Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2

ĐẶT VẤN ĐỀ Interleukin IL-8, thuộc họ chemokin, là yếu tố tiền viêm đóng vai trò thenchốt trong việc kích hoạt bạch cầu trung tính và liên quan đến các bệnh lý viêm nhưbệnh phổi tắc nghẽSàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOBỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN THỊ THÚY NGA

SÀNG LỌC CÁC PHÂN TỬ NHỎ CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾTƯƠNG TÁC INTERLEUKIN-8 VÀ THỤ THỂ CXCR1/2

NGÀNH: DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG

MÃ SỐ: 9720205

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

GS.TS LÊ MINH TRÍ

Thành phố Hồ Chí Minh, Năm 2024

LỜI CÁM ƠNLời cám ơn trân trọng nhất em xin gửi đến Thầy GS.TS Lê Minh Trí vàThầy GS.TS Thái Khắc Minh đã định hướng và trực tiếp hướng dẫn đề tài Luận án

Tiến sĩ Cám ơn Thầy trong thời gian qua đã quan tâm, thấu hiểu và tạo mọi điều kiệntốt nhất cho em Sự tận tình, kiến thức chuyên môn sâu rộng và những góp ý quý giácủa Thầy góp phần rất lớn vào thành công của luận án Được trở thành học trò củaThầy là một điều may mắn vì nhờ Thầy mà em đã có cơ hội học hỏi, trải nghiệm rấtnhiều trong nghiên cứu

Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Thầy TS Nguyễn Quốc Thái đã hướng

dẫn tận tình và hỗ trợ quý báu, sự kiên nhẫn, nhiệt tình của Thầy đã giúp em vượt quanhững khó khăn, thử thách trong những ngày đầu làm nghiên cứu thực nghiệm Em xin

cám ơn Cô TS Vũ Thanh Thảo đã cho phép và tạo điều kiện cho em được sử dụng

hóa chất và trang thiết bị phục vụ nghiên cứu tại phòng lab của trung tâm Sapharcen

Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến các Thầy/Cô PGS.TS Trần MạnhHùng, PGS.TS Huỳnh Ngọc Trinh, PGS.TS Đỗ Thị Hồng TƯơi, PGS.TS.

Luận án Cám ơn Thầy Cô đã dành thời gian đọc, góp ý và phản biện cho đề tài đểLuận án được hoàn thiện hơn

Xin gửi lời cám ơn đến Khoa DƯợc, Đại học Y DƯợc Thành phố Hồ ChíMinh đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị tốt nhất để em có thể thựchiện đề tài này Cám ơn TRƯờng Đại học Kỹ thuật Y-DƯợc Đà Nẵng đã cho phép và

tạo điều kiện cho tôi được theo học và hoàn thành chương trình đào tạo Tiến sĩ

Em xin thể hiện lòng kính trọng và sự tri ân sâu sắc đến các Thầy Cô Bộ môn

DƯợc nói riêng và các Thầy cô trong Khoa DƯợc nói chung vì đã tận tâm giảng dạy

và hết lòng truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý giá cho em Em xin cám anh

giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian làm Luận án Em xin gửi lời cám ơn đến

anh Lê Quang Đạt và chị Đỗ Nguyễn Minh Thảo đã hỗ trợ dung môi hóa chất, dụngcụ cho em và các bạn làm nghiên cứu Em cũng xin cám ơn các Thầy Cô Bộ mônPhân tích - Kiểm nghiệm, Bộ môn Hóa sinh và Bộ môn Vi ký sinh đã cho phép và

tạo điều kiện cho em được sử dụng trang thiết bị phục vụ nghiên cứu tại Bộ môn

Chị cám ơn Phong đã giúp đỡ rất nhiều từ những ngày đầu chị vào lab Hóasinh Một lời cám ơn rất đặc biệt chị muốn gửi đến HƯNG, Vy, Hạ, ThƯ, Thạch,Huyền và Thi vì đã đồng hành cùng chị trong suốt thời gian trên lab Hóa sinh và Visinh Cám ơn vì đã là động lực để chị lên lab mỗi ngày và cố gắng nhiều hơn Cám ơn

vì các em đã luôn sẵn sàng chia sẻ khó khăn với chị, đã quan tâm, kiên nhẫn lắng nghevà động viên chị

Chị cám ơn Minh, Nhân, PHƯơng, Uyên, Ánh và Thủy đã hỗ trợ chị rất nhiềutrong giai đoạn chị làm nghiên cứu in silico Chị cám ơn các bạn monitor tại lab Hóa

thấy rất biết ơn và may mắn vì đã là một thành viên của lab 314, cám ơn tất cả các em!

Tiếp theo, em chân thành cám ơn chị Trần Quế HƯơng vì đã cùng nhau vượt

qua những vui buồn, thử thách và hạnh phúc trong hơn năm năm nghiên cứu sinh Chịlà đồng nghiệp, cũng là bạn đồng hành cùng em trong mỗi chuyến đi xa, mỗi đợt báocáo bảo vệ Luận án, lắng nghe những lời chia sẻ và giúp em vượt qua được thời gian

khó khăn trong công việc cũng như cuộc sống Bên cạnh đó, cô rất cám ơn em ThanhTrang đã giúp đỡ cô rất nhiều trong giai đoạn nghiên cứu ở lab Hóa Dược và đồng

hành cùng cô tại phòng trọ thân yêu ở Sài Gòn

Cuối cùng, lời cám ơn đặc biệt nhất xin được gửi đến gia đình thân yêu của con.Cám ơn gia đình vì đã hỗ trợ không ngừng, động viên và luôn ở đó mỗi khi con cần, đãlắng nghe và cho con lời khuyên mỗi khi con gặp khó khăn Gia đình mãi là điểm tựatinh thần lớn nhất trong suốt cuộc đời con

Luận án này sẽ không thể hoàn thành nếu không có sự hỗ trợ từ mọi người vàcác tổ chức liên quan Một lời cám ơn hẳn là không đủ để bày tỏ lòng biết ơn và sựcám kích

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên là Trần Thị Thúy Nga, là Nghiên cứu sinh chuyên ngành Dược lý – Dược lâm sàng, khóa 2019 – 2022, xin cam đoan:

(1)Luận án là do chính bản thân tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn khoa học củaGS.TS Lê Minh Trí;

(2)Các tài liệu tham khảo được tôi xem xét, chọn lọc kỹ lưỡng, trích dẫn và liệt kê tàiliệu tham khảo đầy đủ;

(3)Kết quả trình bày trong luận án được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứucủa bản thân tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ đề tàicùng cấp nào khác

NGƯời HƯớngdẫn

CHƯO ng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ̛ 3

1.1.Interleukin-8 3

1.2.Nghiên cứu sàng lọc in silico . 13

1.3.Thử nghiệm đánh giá hoạt tính in vitro . 21

1.4.Các nghiên cứu có liên quan đến đề tài 28

CHƯO ng̛2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1.Thiết kế nghiên cứu 34

2.2.Đối tượng nghiên cứu 35

2.3.Thời gian và địa điểm nghiên cứu 36

2.4.Phương pháp nghiên cứu 36

2.5.Phương pháp phân tích dữ liệu 53

CHƯƠng 3 KẾT QUẢ . 54

3.1 Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ ức chế tương tác IL-8/CXCR1/2 tại vịtrí hoạt động ( orthosteric) . 54

3.2.Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ ức chế tương tác IL-8/CXCR2 tại vị trídị lập thể ( allosteric) . 73

3.3.Kết quả thử nghiệm đánh giá hoạt tính in vitro . 82

CHƯƠng 4 BÀN LUẬN 88

4.1 Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ ức chế tương tác IL-8/CXCR1/2 tại vịtrí hoạt động ( orthosteric) . 88

4.2.Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ ức chế tương tác IL-8/CXCR2 tại vị trídị lập thể ( allosteric) . 105

4.3.Thử nghiệm đánh giá hoạt tính in vitro . 109

KẾT LUẬN

122 KIẾN NGHỊ 124

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUANTÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH-VIỆT

ADMET

Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion andToxicity

Hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính

Thiết kế thuốc có sự hỗ trợ của máyCADD Computer-aided drug design

tính

Chronic obstructive pulmonary

ELR motif Glu-Leu-Arg motif Trình tự ba acid amin Glu-Leu-Arg

ERK Extracellular signal regulated

disease

Cryo-EM Cryo-electron microscopy Kính hiển vi điện tử đông lạnhCXCR1/2 Chemokine CXC receptor 1/2 Thụ thể chemokin CXCR1/2

EGFR Epidermal growth factor

receptor Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì

GH Goodness of hits Điểm số độ tốt của hitGPCR G protein coupled receptor Thụ thể liên kết với protein G

IC50 Half maximal inhibitory

concentration Nồng độ ức chế 50% hoạt tính

Phép đo nhiệt lượng chuẩn độ đẳngITC Isothermal titration calorimetry

Protein Kinase Protein kinase hoạt hóa mitogenMDs Molecular Dynamics Simulation Mô phỏng động lực học phân tử

2,5-diphenyltetrazolium bromideNicotinamide adenine

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-dinucleotide hydrogenNicotinamide

adenine dinucleotide phosphate hydrogen

Cơ học phân tử tổng quát hóa diệntích bề mặt Born)

Cơ học phân tử diện tích bề mặtPoisson – Boltzman

LBP Ligand-based pharmacophore Pharmacophore dựa trên phối tử

NEU Neutrophil Bạch cầu trung tính

PBS Phosphate-Buffered Saline Đệm muối photphatPDB Protein data bank Ngân hàng dữ liệu protein

PI3K Phosphoinositide 3-kinase

PLIF Protein-ligand interaction

fingerprint

Dấu vân tay tương tác protein-phốitử

PPI Protein-protein interaction Tương tác protein-protein

Căn bậc hai độ lệch trung bình bìnhRMSD Root mean square deviation

fluctuation

phươngCăn bậc hai độ dao động trung bìnhbình phương

SBP Structure-based pharmacophore Pharmacophore dựa trên cấu trúcSPR Surface plasmon resonance Cộng hưởng plasmon bề mặt

