sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin 8 và thụ thể xcr12

ĐẶT VẤN ĐỀ Interleukin IL-8, thuộc họ chemokin, là yếu tố tiền viêm đóng vai trò then chốt trong việc kích hoạt bạch cầu trung tính và liên quan đến các bệnh lý viêm như bệnh phổi tắc ng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN THỊ THÚY NGA

SÀNG LỌC CÁC PHÂN TỬ NHỎ CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TƯƠNG TÁC INTERLEUKIN-8 VÀ THỤ THỂ CXCR1/2

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh, Năm 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN THỊ THÚY NGA

SÀNG LỌC CÁC PHÂN TỬ NHỎ CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TƯƠNG TÁC INTERLEUKIN-8 VÀ THỤ THỂ CXCR1/2

NGÀNH: DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG

MÃ SỐ: 9720205

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

GS.TS LÊ MINH TRÍ

Thành phố Hồ Chí Minh, Năm 2024

LỜI CÁM ƠN Lời cám ơn trân trọng nhất em xin gửi đến Thầy GS.TS Lê Minh Trí và Thầy GS.TS Thái Khắc Minh đã định hướng và trực tiếp hướng dẫn đề tài Luận án

Tiến sĩ Cám ơn Thầy trong thời gian qua đã quan tâm, thấu hiểu và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em Sự tận tình, kiến thức chuyên môn sâu rộng và những góp ý quý giá của Thầy góp phần rất lớn vào thành công của luận án Được trở thành học trò của Thầy là một điều may mắn vì nhờ Thầy mà em đã có cơ hội học hỏi, trải nghiệm rất nhiều trong nghiên cứu

Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Thầy TS Nguyễn Quốc Thái đã hướng

dẫn tận tình và hỗ trợ quý báu, sự kiên nhẫn, nhiệt tình của Thầy đã giúp em vượt qua những khó khăn, thử thách trong những ngày đầu làm nghiên cứu thực nghiệm Em xin

cám ơn Cô TS Vũ Thanh Thảo đã cho phép và tạo điều kiện cho em được sử dụng hóa chất và trang thiết bị phục vụ nghiên cứu tại phòng lab của trung tâm Sapharcen

Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến các Thầy/Cô PGS.TS Trần Mạnh Hùng, PGS.TS Huỳnh Ngọc Trinh, PGS.TS Đỗ Thị Hồng Tươi, PGS.TS Trương Ngọc Tuyền, PGS.TS Nguyễn Thị Minh Thuận, PGS.TS Nguyễn Thụy Việt Phương, PGS.TS Võ Thị Cẩm Vân, PGS.TS Nguyễn Ngọc Khôi, PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương, PGS.TS Nguyễn Đức Hoàng, TS Mai Huỳnh Như, TS Nguyễn Kim Anh, TS Tưởng Lâm Trường đã nhận lời tham dự Hội đồng đánh giá Luận án Cám ơn

Thầy Cô đã dành thời gian đọc, góp ý và phản biện cho đề tài để Luận án được hoàn

thiện hơn

Xin gửi lời cám ơn đến Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị tốt nhất để em có thể thực hiện đề

tài này Cám ơn Trường Đại học Kỹ thuật Y-Dược Đà Nẵng đã cho phép và tạo điều

kiện cho tôi được theo học và hoàn thành chương trình đào tạo Tiến sĩ

Em xin thể hiện lòng kính trọng và sự tri ân sâu sắc đến các Thầy Cô Bộ môn Dược lý, Bộ môn Dược lâm sàng, Bộ môn Hóa sinh, Bộ môn Vi sinh, Bộ môn Hóa Dược nói riêng và các Thầy cô trong Khoa Dược nói chung vì đã tận tâm giảng dạy và hết lòng truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý giá cho em Em xin cám anh

