dẫn đến kết quả âm tính hoặc dương tính giả Vì vậy, kỹthuật này luôn cần có chứng dương và chứng âm [6]

Ưu điểm: Đây là một phương pháp không phóng xạ, đơn giản,nhanh và đáng tin cậy

Nhược điểm: chỉ một số nhỏ các đột biến β-thal, α-thalassemia

và Hb biến thể tạo nên hoặc hủy bỏ một vị trí nhận biết men giớihạn trong chuỗi gen globin Men có sẵn trên thị trường (khôngphải cho tất cả trường hợp) và không có vị trí khác quá gần vớiđột biến, sự mất hoặc tạo nên một vị trí có thể được sử dụng đểchẩn đoán sự hiện diện hoặc vắng mặt của đột biến Chi phí khácao cho một số men

Phân tích men giới hạn thường được sử dụng khi có một sốbằng chứng cho thấy có đột biến, ví dụ với HPLC, điện di Hb hoặcnguồn gốc dân tộc của bệnh nhân, hoặc nó được sử dụng như một

kỹ thuật khẳng định thứ cấp sau phân tích trình tự chuỗi

Công dụng chính của kỹ thuật PCR này là để chẩn đoán các Hbbiến thể quan trọng trên lâm sàng là HbS, Hb D-Punjab, và HbO-Arab

3.3.1.6 Pyroinating

Pyroinating là một kỹ thuật giải trình tự tổng hợp cho phép giải trình tự DNAtheo thời gian thực nhanh chóng Kỹ thuật này sử dụng sulphurylase để chuyểnpyrophosphate được giải phóng sau khi kết hợp nucleotide thành ATP, sau đó được

sử dụng để tạo ra ánh sáng khả kiến từ luciferase Lượng ánh sáng tạo ra được đobằng máy ảnh phù hợp và tỷ lệ thuận với nồng độ mol của deoxynucleotide tíchhợp, cho phép xây dựng trình tự DNA đã biết ngắn [13]

Phân tích đột biến HbC:

1 Để phân tích đột biến HbC, hãy nhấp vào tab Thiết lập Phân tích Trong hộpTrình tự phân tích, thay đổi trình tự thànhTYAGGAGTCAGGTGCACCATGGTGTCT rồi nhấp vào Áp dụng Thaotác này sẽ mở ra một cửa sổ khác có tên Áp dụng Thiết lập Phân tích Tronghộp này bấm vào Áp dụng cho tất cả

2 Giờ đây, mỗi giếng trong đĩa mẫu ở tab Tổng quan sẽ được phân bổ mộtmàu Màu xanh là đạt, màu vàng nên được giải thích một cách thận trọng do

độ cao đỉnh thấp và màu đỏ là không đạt

3 Việc chọn từng giếng sẽ mang lại kết quả chi tiết hơn hiển thị cả dữ liệu thô

và biểu đồ Có thể đặt biểu đồ trên đường đỉnh bằng cách nhấp chuột phải vàchọn Hiển thị biểu đồ

4 Trên mỗi cửa sổ giếng, nó hiển thị phần trăm nucleotide trong vùng quantâm

Kết quả như sau:

o Các mẫu bình thường phải có >95% C ở vùng đầu tiên

o Các mẫu HbC dị hợp tử sẽ có khoảng 50% T và 50% C

o Các mẫu HbC đồng hợp tử sẽ có >95% T

o Các mẫu HbSC có khoảng 70% C và 30% T Những mẫu này cũngđược phần mềm hiển thị là lỗi do lượng phân phối không khớp vớitham chiếu do đột biến HbS

5 Không được có đỉnh trong giếng trống

6 Các biểu đồ có thể được in bằng cách chọn các giếng quan tâm, sau đó nhấpvào Báo cáo rồi nhấp vào Báo cáo AQ Pyrogram Điều này sẽ mở ra mộtcửa sổ mới Trong cửa sổ này, có thể chọn hướng của các ảnh chữ nhật cũngnhư số lượng ảnh chữ nhật trên mỗi trang Trang này có thể được xem dướidạng PDF bằng cách sử dụng Xem trước và sau đó được in

Phân tích đột biến HbS:

1 Để phân tích đột biến HbS, hãy nhấp vào tab thiết lập phân tích Trong hộpSequence to Analysis, thay đổi trình tự thànhWCAGGAGTCAGGTGCACCATGGTGTCT rồi nhấp vào Áp dụng Thaotác này sẽ mở ra một cửa sổ khác có tên Áp dụng Thiết lập Phân tích Tronghộp này bấm vào Áp dụng cho tất cả

2 Giờ đây, mỗi giếng trong đĩa mẫu ở tab Tổng quan sẽ được phân bổ mộtmàu Màu xanh là đạt, màu vàng nên được giải thích một cách thận trọng do

độ cao đỉnh thấp và màu đỏ là không đạt

3 Việc chọn từng giếng sẽ mang lại kết quả chi tiết hơn hiển thị cả dữ liệu thô

và biểu đồ Có thể đặt biểu đồ trên đường đỉnh bằng cách nhấp chuột phải vàchọn Hiển thị biểu đồ

4 Trên mỗi cửa sổ giếng, nó hiển thị phần trăm nucleotide trong vùng quantâm Kết quả như sau:

o Các mẫu bình thường phải có >95% T ở vùng đầu tiên

o Các mẫu HbS dị hợp tử sẽ có khoảng 50% A và 50% T

o Các mẫu HbS đồng hợp tử sẽ có >95% A

o Các mẫu HbSC có khoảng 70% T và 30% A Những mẫu này cũngđược phần mềm hiển thị là lỗi do lượng phân phối không khớp vớitham chiếu do đột biến HbC

5 Không được có đỉnh trong giếng trống

6 Các biểu đồ có thể được in bằng cách chọn các giếng quan tâm, sau đó nhấpvào Báo cáo rồi nhấp vào Báo cáo AQ Pyrogram Điều này sẽ mở ra mộtcửa sổ mới Trong cửa sổ này, có thể chọn hướng của các ảnh chữ nhật cũngnhư số lượng ảnh chữ nhật trên mỗi trang Trang này có thể được xem dướidạng PDF bằng cách sử dụng Xem trước và sau đó được in