TMB 3,3′,5,5′ – tetramethylbenzidineTNF Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối uTPSA Topological polar surface area Diện tích bề mặt phân cực tôpôX-ray X-ray crystallography Tinh thể học tia X

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các dạng biến thể tự nhiên của IL-8 3

Bảng 1.2 Dữ liệu cấu trúc protein IL-8/CXCR1/2 5

Bảng 1.3 Tương tác giữa các acid amin của IL-8 và CXCR1/2 ở vị trí hoạt động 7

Bảng 1.4 Vai trò của IL8-CXCR1/2 trong một số nhóm bệnh chính 11

Bảng 1.5 Một số thuốc phân tử nhỏ ức chế CXCR1/2 allosteric trong giai đoạnthử nghiệm lâm sàng 12

Bảng 1.6 Một số nghiên cứu in silico với mục tiêu IL-8/CXCR1/2 29

Bảng 1.7 Một số nghiên cứu in vitro đánh giá sự gắn kết 31

Bảng 1.8 Một số nghiên cứu in vitro về tác động của IL-8 trên tế bào ung thư 33

Bảng 2.1 Phần mềm sử dụng trong nghiên cứu 36

Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 37

Bảng 2.3 Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 38

Bảng 2.4 Thành phần hỗn hợp dung dịch trong giếng đo 51

Bảng 3.1 Tóm tắt các mô hình docking phân tử trong nghiên cứu 57

Bảng 3.2 Các thư viện hợp chất được dùng để sàng lọc ảo 58

Bảng 3.3 Kết quả sàng lọc qua các mô hình 3D-pharmacophore tìm chất gắn kết trênIL-8 58

Bảng 3.4 Kết quả sàng lọc qua các mô hình 3D-pharmacophore tìm chất gắn kết trênCXCR1/2 59

Bảng 3.5 Các chất gắn kết trên CXCR2 có điểm số docking ≤ –20 kJ.mol-1 và sựtương tác 65

Bảng 3.6 Kết quả dự đoán độc tính của các chất 72

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá mô hình A 74

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá mô hình B 74

Bảng 3.9 Kết quả “redocking” EBX vào vị trí gắn kết của CXCR2 76

Bảng 3.10 Các chất gắn kết trên CXCR2 với điểm số docking và sự tương tác tốt hơnphối tử đồng kết tinh EBX 77

Bảng 3.11 Giá trị RMSF của các acid amin trong khoang gắn kết khi MDs phức hợpba phối tử với CXCR2 78 Bảng 3.12 Dự đoán ADMET của EBX và hai chất tiềm năng 80 Bảng 3.13 Kết quả đánh giá ức chế tương tác IL-8/CXCR2 của các chất thử nghiệm

tại nồng độ 100 μM 82 Bảng 4.1 Một số nghiên cứu sàng lọc SMPPII sử dụng mô hình pharmacophore

dựa trên PPI 90 Bảng 4.2 Nghiên cứu gắn kết docking phân tử trên mục tiêu IL-8 93 Bảng 4.3 Kết quả sàng lọc in silico ở nghiên cứu hiện tại và các nghiên cứu đã

công bố 107 Bảng 4.4 Các nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế gắn kết 111 Bảng 4.5 Các nghiên cứu về sự tăng sinh tế bào ung thư tuyến tiền liệt do IL-8

kích thích 112 Bảng 4.6 Các nghiên cứu về sự tăng sinh của một số dòng tế bào ung thư qua

trung gian IL-8 113 Bảng 4.7 Hiệu quả ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư tuyến tiền liệt của một số

dẫn xuất benzamid 117 Bảng 4.8 Tác dụng chống tăng sinh tế bào ung thư của tectochrysin 119

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc tinh thể IL-8 monomer 4

Hình 1.2 Minh họa cấu trúc CXCR1/2 trong phức IL-8/CXCR1/2/protein G 5

Hình 1.3 Minh họa vị trí tương tác giữa IL-8 với thụ thể CXCR1 (8IC0) và CXCR2(6LFO) 6

Hình 1.4 Sự tương tác giữa IL-8 và kháng thể LY3041658 8

Hình 1.5 Sự tương tác giữa CXCR2 và chất ức chế EBX 8

Hình 1.6 Con đường dẫn truyền tín hiệu của IL-8/CXCR1/2 9

Hình 1.7 Cơ sở docking bằng công cụ FlexX/ LeadIT 16

Hình 1.8 Minh họa phương pháp đo lường sự gắn kết (A) ITC và (B) SPR 22

Hình 1.9 Kit thử nghiệm gắn kết IL-8/CXCR1/2 của hãng RayBioTech® 25

Hình 1.10 Cấu trúc của MTT và sản phẩm có màu formazan 27

Hình 2.1 Tóm tắt sơ đồ nghiên cứu sàng lọc dựa trên cấu trúc 34

Hình 2.2 Minh họa giao diện PLIF trong phần mềm MOE 2015.10 40

Hình 2.3 Cấu trúc các chất ức chế CXCR2 vị trí allosteric . 41

Hình 2.4 Tóm tắt các bước tiến hành mô phỏng động lực học phân tử 45

Hình 2.5 Tóm tắt các bước tiến hành thử nghiệm ức chế tương tác 49

Hình 2.6 Tóm tắt thử nghiệm đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư doIL-8 cám ứng 52

Hình 3.1 Mô hình PhIL8-CXCR1 (A) và PhCXCR1-IL8 (B) 54

Hình 3.2 Mô hình PhIL8-CXCR2 (A) và PhCXCR2-IL-8 (B) 55

Hình 3.3 Mô hình PhIL8-LY3041658-S1 (A) và PhIL8-LY3041658-S2 (B) 56

Hình 3.4 Mô hình docking phân tử (vùng màu xanh): (A) D-IL8-CXCR1/2 và(B) D-IL8-LY3041658 57

Hình 3.5 Mô hình docking phân tử (vùng màu xanh): (A) D-CXCR1-IL8 và(B) D-CXCR2-IL8 57

Hình 3.6 Tỷ lệ chất dock thành công qua các mô hình gắn kết docking phân tử 59

Hình 3.7 Sự phân bố chất dock thành công theo khoảng điểm số docking 60

Hình 3.8 Sự tương tác của 4 chất tiềm năng trên khoang D-IL8-CXCR1 61

Hình 3.9 Sự tương tác của 11 chất tiềm năng trên khoang D-IL8-CXCR2 61

Hình 3.10 Sự tương tác của 4 chất tiềm năng trên khoang D-IL8-LY3041658 62

Hình 3.11 Phân tích PLIF các chất trong khoang gắn kết của IL−8 với CXCR1 (A),CXCR2 (B) và kháng thể LY3041658 (C) 62

Hình 3.12 Phân tích PLIF các chất trong khoang gắn kết của CXCR1/2 63

Hình 3.13 Sự tương tác của 19 chất tiềm năng trên khoang D-CXCR1-IL8 64

Hình 3.14 RMSD của 19 phức hợp tiềm năng 67

Hình 3.15 RMSF của protein tự do/phức hợp của các chất tiềm năng 68

Hình 3.16 Tỷ lệ liên kết hydro của các chất thuộc ngân hàng thuốc (DB) với acid amincủa CXCR2 trong quá trình MDs 100ns 69

Hình 3.17 Tỷ lệ liên kết hydro của các chất thuộc thư viện ZINC (A), HCPLNB (B)và CCVKN (C) với acid amin của CXCR2 trong quá trình MDs 100ns 70

Hình 3.18 Năng lượng gắn kết tự do của 19 chất trong phức hợp với CXCR2 71

Hình 3.19 Biểu đồ “BOILED-Egg” của các chất phân tích 72

Hình 3.20 Mô hình A 73

Hình 3.21 Mô hình PhCXCR2-EBX và sự gióng hàng lên CXCR2 75

Hình 3.22 Mô hình gắn kết docking phân tử D-CXCR2-EBX (A) và 10 cấu dạngredocking của EBX trong khoang gắn CXCR2 (B) 75

Hình 3.23 Kết quả gắn kết docking phân tử qua mô hình D-CXCR2-EBX 76

Hình 3.24 Kết quả MDs của phức CXCR2/ZINC77105530 78

Hình 3.25 Kết quả MDs của phức CXCR2/ZINC93176465 79

Hình 3.26 Năng lượng gắn kết tự do của phức hợp CXCR2 và ZINC77105530,ZINC93176465, EBX 79

Hình 3.27 Tóm tắt kết quả nghiên cứu sàng lọc in silico . 81

Hình 3.28 Hiệu quả ức chế tương tác IL-8/CXCR2 của ba chất tiềm năng theonồng độ 83

Hình 3.29 Sự tăng sinh các dòng tế bào ung thư được cám ứng bởi IL-8 84

Hình 3.30 Tác động của IL-8 100 ng/mLvà/hoặc các chất thử nghiệm tại nồng độ100 µM lên sự sống sót tế bào LNCaP 85

Hình 3.31 Tỷ lệ tế bào sống do tác động IL-8 và 6 chất thử nghiệm theo nồng độ 86 Hình 3.32 Tỷ lệ tế bào sống do tác động của 6 chất thử nghiệm theo nồng độ 87 Hình 4.1 RMSD của các phức hợp CXCR2 với DB07754, ZINC1251190, acid usnic

và cefixim 97 Hình 4.2 Minh họa vị trí các phối tử trong khoang gắn kết CXCR2 ở thời điểm 0 ns

(xanh lá), 50 ns (cam) và 100 ns (xanh dương) (A) DB07754, (B) ZINC1251190,(C) acid usnic và (D) cefixim 97 Hình 4.3 Các nhóm cấu trúc của 6 hợp chất tiềm năng tham gia tương tác với acid

amin quan trọng của CXCR2 trong quá trình MDs 100 Hình 4.4 Sự tương tác của bốn phối tử đại diện cho 4 thư viện chất tại khoang gắn kết

CXCR2 trong quá trình gắn kết docking phân tử (A) và MDs 100 ns (B) 101 Hình 4.5 Nhóm cấu trúc có khả năng gây độc tính (in đậm) của ZINC0220077 và

DB15327 104 Hình 4.6 (A) Tương tác giữa CXCR2 và EBX1 (B) Sự gióng hàng EBX1 (xanh lá),

ZINC77105530 (cam) và ZINC93176465 (xanh dương) lên mô hìnhpharmacophore PhCXCR2-EBX 106 Hình 4.7 Cấu trúc 2D của ZINC77105530 (A1), ZINC93176465 (A2) và sự hình

thành tương tác của hai phối tử trong docking phân tử (B1,B2) và MDs (C1,C2) 108Hình 4.8 Năng lượng gắn kết mỗi acid amin của CXCR2 với hai chất tiềm năng 109 Hình 4.9 Minh họa vị trí của ba chất tiềm năng và ELR motif của IL-8 trong khoang

CXCR2 từ kết quả docking phân tử 110

ĐẶT VẤN ĐỀ

Interleukin (IL)-8, thuộc họ chemokin, là yếu tố tiền viêm đóng vai trò thenchốt trong việc kích hoạt bạch cầu trung tính và liên quan đến các bệnh lý viêm nhưbệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD), hen phế quản, vẩy nến hoặc viêm khớp dạngthấp.1 Nhiều bằng chứng cũng cho thấy IL-8 thúc đẩy sự hình thành mạch, tăng sinh,di chuyển, xâm lấn và di căn của tế bào ung thư phổi, vú, ruột kết, bàng quang, tuyếntiền liệt, gan, tử cung hay một dòng tế bào khối u khác.2,3 Vai trò IL-8 được thể hiệnqua sự gắn kết với hai thụ thể kết hợp protein G (GPCR), là CXCR1 và CXCR2, tại vị

trí hoạt động (orthosteric) ở ngoại bào Bên cạnh đó, một vùng gắn kết dị lập thể nộibào (allosteric) cũng đã được phát hiện trong cấu trúc thực nghiệm của các phức hợp

phối tử và GPCR.1,4-6 Các chất tác động ở vị trí allosteric nội bào có thể điều chỉnh

chức năng của thụ thể dẫn đến ảnh hưởng tới sự liên kết của phối tử nội sinh (IL-8) vàGPCR (CXCR1/2).5 Do đó, tìm kiếm các chất gắn kết vào vị trí orthosteric hoặcallosteric, ngăn chặn tương tác IL-8/CXCR1/2, có thể là các chiến lược phát triển

thuốc hiệu quả để phát hiện liệu pháp mới trong điều trị các bệnh lý kể trên

Trong hai thập kỷ qua, một số kháng thể đơn dòng (ABX-IL8, HuMax IL-8),thuốc có nguồn gốc peptid (CXCL8 K11R G31P), acid nuleic (miR-155, miR-708) vớiđích tác động là IL-8/CXCR1/2 đã được nghiên cứu.5,7 Những liệu pháp sinh học nàycho thấy điểm yếu không thể tránh khỏi như nguy cơ nhiễm khuẩn, chi phí cao và yêucầu tiêm tĩnh mạch.8 Ngược lại, chất ức chế phân tử nhỏ với ưu điểm rẻ hơn và có thểđược dùng bằng đường uống, các chất đối kháng phân tử nhỏ thụ thể CXCR1/2(AZD5069, danirixin, elubrixin, navarixin, SX-682 hay reparixin) đã được khám phávà thử nghiệm lâm sàng.3-5,7,9 Tuy nhiên, những chất này đều tác động trên thụ thể tại vị

trí allosteric và chưa có thuốc nào được phê duyệt điều trị hoặc một số thuốc đã thất

bại trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng vì hiệu quả thấp (elubrixin hay danirixin trênbệnh nhân COPD, viêm ruột hay xơ nang) hoặc đặc tính dược động học kém (SX-56).5,10 Các nghiên cứu với cách tiếp cận dựa trên phối tử tại vị trí allosteric của nhóm

tác giả Madea,11 Ha,12 Thái Khắc Minh13 hoặc Lê Minh Trí và cộng sự14 đã sử dụng môhình tương đồng CXCR2 và thực hiện docking phân tử bằng cách dự đoán khoang gắnkết

trên thụ thể hay nghiên cứu in silico của nhóm tác giả Boraek15 tiến hành docking mùtrên toàn bộ IL-8 Theo đó, kết quả thu được ở những nghiên cứu trên cho thấy các ứngviên tiềm năng có cách thức tương tác khác nhau với CXCR211,12 hoặc tiềm năng gắnkết yếu trên IL-8.15 Hơn nữa, cho đến nay chưa có phân tử nhỏ ức chế IL-8/CXCR1/2

tại vị trí orthosteric được nghiên cứu và công bố với lý do chính đến từ việc thiếu cấu

trúc thực nghiệm và thông tin tương tác trong phức hợp IL-8 và thụ thể tại vị trí này.4,6

Hiện nay, thiết kế thuốc có sự hỗ trợ của máy tính (CADD) hay còn gọi phương

pháp in silico là công cụ hỗ trợ đắc lực, góp phần đẩy nhanh quá trình phát triển thuốc

một cách hiệu quả hơn về chi phí cũng như giảm thiểu thất bại trong các giai đoạn thửnghiệm cuối.16 Trong CADD, thông tin cấu trúc protein là yếu tố cần thiết, đồng thời tỷlệ sàng lọc các chất tiềm năng cao với ái lực gắn kết tốt đạt được khi xác định vị trítương tác protein-protein (PPI).4 Đáng chú ý, các cấu trúc phức hợp của IL-8và CXCR1/2 được công bố (2020-2023) bằng các phương pháp hiện đại như tinh thểhọc tia X (X-ray) hoặc kính hiển vi điện tử đông lạnh (cryo-EM)6,17,18, là những cấutrúc có độ chính xác cao hơn so với mô hình tương đồng sử dụng trong nhiềunghiên cứu trước.11-14 Đồng thời, với các cấu trúc mới này, PPI tại những acid amin

quan trọng (hot-spot/key residue) được xác định thông qua nghiên cứu thực

nghiệm đột biến điểm.6,17,18 Đây là cơ sở cho nghiên cứu in silico dựa trên cấu trúc để

sàng lọc các phân tử nhỏ tiềm năng ức chế IL-8/CXCR1/2 trước khi đưa vào thử

nghiệm in vitro Do vậy, đề tài “Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế

3 Đánh giá khả năng ức chế tương tác IL-8/CXCR2 và ức chế tăng sinh tế bào ung thư

qua trung gian IL-8 của các chất tiềm năng bằng thử nghiệm in vitro.

1.1.1 Cấu trúc của interleukin-8 và thụ thể1.1.1.1 Cấu trúc của interleukin-8

IL-8 lần đầu tiên được tổng hợp dưới dạng protein ban đầu có 99 acid amin vàsau khi cắt chuỗi tín hiệu (peptid signal) 22 acid amin tạo ra dạng trưởng thành,thường được kí hiệu là IL-8(1-77) Quá trình xử lý ngoại bào bằng cách cắt đầu N thu

được nhiều biến thể (Bảng 1.1), trong đó biến thể IL-8(6-77) là dạng phổ biến nhất

với 72 acid amin và trọng lượng phân tử 8,383 kDa.21,22 Việc loại bỏ 5-8 acid aminlàm tăng đáng kể hoạt tính của IL-8, có thể gấp 30 lần so với IL-8(1-77).3

Bảng 1.1 Các dạng biến thể tự nhiên của IL-8.

IL-8 có thể tồn tại thuận nghịch dưới dạng monomer hoặc dimer Cấu trúc

monomer của IL-8 như mô tả ở Hình 1.1 (minh họa từ mã PDB 4XDX, độ phân giải0,95 Å) với một chuỗi ngắn, hình dạng linh động ở đầu N, ba sợi β đối song song

(β1,2,3-strands) nối với nhau bởi các vòng 30s, 40s, 50s và một chuỗi xoắn α (α-helix)kéo dài từ phân tử acid amin thứ 57 đến đầu C Cấu trúc ổn định bởi cầu nối disulfidđược hình thành bởi Cys7-Cys34 và Cys9-Cys50 Hai acid amin cystein (Cys7 vàCys9) được phân tách bằng Gln8.9,21-23 Trình tự ba acid amin là Glu4-Leu5-Arg6 (môtíp ELR) được chứng minh có vai trò rất quan trọng trong việc tương tác với các thụthể.3

Hình 1.1 Cấu trúc tinh thể IL-8 monomer1.1.1.2 Cấu trúc thụ thể của interleukin-8

CXCR1 và CXCR2 là thụ thể của IL-8, thuộc họ thụ thể liên kết với protein G(GPCR), chứa bảy vòng xoắn alpha, mỗi vòng kéo dài theo độ dày lớp phospholipid

kép của màng tế bào như minh họa ở Hình 1.2 với mã PDB 8IC0 (IL-8/CXCR1)18 và6LFO (IL-8/CXCR2).6 CXCR1 và CXCR2 là các protein gồm lần lượt 350 và 360 acidamin, cấu trúc giống nhau 76% và hiệu lực liên kết với IL-8 cũng tương tự nhau (Kd ≈4 nM) Điểm khác biệt lớn giữa hai thụ thể này là ở vòng ngoại bào thứ 2 và CXCR2có thể tương tác với các ELR chemokin khác (CXCL1-3, CXCL5-7) với ái lực cao hơnCXCR1 Cấu trúc của các thụ thể CXCR1/2 gồm bảy miền xuyên màng (TMD), bavòng ngoại bào (ECL1-3) và ba vòng nội bào (ICL1-3) Đầu N gồm miền xuyên màng4

(TMD4) và vòng 2 ngoại bào (ECL2) của CXCR1/2 đóng vai trò rất quan trọng khi liênkết với phối tử và thể hiện hoạt tính đặc hiệu.3,6,9,24

Hình 1.2 Minh họa cấu trúc CXCR1/2 trong phức IL-8/CXCR1/2/protein G

Việc xác định cấu trúc của protein với độ phân giải cao là rất cần thiết trong quátrình thiết kế thuốc.25 Các cấu trúc protein của IL-8 hoặc CXCR1/2 được phát hiệnbằng các phương pháp hiện đại như tinh thể học tia X (X-ray) hoặc kính hiển vi điện

tử đông lạnh (Cryo-EM) tính tới thời điểm hiện nay được liệt kê như Bảng 1.2.

Bảng 1.2 Dữ liệu cấu trúc protein IL-8/CXCR1/2Cấu trúc

xác định

Độphân

giải

IL-8/CXCR1/protein G 8IC0 Cryo-EM 3,41 Å CXCR1: AIL-8: F Ishimoto (2023)IL-8/CXCR2/

protein G 6LFO Cryo-EM 3,40 Å CXCR2: EIL-8: D Liu (2020)IL-8/

LY3041658 6WZM X-ray 2,28 Å LY3041685:IL-8: E/F

A/B/C/D

Boyles (2020)

EBX: B Liu (2020)

1.1.2 Sự TƯƠng tác IL-8/CXCR1/2

IL-8 thể hiện tác dụng thông qua gắn kết cùng hai thụ thể liên kết với protein G,CXCR1 và CXCR2, được đồng biểu hiện rộng rãi trong các tế bào như bạch cầu trungtính, bạch cầu đơn nhân, tế bào lympho Các nghiên cứu trước đây đã đề xuất một cơ

chế tương tác giữa IL-8 với CXCR1/2 tại vị trí hoạt động như Hình 1.3 (minh họa từ

cấu trúc phức hợp với mã ngân hàng dữ liệu protein (PDB) lần lượt là 8IC018 và6LFO6)

- Vị trí 1: Vòng N (N-loop) của IL-8 và đầu N của thụ thể.- Vị trí 2: Đầu N của IL-8 và các acid amin ở vòng ngoại bào của thụ thể.Hơn nữa, trong khi vị trí 1 chịu trách nhiệm huy động IL-8 ban đầu, thì các tương tác ởvị trí 2 được cho là đóng vai trò quan trọng trong việc kích hoạt CXCR1/2.3,9,17,26

Hình 1.3 Minh họa vị trí TƯƠng tác giữa IL-8 với thụ thể CXCR1 (8IC0) và

CXCR2 (6LFO)

Thông tin tương tác tại vị trí 2 đã được xác định rõ trong công bố của các nhómtác giả Ishimoto (IL-8/CXCR1)18 và Liu (IL-8/CXCR2).6 Đặc biệt, các nghiên cứu trêncũng ghi nhận những acid amin quan trọng tham gia gắn kết tại vị trí này thông qua

thử nghiệm đột biến điểm (Bảng 1.3).

Glu4* (Nhận) Liên kết hydro (cho)

Arg269 Tyr188*

Arg208*/Arg212*/Glu4* (–) Liên kết cầu muối (+)

Arg278*Glu4* (Nhận) Liên kết hydro (cho) CXCR2 Tyr197*

Leu5* (Cho) Liên kết hydro (nhận) PDB Tyr197*Arg6* (Cho) Liên kết hydro (nhận) 6LFO) Thr285

Ghi chú: *Các acid amin quan trọng cho sự gắn kết giữa chemokin và thụ thể, PDB(protein data bank): ngân hàng dữ liệu protein

Cụ thể, Glu4, Leu5 và Arg6 thuộc mô típ ELR khi được thay thế bằng Alacho thấy sự giảm ái lực gắn kết với thụ thể lần lượt khoảng 100, 100 và 1000 lần.27

Ishimoto và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm và cho kết luận với các đột biến trên mộtsố acid amin của CXCR1, như Tyr188, Arg203 và Asp265 thành Ala dẫn đến giảmkhả năng gắn kết của thụ thể lên IL-8 so với CXCR1 tự nhiên.18 Tương tự, nhóm tácgiả Liu cũng xác nhận các đột biến tại Tyr197, Arg208, Arg212 và Arg278 trênCXCR2 gây giảm sự gắn kết của với IL-8 cũng như hoạt tính của thụ thể.6

Bên cạnh đó, cấu trúc IL-8 và kháng thể LY3041658 (6WZM) hay phức hợp

thụ thể CXCR2 và chất ức chế allosteric EBX (6LFL) cũng như sự tương tác lần lượt

được mô tả ở Hình 1.4 và Hình 1.5.6,17

Hình 1.4 Sự TƯơng tác giữa IL-8 và kháng thể LY3041658

(a)Cấu trúc tia X của phức hợp IL-8/LY3041658 (Mã PDB 6WZM) và các vị trí liênkết (b) và (c) các acid amin quan trọng trên bề mặt liên kết của IL-8 (cam) và khángthể LY3041658: chuỗi nặng (xám) và chuỗi nhẹ (hồng)

(A) Cấu trúc X-ray của phức CXCR2/EBX (6LFL), (B) Một số acid amin ở vị tríliên kết của thụ thể CXCR2 (đỏ) và EBX (xám)

1.1.3 Quá trình dẫn truyền tín hiệu IL-8/CXCR1/2

Đường dẫn truyền tín hiệu qua trung gian protein G bắt đầu bằng sự gắn kết củaIL-8 với thụ thể của nó dẫn đến sự phân ly của tiểu đơn vị Gβγ và Gα từ G proteinα βγ,Gα liên kết với vòng nội bào 2, 3 và đầu C của thụ thể (Hình 1.6).3

Đối với tín hiệu qua trung gian CXCR1/2, Gα chủ yếu thuộc loại Gα ức chế(Gαi) Gαi ức chế chức năng của adenylyl cyclase làm giảm adenosin monophosphatvòng (cAMP) Còn tiểu đơn vị Gβγ kích hoạt phospholipase C (PLC) β2 chuyển đổiphosphatidylinositol (4,5)-biphosphat (PIP2) thành inositol 1,4,5-trisphotphat (IP3) vàdiacylglycerol (DAG) Kết quả gây ra sự giải phóng Ca2+ từ lưới nội chất vào bàotương và kích hoạt các protein kinase nhạy cám với Ca2+ như protein kinase C (PKC).Đồng thời, sự kích hoạt con đường tín hiệu PKC phụ thuộc phospholipase C cũng đặctrưng cho các tế bào ung thư sau khi được kích thích bằng IL-8 Hơn nữa,phosphoinositid 3- kinase (PI3K) sẽ được kích hoạt bởi tiểu đơn vị Gβγ, chuyển PIP2thành phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphat (PIP3) dẫn đến kích hoạt GTPase Rac,phosphokinase B (PKB hoặc Akt) và kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào (ERK1/2)

ERK1/2 cũng có thể được kích hoạt bằng con đường tín hiệu cổ điển ERK mà việc kích hoạt có thể phụ thuộc vào hoạt động PI3K.9,24,26

Ras-Raf-MEK-Kết quả của các quá trình truyền tín hiệu qua trung gian protein G trên tạo racác chức năng bạch cầu trung tính (NEU) như polymer hóa actin (cần thiết cho sự dichuyển của NEU), tái điều chỉnh và kích hoạt sự kết dính phân tử, hóa ứng động, thựcbào, và hình thành bẫy ngoại bào bạch cầu trung tính (NET) Ngoài ra, trục tín hiệu IL-8/CXCR1/2 còn liên quan đến sự tăng sinh, di chuyển và xâm lấn của các tế bào ungthư thông qua kích hoạt các tầng tín hiệu xuôi dòng như PIP3/Akt, Ras-Raf-MEK-ERK hay JAK/STAT3.2,3

1.1.4 Vai trò của IL-8/CXCR1/2 trong các bệnh lý1.1.4.1 IL-8 và các bệnh lý viêm

Viêm là phản ứng phức tạp của cơ thể tại mô liên kết nhằm loại trừ tác nhân gâyviêm và sửa chữa tổn thương Cho dù là một cơ chế bảo vệ cơ thể chống lại các yếu tốgây bệnh, viêm cũng là phản ứng bệnh lý Sự gia tăng các chất trung gian gây viêmnhư IL-8 dẫn đến trầm trọng phản ứng viêm gây đau, tổn thương mô lành và rối loạnchức năng cơ quan Đồng thời, tương tác giữa IL-8 và thụ thể CXCR1/2 đã đượcchứng minh có liên quan đến một số bệnh lý viêm phổ biến như viêm phổi tắc nghẽnmạn tính (COPD), hen phế quản, xơ nang, bệnh viêm ruột.2,3,9,19,28

1.1.4.2 IL-8 và bệnh lý ung THƯ

Hiện nay, nhiều nghiên cứu chỉ ra mối liên hệ mật thiết giữa IL-8 và sự pháttriển, di căn của khối u ác tính Các tế bào khối u thường biểu hiện quá mức IL-8, quađó tăng cường các tín hiệu dẫn truyền tác động đến tế bào ung thư, tế bào nội mô vàđại thực bào thông qua hai thụ thể CXCR1/2 Nhờ vào các con đường tín hiệu tự kíchhoạt, IL-8 thúc đẩy sự tăng sinh của chính các tế bào ung thư tiết ra chemokin này.Thêm vào đó, tế bào nội mô mao mạch khối u cũng được hoạt hóa dẫn đến tăng cườngsự hình thành mạch máu mới và thu hút bạch cầu trung tính tập trung tại vị trí khối u.Song song với việc đẩy mạnh sự xâm lấn, di căn đến các mô hoặc cơ quan lân cận củatế bào ung thư, IL-8 còn cám ứng đại thực bào tiết các yếu tố tăng trưởng dẫn đến sựtăng sinh tế bào tại vị trí khối u.3,9,21,22,24,26,28,29

1.1.4.3 IL-8 và bệnh lý khác

Ngoài nồng độ IL-8 tăng cao được tìm thấy trong mô viêm và tuần hoàn máutrong một số bệnh lý viêm và ung thư, IL-8/CXCR1/2 còn tham gia vào cơ chế bệnh

sinh của các bệnh tim mạch, thần kinh, tự miễn, thận và bệnh nhiễm trùng Bảng 1.4

mô tả tóm tắt vai trò của IL-8/CXCR1/2 trong một số nhóm bệnh chính.1-3,9

Bảng 1.4 Vai trò của IL8-CXCR1/2

IL8-CXCR1/2

Bệnh viêm khớp Huy động và kích hoạt NEU, thúc đẩy sự hình thành mạch và duy trì

sự ổn định kiểu hình sụn trong viêm xương khớp mạn tínhTổn thương phổi

cấp/ Hội chứngsuy hô hấp cấp

Huy động NEU dẫn đến tổn thương phổi liên quan đến tế bào này Các phức hợp miễn dịch của các tự kháng thể chống IL-8 ngăn chặn quá trình chết theo chương trình của bạch cầu trung tính tự phátHen phế quản Huy động NEU, gây co thắt phế quản bằng cách kích thích các tế bào

cơ trơn đường thở biểu hiện CXCR1/2Viêm phổi tắc

nghẽn mạn tính Xơ hóa phổi tự phát

Huy động NEU và đại thực bào biểu hiện CXCR2, protease từ NEUphá hủy các mô

Huy động NEU, thúc đẩy sự hình thành mạch, lắng đọng collagen và xơ hóa

Ung thư Thúc đẩy sự sống sót, tăng sinh và di chuyển của tế bào khối u

Kích thích hình thành mạch máu mới trong tế bào khối uThúc đẩy sự xâm lấn và di căn

Huy động bạch cầu trung tính liên quan đến khối uKích thích giải phóng NET

Huy động đại thực bào liên quan đến khối u và miễn dịchBệnh vẩy nến Kích thích sự tự tiết của các tế bào sừng biểu hiện CXCR2 gây tổn

thương da, huy động NEU, kích thích tạo mạchBệnh viêm ruột Huy động và kích hoạt NEU, đại thực bào, gây viêmTăng huyết áp

động mạchXơ vữa độngmạch

Thúc đẩy tăng huyết áp và rối loạn chức năng mạch máu bằng cách huy động tế bào tiền viêm CCR2+

Tạo sự kết dính và hóa ứng động các tế bào biểu hiện CXCR2 và NEU,dẫn đến hình thành mảng xơ vữa

Bệnh thận Huy động NEU và gây tổn thương thậnCOVID-19 Tăng hoạt hóa NEU trong máu, phổi với phân giải protein

Hình thành NET

1.1.5 Các liệu pháp điều trị với mục tiêu IL-8/CXCR1/2

IL-8 và thụ thể CXCR1/2 đã được chứng minh là mục tiêu điều trị đầy hứa hẹntrong nhiều bệnh lý Theo đó, hầu hết nghiên cứu lâm sàng tập trung vào việc ức chếtương tác giữa chemokin và thụ thể bằng cách sử dụng các thuốc cấu trúc phân tử nhỏ,kháng thể đơn dòng hoặc thuốc peptid có nguồn gốc từ IL-8 hoặc CXCR1/2 Trong số

các nhóm kể trên, các chất phân tử nhỏ đối kháng CXCR1/2 ở vị trí allosteric nội bào

rất được quan tâm.2,3,5,9,23 Một số thuốc đang nghiên cứu ở giai đoạn thử nghiệm lâm

sàng được liệt kê ở Bảng 1.5.

Bảng 1.5 Một số thuốc phân tử nhỏ ức chế

CXCR1/2 allosteric trong giai đoạn thử nghiệm

lâm sàngTên thuốc

(công ty)

Reparixin*/

Chỉ định Thử nghiệm lâm sàng mới nhất

Ghép tụy NCT01967888 (Pha 2/3: hoàn thành)Repertaxin

* Rối loạn chức năng mô ghép NCT00248040, NCT03031470,

(AstraZeneca) Viêm tuyến mồ hôi NCT05348681 (Pha 2: đang thực hiện)(Dompé) sau ghép thận, gan, phổi NCT00224406 (Pha 2: hoàn thành)

Ung thư vú NCT05212701 (Pha 2: đang thực hiện)COVID-19 NCT05254990 (Pha 3: đang thực hiện)Ladarixin*

(Dompé) Đái tháo đường típ 1 NCT04628481 (Pha 3: đang thực hiện)SX-682* Khối u rắn tiến triển NCT04574583 (Pha 2: đang thực hiện)(Syntrix) U thần kinh đệm NCT04245397 (Pha 1: đang thực hiện)

Ung thư trực tràng NCT04599140 (Pha 2: đang thực hiện)Ung thư biểu mô tụy di căn NCT04477343 (Pha 1: đang thực hiện)Navarixin* Bệnh vảy nến NCT00684593 (Pha 2: hoàn thành)(Merck) Khối u rắn tiến triển/ di căn NCT03473925 (Pha 2: hoàn thành)

Hen phế quản NCT00688467 (Pha 2: hoàn thành)Elubrixin**

Ung thư tuyến tiền liệt di căn NCT03177187 (Pha 2: đang thực hiện)Khối u rắn tiến triển và ung

thư đầu cổ NCT02499328 (Pha 2: đang thực hiện)AZD4721** Mụn mủ lòng bàn tay NCT05194839 (Pha 2: đang thực hiện)

Tuy nhiên, tại vị trí orthosteric cho đến nay vẫn chưa có phân tử nhỏ ức chế

IL-8/CXCR1/2 được công bố, bởi sự tương tác giữa IL-8 và thụ thể chưa được xác định

cụ thể Các nghiên cứu in silico trước đây chỉ ghi nhận thông tin gắn kết gồm vòng N

của IL-8 (acid amin 1-20) tiếp cận với đầu N của thụ thể (acid amin 1-35) và đầu Ncủa IL-8 (mô típ ELR) với các acid amin ở vòng ngoại bào của thụ thể (ECL1-3).3,9,17,26

Bề mặt tương tác protein-protein (PPI) lớn không phải là mục tiêu lý tưởng của sựkhám phá và phát triển thuốc phân tử nhỏ.30 Do đó, một số nghiên cứu thực hiện theohướng thiết kế và tổng hợp thuốc cấu trúc sinh học có nguồn gốc từ IL-8 hoặcCXCR1/2 tham gia tại các vùng gắn kết trên để ngăn chặn tương tác giữa chemokin vàthụ thể.7,31,32 Khi bề mặt tương tác giữa IL-8 và thụ thể CXCR1/2 cùng với các acidamin quan trọng tại vùng này được xác định rõ sẽ là một chiến lược tiềm năng trongthiết kế thuốc phân tử nhỏ ức chế PPI

1.2 Nghiên cứu sàng lọc in silico

Thiết kế thuốc có sự hỗ trợ của máy tính (computer-aided drug design, CADD)đã được áp dụng rộng rãi trong giai đoạn đầu của quá trình khám phá thuốc và gópphần đẩy nhanh quá trình phát triển thuốc một cách hiệu quả hơn về chi phí cũng nhưgiảm thiểu thất bại trong các giai đoạn thử nghiệm cuối.16 Nhìn chung, CADD có thểđược phân loại thành thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc, thiết kế thuốc trên phối tử và

thiết kế thuốc de novo Dưới đây là phần mô tả cụ thể một số phương pháp chính

thường được sử dụng trong thiết kế thuốc

1.2.1 Mô hình pharmacophore1.2.1.1 Khái niệm

Pharmacophore là tập hợp tất cả các đặc tính không gian và điện tử cần thiết đểđảm bảo cho sự tương tác tối ưu của phân tử xác định với mục tiêu là cấu trúc sinh họcchuyên biệt để hoạt hóa (hay ức chế) đáp ứng sinh học của mục tiêu này.Pharmacophore không đại diện cho một phân tử hoặc nhóm chức cụ thể nào, khái niệmnày đơn thuần mô tả khả năng tương tác phân tử chung của một nhóm hoạt chất đốivới cấu trúc mục tiêu Pharmacophore được xem như mẫu số chung lớn nhất của tậphợp các phân tử có hoạt tính Mô hình pharmacophore được xác định bằng các yếu tốcó khả năng tạo liên

kết hydro cho/nhận, liên kết tĩnh điện âm/dương, liên kết kỵ nước hay vòng thơm và thểhiện bởi các nguyên tử, các vòng và các điểm giả định (virtual points).33

Một mô hình pharmacophore có thể được tạo ra theo hai cách, đó là mô hìnhdựa trên phối tử (LBP), trong đó một tập hợp các phân tử có hoạt tính được xếp chồnglên nhau và các đặc tính hóa học cần thiết cho hoạt tính sinh học của chúng được pháthiện Trong khi mô hình dựa trên cấu trúc (SBP) được thực hiện bằng cách thăm dòcác điểm tương tác protein và protein (PPI) hay tương tác protein và phối tử Thời giangần đây, số lượng cấu trúc 3D protein với độ phân giải cao được công bố ngày càngnhiều nên SBP cũng được quan tâm hơn.34

1.2.1.2 Mô hình pharmacophore dựa trên cấu trúc

Cách tiếp cận dựa trên cấu trúc có tên gọi như vậy vì thực tế cấu trúc 3D củaprotein là điều kiện tiên quyết để xây dựng mô hình SBP Mô hình SBP có thể đượcphân loại thành hai phân nhóm, đó là dựa trên cấu trúc phức hợp protein-phối tử (dạng

hợp protein - phối tử, việc xác định thủ công vị trí gắn kết phối tử và các điểm tươngtác chính giữa phối tử và protein mục tiêu, cùng với thông tin từ dữ liệu thực nghiệmnhư đột biến điểm trên các acid amin quan trọng sẽ tạo điều kiện thuận lợi để thiết lậpmô hình SBP Trong trường hợp chỉ có cấu trúc protein mục tiêu, các công cụ tin sinhhọc dựa trên những phương pháp khác nhau để kiểm tra bề mặt protein và tìm kiếmcác vị trí liên kết phối tử tiềm năng theo các thuộc tính khác nhau.35 Việc thiết lập vàlựa chọn các đặc tính (features) pharmacophore có thể đạt độ chính xác cao hơn khi sửdụng cấu trúc phức hợp protein - phối tử Thông tin 3D của phức hợp protein và phốitử giúp xác định và sắp xếp không gian của các đặc điểm pharmacophore tương ứngvới các nhóm chức năng có liên quan trực tiếp đến tương tác với mục tiêu Hơn nữa,sự hiện diện của phức hợp cho phép tính toán các hạn chế về không gian từ hình dạngvị trí liên kết thông qua việc bổ sung các thể tích loại trừ.33

1.2.1.3 Ứng dụng mô hình pharmacophore trong sàng lọc ảo

Trong nhiều thập kỉ qua, mô hình pharmacophore đã trở thành một trong nhữngcông cụ quan trọng của quá trình khám phá thuốc Ứng dụng phổ biến nhất của môhình

pharmacophore là trong sàng lọc ảo từ cơ sở dữ liệu hợp chất lớn nhằm xác định cácphân tử mới với các đặc điểm dược lý cần thiết có khả năng tác động lên một mục tiêucụ thể Do mô hình pharmacophore đại diện các chức năng hóa học và mối quan hệkhông gian, nên kết quả thu được thường bao gồm các hợp chất có cấu trúc đadạng.16,33,34,36 Tương tác protein-protein là mục tiêu đầy hứa hẹn để kiểm soát sự dẫntruyền tín hiệu trong cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh lý trong đó có ung thư Mô hìnhpharmacophore với các đặc tính “bắt chước” các tương tác quan trọng trên bề mặt PPIsẽ thúc đẩy việc khám phá các chất phân tử nhỏ ức chế tương tác protein-protein(SMPPII) thông qua sàng lọc ảo.36,37

1.2.2 Mô hình gắn kết docking phân tử1.2.2.1 Khái niệm

Docking phân tử (molecular docking) là một kỹ thuật thiết lập mô hình phân tửđược sử dụng để dự đoán cách một protein tương tác với các phân tử nhỏ (phối tử).38

Docking phân tử có thể được phân thành ba loại chính, bao gồm docking protein ligand, protein - acid nucleic và protein - protein Trong đó, docking protein - ligandđược nghiên cứu phổ biến nhất trong lĩnh vực thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc.39

-Docking protein - ligand lại có thể phân loại theo cách sau: (a) -Docking cố định, trongđó cả thụ thể và phối tử đều được giữ cố định; (b) Docking phối tử linh hoạt, trong đóthụ thể được giữ cố định, nhưng phối tử linh hoạt và (c) Docking linh hoạt, nghĩa làthụ thể và phối tử linh hoạt Cho đến nay, các thuật toán docking thường gặp nhất là sửdụng mô hình phối tử linh hoạt/protein cố định.34,40 Các phần mềm docking và thuậttoán tìm kiếm đã được báo cáo như FlexX, Autodock, Discovery Studio, Glid, Fredhay Gold.41 Nghiên cứu chọn công cụ FlexX tích hợp trong LeadIT 2.1.842 sử dụng đơngiản để xây dựng các mô hình docking phân tử dựa trên cấu trúc của IL-8 và thụ thểCXCR1/2

1.2.2.2 Docking phân tử bằng FlexX/LeadIT

FlexX là công cụ docking dựa trên mảnh cấu trúc với các thuật toán xây dựngtăng dần để tìm kiếm cấu dạng, gồm ba giai đoạn: (1) Lựa chọn mảnh cơ sở, có nghĩalà phân chia phối tử thành các mảnh nhỏ bằng cách cắt đứt ở các liên kết đơn khôngvòng

(2) Đặt các mảnh cơ sở được lựa chọn vào vị trí gắn kết được tạo thành do sự sắp xếp

thẳng hàng của bộ ba nguyên tử thuộc mảnh phối tử và bộ ba điểm của túi gắn kết mụctiêu Những bộ ba điểm này là tâm những quả cầu alpha thể hiện cho vị trí gắn kết vừa

khớp nhất (Hình 1.7) (3) Xây dựng phức hợp theo cách tăng dần bằng cách liên kết

với các phần còn lại của phối tử Tại mỗi giai đoạn, một cấu dạng bền nhất hay có mứcnăng lượng thấp nhất sẽ được chọn và chuyển sang bước xây dựng tiếp theo Do đó,phương pháp này phụ thuộc vào việc lựa chọn mảnh cơ sở và vị trí gắn kết.43,44 Hàm sốtính điểm phụ thuộc vào số lượng liên kết quay và diện tích bề mặt của các tương táchydro, ion, vòng thơm và kỵ nước.43

Hình 1.7 Cơ sở docking bằng công cụ FlexX/ LeadIT

Một số phương pháp đã được ghi nhận để đánh giá mô hình docking phân tử.Trong đó, một cách thường sử dụng là redocking (tái gắn kết) một hợp chất có cấudạng và hướng gắn kết đã biết vào vị trí tác động của mục tiêu, thông thường từ cấutrúc đồng kết tinh.45,46 Một phương pháp đánh giá khác là sử dụng tập decoy, gồm cáccác chất

không có hoạt tính được tạo ra từ các chất có hoạt tính đã biết với đích tác động đangnghiên cứu Sau khi xếp loại các chất trong tập decoy dựa vào điểm số docking đồ thịđường cong ROC (receiver operating characteristic) và phần diện tích dưới đườngcong (Area under the curve - AUC) của đường cong ROC được thiết lập Một mô hìnhdocking với giá trị AUC càng cao thì càng có khả năng phân loại hiệu quả chấtcó/không có hoạt tính và càng đáng tin cậy.46,47

1.2.2.3 Ứng dụng docking phân tử trong sàng lọc ảo

Các phương pháp khác nhau được kết hợp liên tiếp trong quy trình sàng lọc

in silico có tính chất phân cấp trong đó bước sau sẽ phức tạp hơn, đòi hỏi tính toán

nhiều hơn bước trước đó, đồng thời tại mỗi bước kế tiếp các hợp chất ít tiềm năngnhất sẽ bị loại bỏ.36 Như đã mô tả ở phần trên, mô hình pharmacophore phù hợp đểsàng lọc đầu tiên trên cơ sở dữ liệu lớn để xác định các hợp chất đáp ứng các yêu cầuvề chức năng hình học và hóa học đơn giản Docking phân tử được áp dụng tiếp theonhằm dự đoán cách thức liên kết cũng như ái lực gắn kết bằng cách sử dụng chứcnăng tính điểm (điểm số docking).4,16,34,36 Nhìn chung, ứng dụng chính của docking

phân tử trong quá trình sàng lọc in silico được ghi nhận:

Xác định ứng viên tiềm năng (hit): Docking phân tử thông qua chức năng tínhđiểm có thể sàng lọc một cách hiệu quả từ cơ sở dữ liệu lớn với mục đích xác định cáchợp chất có khả năng gắn kết tốt với protein mục tiêu

Tối ưu hóa ứng viên tiềm năng: Docking phân tử cũng được sử dụng để xácđịnh cấu dạng và cách thức gắn kết khi phối tử tương tác với protein, cung cấp cơ sởcho việc thiết kế các chất có hoạt tính tương tự hoặc mạnh hơn hay chọn lọc hơn.4,34,36

1.2.3.1 Mô phỏng động lực học phân tử

Mô phỏng động lực học phân tử (MDs) là quá trình dự đoán cách mà tất cảnguyên tử trong một protein hoặc một hệ thống phân tử khác chuyển động theo thờigian dựa trên một mô hình vật lý chung chi phối tương tác giữa các nguyên tử.48,49

Những mô phỏng này có thể cung cấp thông tin quan trọng ở mức độ phân tử, bao gồmthay đổi về cấu dạng, gắn kết phối tử và sự gấp cuộn protein, cũng như tiết lộ vị trí củatừng hạt

nguyên tử và vận tốc của chúng Điều quan trọng là những mô phỏng như vậy cũng cóthể dự đoán các phân tử sinh học sẽ phản ứng như thế nào ở cấp độ nguyên tử đối vớicác nhiễu loạn như đột biến, quá trình phosphoryl hóa hay proton hóa.48 Để làm đượcđiều này, quá trình mô phỏng đòi hỏi việc cung cấp thông số mô tả các năng lượngtương tác trong một “trường lực” (force field) Khi tiến hành MDs, toàn bộ hệ gồmprotein và phối tử sẽ được đặt trong một hộp giả định với dung môi nước và các ionnhằm trung hoà điện tích của hệ Sau đó, hệ sẽ được tiến hành đưa đến nhiệt độ, ápsuất nhất định bằng các mô hình bể đẳng nhiệt hoặc đẳng áp giả định nhằm mô phỏngtối đa ở mức độ máy tính môi trường sinh lý của cơ thể Các tương tác và sự thay đổicấu dạng của protein cũng như phối tử sẽ được lưu lại thành các hình ảnh quỹ đạo(trajectories) và có thể sử dụng để đánh giá độ ổn định của phức hợp trong suốt quátrình gắn kết.49

Việc ứng dụng MDs có khả năng cải thiện độ chính xác, giảm thiểu khả năngthất bại trong quá trình khám phá thuốc mới Trong vài thập kỷ qua, với sự phát triểncủa công nghệ thông tin, những cải tiến trong phần cứng máy tính, các thuật toán và cảcác phần mềm cho phép quá trình mô phỏng dài hơn và tiết kiệm tài nguyên hơn MDsvới phần cứng chuyên dụng cao đã dẫn đến sự gia tăng nhanh về tốc độ tối đa có thểđạt được, cho phép một số mô phỏng nhất định đạt khoảng thời gian mili giây Có lẽquan trọng hơn, GPU (Graphics Processing Unit - đơn vị xử lý đồ họa) đã thúc đẩyquá trình thực hiện được diễn ra nhanh gấp nhiều lần Tiềm năng ứng dụng to lớn đãdẫn đến việc phát triển nhiều gói phần mềm để phục vụ cho quá trình thực hiện MDs,bao gồm GROMACS, AMBER, NAMD, CHARMM, LAMMPS, và Desmond Bêncạnh đó, một số phần mềm khác cũng được sử dụng để hỗ trợ cho việc phân tích kếtquả có thể kể đến như MDTraj, VMD, MDAnalysis.48

1.2.3.2 Tính toán năng LƯợng gắn kết tự do

Thông qua quá trình mô phỏng động lực học phân tử, độ ổn định của sự gắn kếtgiữa protein và phối tử tại vị trí gắn kết được xác định Tuy nhiên việc định lượng khảnăng gắn kết mạnh hay yếu phải dựa vào phương pháp tính toán năng lượng gắn kết tựdo với kí hiệu là ∆Gbind Phương pháp diện tích bề mặt cơ học phân tử Poisson –Boltzman (MM/PBSA) và phương pháp diện tích bề mặt cơ học phân tử tổng quátBorn

(MM/GBSA) là những phương pháp phổ biến để ước tính năng lượng tự do gắn kếtgiữa các phối tử phân tử nhỏ với các đại phân tử sinh học Việc kết hợp giữa mô hìnhmô tả phân tử docking, mô phỏng động lực học phân tử và MM/PB(GB)SA đượcchứng minh có khả năng xác định cấu dạng phối tử liên kết chính xác hơn so với cácphương pháp docking thuần túy Phương pháp này hứa hẹn đóng vai trò vai trò chínhtrong các nghiên cứu sàng lọc ảo trong tương lai.50-53

1.2.4 Phân tích hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính

Dữ liệu về các đặc tính như hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính(ADMET) là một phần thiết yếu trong việc khám phá và phát triển các loại thuốc mới

Cả mô hình in vitro cũng như in vivo đều phải cung cấp các thông số này của thuốc,

tuy nhiên thường tốn kém nhiều thời gian và chi phí.54 Trong những thập kỷ gần đây,

các kỹ thuật in silico đã được áp dụng để dự đoán các đặc tính ADME của thuốc ở giai

đoạn đầu giúp sàng lọc nhanh chóng và toàn diện của các chất, sau đó sẽ nghiên cứu

sâu hơn với các thử nghiệm in vitro hay in vivo, tạo thuận lợi cho các phương pháp

tiếp cận khám phá và phát triển thuốc.55,56 Hiện nay, có sẵn nhiều loại phần mềm dùngđể đánh giá ADMET của các ứng viên, như phần mềm thương mại gồm CASEULTRA, DEREK, META-PC, METEOR hay GUSAR hoặc phần mềm truy cập mởtrực tuyến ADMETlab, admetSAR, pkCSM, SwissADME, ProTox 3.0 phổ biến, đượctích hợp đầy đủ với các nền tảng dự đoán ADMET, có khả năng loại trừ các chấtkhông mong muốn, giảm số lượng tổng hợp và mức độ thất bại trong các thử nghiệmtiền lâm sàng và lâm sàng.57

1.2.5 THƯ VIện các chất sàng lọc ảo1.2.5.1 THƯ VIện ngân hàng thuốc

DrugBank là một cơ sở dữ liệu trực tuyến miễn phí, cung cấp thông tin về đặcđiểm, cơ chế, tương tác, đích tác động hay thông tin tương tác của các thuốc đã đượcFDA phê duyệt cũng như các loại thuốc đang trong quá trình nghiên cứu, thử nghiệm.DrugBank phiên bản mới nhất là DrugBank 5.0 cho thấy những cải tiến đáng kể và nộidung phong phú của cơ sở dữ liệu này Điểm nổi bật phải kể đến là về số lượng, chấtlượng và tính nhất quán của chỉ định thuốc, thông tin về cách liên kết, tương tác thuốc,thông tin về ảnh hưởng của thuốc ở nhiều mức độ Thêm vào đó, thông tin về tìnhtrạng

của các thử nghiệm lâm sàng của thuốc hiện có cũng được bổ sung Sự phát triển liêntục hơn 10 năm qua với những cải tiến rõ rệt để phù hợp với nhu cầu nghiên cứu vàphát triển thuốc, DrugBank hiện là một trong những nguồn tài nguyên được sử dụngrộng rãi trên thế giới vì nội dung phong phú, chất lượng tốt và nguồn gốc chínhthống.58

ZINC là một cơ sở dữ liệu miễn phí bao gồm các hợp chất đã thương mại hóadùng trong các nghiên cứu sàng lọc ảo Được công bố vào năm 2005 bởi Irwin vàShoichet với 727.842 phân tử, đến nay ZINC tiếp tục tăng quy mô với phiên bản mớinhất ZINC20 bao gồm 1,4 tỷ chất, đa phần mua được Trong số 736 triệu phân tửgiống thuốc trong ZINC, 509 triệu sẵn có, cho phép tải xuống miễn phí ở một số địnhdạng tệp phổ biến như SMILES, mol2 hay 3D SDF.59

ZINCPharmer là một công cụ trực tuyến để sàng lọc và tìm kiếm các hợp chấttrong cơ sở dữ liệu ZINC thông qua mô hình pharmacophore ZINCPharmer cung cấpcác công cụ để xây dựng và tinh chỉnh mô hình pharmacophore trực tiếp từ cấu trúcphân tử Việc tìm kiếm 176 triệu cấu dạng từ 18,3 triệu hợp chất cần thời gian chưađến một phút Việc tìm kiếm nhanh chóng các chất từ công cụ ZINCPharmer giúp tiếtkiệm tối đa thời gian nghiên cứu và hạn chế tiêu tốn tài nguyên máy tính.60

1.2.5.3 THƯ VIện NCI (NCI database)

Thư viện NCI được phát triển từ dự án của nhóm thiết kế thuốc có sự hỗ trợmáy tính, thuộc Viện Ung thư quốc gia (Mỹ) do tiến sĩ Nicklaus đứng đầu Đây là mộtcơ sở dữ liệu tập hợp khoảng nửa triệu cấu trúc, thường dùng trong sàng lọc các chấtcho hoạt tính chống ung thư Khoảng 50% cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi các thỏathuận bảo mật với các nhà cung cấp, trong khi 50% còn lại có thể truy cập miễn phí vàđược chuyển đổi thành nhiều định dạng khác nhau Những nỗ lực hiện tại, có sự phốihợp với nhiều nhóm và công ty khác nhau, đang được tiến hành để tăng đáng kể số cấutrúc cũng như số lượng và phạm vi của các thuộc tính trong khuôn khổ của dự án này.Điều này nhằm biến thư viện NCI thành một nguồn tài nguyên lớn trong việc sàng lọc

in silico và thiết kế thuốc có sự hỗ trợ của máy tính.61

1.2.5.4 Một số cơ sở dữ liệu có khả năng tiếp cận tại Việt Nam

Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương và viện Kiểm nghiệm Thuốc thành phốHồ Chí Minh là hai cơ quan đầu ngành kiểm nghiệm, trực thuộc Bộ Y tế Trong cácviện, khoa thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu chịu trách nghiệm xây dựng ngânhàng chất chuẩn và nhiều nhiệm vụ chuyên môn khác Các viện đã thiết lập được hơn300 chất chuẩn hóa học, trên 100 chuẩn dược liệu và gần 30 chất chuẩn chiết từ dượcliệu Danh mục chất chuẩn được công bố, cập nhật và có thể tải trên trang thông tinđiện tử chính thức của các viện (http://vienkiemnghiem.gov.vn/chat-chuan-doi-chieu/).Ngoài ra, nghiên cứu còn sử dụng một tập chất phân lập nội bộ từ bộ môn Hóa Dượcgồm 29 chất thuộc nhóm flavonoid hay polyphenol

1.3 Thử nghiệm đánh giá hoạt tính in vitro

1.3.1 Thử nghiệm đánh giá khả năng TƯƠng tác protein-phối tử

Tương tác giữa các phân tử sinh học là cốt lõi của hầu hết mọi hiện tượng/phảnứng sinh học, như tương tác thụ thể - phối tử (receptor - ligand), truyền tín hiệu hayđiều hòa biểu hiện gen Tất cả đều được kiểm soát bởi sự nhận dạng gắn kết cụ thể củacác phân tử, vì vậy nhu cầu về các phương pháp để mô tả sự tương tác của các phân tửsinh học rất được các nhà nghiên cứu quan tâm Những phương pháp như vậy đã đượcphát triển và cải tiến trong những năm gần đây, có thể kể đến như phép đo nhiệt lượngchuẩn độ đẳng nhiệt (ITC), cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) hay thử nghiệm hấp thụmiễn dịch liên kết enzym (ELISA)

1.3.1.1 PHƯƠng pháp đo nhiệt LƯợng chuẩn độ đẳng nhiệt

i Nguyên tắc

Phương pháp đo nhiệt lượng chuẩn độ đẳng nhiệt là một trong những kỹ thuậtvật lý thường được sử dụng để nghiên cứu sự tương tác protein - phối tử Sự hìnhthành các tương tác protein - phối tử là một quá trình thuận nghịch do nhiệt liên quanđến sinh nhiệt hoặc hấp thụ nhiệt tùy thuộc vào kiểu liên kết, có thể được phát hiệnbằng phép đo nhiệt lượng Thiết bị ITC bao gồm hai ngăn (cell), đó là một ngăn mẫudành cho đại phân tử (protein IL-8/CXCR1/2) và ngăn còn lại là ngăn tham chiếu,

chứa dung môi Cả hai ngăn được giữ ở nhiệt độ và áp suất ổn định (Hình 1.8A).

Hình 1.8 Minh họa pHƯƠNG pháp đo LƯỜng sự gắn kết (A) ITC và (B) SPR

Phối tử được bơm từ ống tiêm vào ngăn mẫu và được chuẩn độ sau đó Trongphương pháp ITC, hai chất được đo ái lực gắn kết được trộn lẫn trong ngăn mẫu(sample cell) bằng một đầu bơm mẫu được kiểm soát bằng hệ thống vi tính Sự thayđổi nhiệt năng được đo lường tương ứng với năng lượng cần thiết để duy trì nhiệt độcủa ngăn mẫu bằng với nhiệt độ của ngăn tham chiếu (reference cell) với độ chính xác

cao Ở Hình 1.8A, trục tung của biểu đồ ITC cho thấy sự thay đổi về nhiệt trên mỗi

đơn vị thời gian (tính bằng cal/s) và trục hoành biểu thị thời gian Trong quá trìnhchuẩn độ, hệ thống điều chỉnh đầu ra theo đường cong giải phóng nhiệt và các thôngsố nhiệt động có thể được tính toán để mô tả liên kết phối tử.62,63

ii Ứng dụng

ITC là một trong những phương pháp thử nghiệm hiệu quả nhất để xác định sựtương tác với nhiều ưu điểm gồm độ nhạy và độ chính xác cao, tính ổn định, khôngcần thuốc thử hoặc protein đánh dấu Do yêu cầu thời gian dài cho mỗi lần chuẩn độvà lượng lớn protein cần thiết (khoảng 0,5 mg), ITC thường sử dụng để sàng lọc thứcấp.62,63 Barter và cộng sự đã sử dụng phương pháp ITC mô tả đặc điểm gắn kết giữa

8 monomer với CXCR1/2 tại hai vị trí bao gồm đầu N (vị trí 1) và/hoặc vòng ngoạibào 3 (vị trí 2) của thụ thể Thực hiện thử nghiệm bằng cách bơm IL-8 (0,01 đến 0,03mM) trong ngăn mẫu; ngăn đối chiếu chứa nước cất Lần đầu bơm 3 μL, sau đó mỗilần bơm

IL-là 8 μL (thực hiện 36 lần bơm) với thời gian cân bằng 5 phút giữa các lần Dữ liệu ITCđược phân tích trong Origin ITC ver5.0 (MicroCal Inc., Northampton, MA).64

1.3.1.2 PHƯƠNG pháp cộng HƯởng plasmon bề mặt

i Nguyên tắc

Cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) là một công cụ nghiên cứu về tương tác haygắn kết cho các phân tử sinh học Đo lường sự gắn kết dựa trên phương pháp SPR liênquan đến việc cố định phân tử sinh học trên bề mặt của chip cám biến đơn lớp nhưdextran carboxymethylat được gắn đồng hóa trị với bề mặt vàng Sau đó cho các dungdịch với nồng độ chất phân tích khác nhau chảy qua và liên kết liên tục với protein.Điều này dẫn đến sự thay đổi độ khúc xạ chỉ số của bề mặt kim loại và sự dịch chuyểngóc SPR Cuối cùng, việc khớp dữ liệu biểu đồ cám biến với một mô hình động họcgắn kết thích hợp cho phép tính toán các thông số động học như hằng số liên kết (ka),phân ly (kd) và ái lực gắn kết (Hình 1.8B) Kể từ lần đầu tiên được giới thiệu vào đầu

những năm 1990, SPR đã được chứng minh là một trong những công cụ tốt để xácđịnh tính đặc hiệu, ái lực và các thông số động học trong quá trình gắn kết của đạiphân tử Phương pháp này có thể xác định sự tương tác trong nhiều loại liên kết, baogồm protein-protein, protein-DNA, enzym-cơ chất hoặc chất ức chế, thụ thể-thuốc,màng lipid-protein, protein-polysacarid, tế bào hoặc virus-protein, và một số loại khác.SPR đã được ứng dụng phổ biến bởi đây là một kỹ thuật không đánh dấu, chỉ mộttrong số các phân tử tương tác phải được cố định trên bề mặt cám biến và áp dụng trênnhiều loại môi trường, bắt chước các môi trường sinh học như màng tế bào.62,65-67

ii Ứng dụng

Phương pháp SPR được nhóm tác giả Jiang sử dụng để mô tả đặc điểm gắn kếtcủa các peptid chiết xuất từ IL-8 gồm peptid p_wt14 và peptid đột biến p_K15A vớiđầu N của CXCR1 (CXCR1p) 10μM p_wt14 và p_K15A được pha loãng vào dungdịch đệm natri acetat 10mM ở pH 5,0 và cố định vào chip cám biến với tốc độ dòngchảy 5 μl/phút Dữ liệu về động học và ái lực gắn kết phối tử - thụ thể đạt được bằngcách dùng bảy nồng độ CXCR1p (0μM, 15μM, 30μM, 120μM, 240μM, 360μM và480μM) trên chip theo tuần tự ở tốc độ dòng chảy 50μl/phút trong 2 phút Tín hiệuphản hồi được

đo tại hai thời điểm 0 và 120 giây để thu được thông tin về tốc độ CXCR1p liên kết vàphân ly từ p_wt14/ p_K15A Đường cong liên kết cân bằng thu được cho mỗi peptid,từ đó xác định kd của liên kết của peptid IL-8 (p_wt14 và p_K15A) với CXCR1p.31

1.3.1.3 Thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzym (ELISA)

i Nguyên tắc

ELISA hoạt động dựa trên phản ứng kháng nguyên-kháng thể, phức hợp tạothành được đánh dấu bằng cách sử dụng các enzym như phosphatase kiềm (ALP),horseradish peroxidase (HRP) Kháng nguyên trong pha lỏng được cố định trên pharắn, ví dụ đĩa vi thể làm từ polystyren, polyvinyl clorid hay polypropylen Sau đó,kháng nguyên sẽ phản ứng với một kháng thể cụ thể, kháng thể này được phát hiện bởikháng thể thứ cấp có gắn enzym Sự thay đổi màu bằng cách sử dụng cơ chất tạo màu

tương ứng với sự hiện diện của kháng nguyên Ví dụ, ALP thủy phân para-nitrophenylphosphat (pNPP) để tạo ra para-nitrophenol, có thể được phát hiện ở bước sóng 405

nm (màu vàng) hay HRP xúc tác quá trình chuyển đổi các cơ chất như muối diamonicủa acid 2,2′-azino-bis(3- ethylbenzothiazolin)-6-sulfonic (ABTS), 3,3′,5,5′-

tetramethylbenzidin (TMB) và octo- phenylenediamin (ODP) thành sản phẩm có màu.

Các phản ứng enzym-cơ chất này thường hoàn thành trong vòng 30-60 phút và phảnứng dừng lại khi thêm dung dịch thích hợp, như natri hydroxid, acid clorhydrid, acidsulfuric hay natri carbonat cho từng phản ứng Cuối cùng, các sản phẩm có màu đượcphát hiện bằng máy đo quang phổ đa giếng và từ đó định lượng gián tiếp các chất phântích quan tâm.68-70

ii Ứng dụng

Hiện nay, nhiều bộ kit ELISA thương mại dựa trên các phương pháp tiếp cậnnhư ELISA sandwich và ELISA cạnh tranh được cung cấp bởi nhiều công ty sinh họctrên thế giới dùng trong các nghiên cứu sàng lọc Để đánh giá khả năng gắn kết giữaphối tử đích (IL-8) và thụ thể (CXCR1/2) khi có mặt chất ức chế tiềm năng, nghiêncứu sử dụng bộ kit thử nghiệm gắn kết IL-8/CXCR1/2 của hãng RayBioTech đã được

cấp bằng sáng chế (Hình 1.9) Sử dụng cách tiếp cận này, các chất ức chế có thể được

sàng lọc theo kiểu thông lượng cao, thúc đẩy sự phát triển của liệu pháp điều trị liênquan đến IL-8/CXCR1/2

Hình 1.9 Kit thử nghiệm gắn kết IL-8/CXCR1/2 của hãng RayBioTech®

Bộ thử nghiệm gắn kết này sử dụng đĩa 96 giếng được phủ sẵn thụ thểCXCR1/2 và chất thử nghiệm sau đó được thêm vào các giếng với sự có mặt của IL-8.IL-8 không liên kết được loại bỏ bằng cách rửa giải và kháng thể IgG (kháng thể pháthiện kháng IL-8 chuột) được thêm vào, liên kết với phức hợp IL-8/CXCR1/2 Sau khirửa giải, một kháng thể thứ cấp IgG liên hợp với HRP cho vào các giếng với sự có mặtcủa cơ chất TMB HRP phản ứng với dung dịch TMB, tạo ra màu xanh tỷ lệ thuận vớilượng IL-8 liên kết Dừng phản ứng HRP-TMB bằng dung dịch dừng, dẫn đến phảnứng đổi màu từ xanh sang vàng Cường độ của màu vàng sau đó được đo ở bước sóng450 nm.71

Nhìn chung, với ưu điểm độ nhạy cao, khả năng lặp lại tốt, không yêu cầu phứctạp hay thiết bị đắt tiền, phương pháp ELISA đã được áp dụng rộng rãi trong nhiềulĩnh vực khác nhau, trong đó có nghiên cứu xác định chất phân tích là kháng thể,kháng nguyên, protein, peptid, chất phân tử nhỏ hay phức hợp phân tử sinh học (tươngtác protein-protein).62 Dữ liệu có thể được phân tích để ước tính giá trị nồng độ ức chế50% khả năng gắn kết giữa protein - phối tử (IC50) của chất thử nghiệm.72