Tưởng Lâm Trường, chị Phạm Diễm Thu và em Mai Thành Tấn vì đã quan tâm,

giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian làm Luận án Em xin gửi lời cám ơn đến

anh Lê Quang Đạt và chị Đỗ Nguyễn Minh Thảo đã hỗ trợ dung môi hóa chất, dụng cụ cho em và các bạn làm nghiên cứu Em cũng xin cám ơn các Thầy Cô Bộ môn Phân tích - Kiểm nghiệm, Bộ môn Hóa sinh và Bộ môn Vi ký sinh đã cho phép và tạo điều

kiện cho em được sử dụng trang thiết bị phục vụ nghiên cứu tại Bộ môn

Chị cám ơn Phong đã giúp đỡ rất nhiều từ những ngày đầu chị vào lab Hóa sinh Một lời cám ơn rất đặc biệt chị muốn gửi đến Hưng, Vy, Hạ, Thư, Thạch, Huyền và Thi vì đã đồng hành cùng chị trong suốt thời gian trên lab Hóa sinh và Vi sinh Cám

ơn vì đã là động lực để chị lên lab mỗi ngày và cố gắng nhiều hơn Cám ơn vì các em đã luôn sẵn sàng chia sẻ khó khăn với chị, đã quan tâm, kiên nhẫn lắng nghe và động viên chị

Chị cám ơn Minh, Nhân, Phương, Uyên, Ánh và Thủy đã hỗ trợ chị rất nhiều trong giai đoạn chị làm nghiên cứu in silico Chị cám ơn các bạn monitor tại lab Hóa dược đã cùng chị trải qua khoảng thời gian làm nghiên cứu thật đáng nhớ Chị cám thấy rất biết ơn và may mắn vì đã là một thành viên của lab 314, cám ơn tất cả các em!

Tiếp theo, em chân thành cám ơn chị Trần Quế Hương vì đã cùng nhau vượt

qua những vui buồn, thử thách và hạnh phúc trong hơn năm năm nghiên cứu sinh Chị là đồng nghiệp, cũng là bạn đồng hành cùng em trong mỗi chuyến đi xa, mỗi đợt báo cáo bảo vệ Luận án, lắng nghe những lời chia sẻ và giúp em vượt qua được thời gian

khó khăn trong công việc cũng như cuộc sống Bên cạnh đó, cô rất cám ơn em Thanh Trang đã giúp đỡ cô rất nhiều trong giai đoạn nghiên cứu ở lab Hóa Dược và đồng hành

cùng cô tại phòng trọ thân yêu ở Sài Gòn

Cuối cùng, lời cám ơn đặc biệt nhất xin được gửi đến gia đình thân yêu của con Cám ơn gia đình vì đã hỗ trợ không ngừng, động viên và luôn ở đó mỗi khi con cần, đã lắng nghe và cho con lời khuyên mỗi khi con gặp khó khăn Gia đình mãi là điểm tựa tinh thần lớn nhất trong suốt cuộc đời con

Luận án này sẽ không thể hoàn thành nếu không có sự hỗ trợ từ mọi người và các tổ chức liên quan Một lời cám ơn hẳn là không đủ để bày tỏ lòng biết ơn và sự cám kích

của em/con Một lần nữa xin được gửi lời cám ơn chân thành nhất đến tất cả Thầy Cô, gia đình, bạn bè và các bạn sinh viên khoa Dược

TP Hồ Chí Minh, ngày 5 tháng 9 năm 2024

Tác giả

Trần Thị Thúy Nga

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên là Trần Thị Thúy Nga, là Nghiên cứu sinh chuyên ngành Dược lý – Dược lâm sàng, khóa 2019 – 2022, xin cam đoan:

(1) Luận án là do chính bản thân tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn khoa học của GS.TS Lê Minh Trí;

(2) Các tài liệu tham khảo được tôi xem xét, chọn lọc kỹ lưỡng, trích dẫn và liệt kê tài liệu tham khảo đầy đủ;

(3) Kết quả trình bày trong luận án được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của bản thân tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ đề tài cùng cấp nào khác

TP Hồ Chí Minh, ngày 5 tháng 9 năm 2024

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH-VIỆT viiii

1.2 Nghiên cứu sàng lọc in silico 13

1.3 Thử nghiệm đánh giá hoạt tính in vitro 21

1.4 Các nghiên cứu có liên quan đến đề tài 28

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Thiết kế nghiên cứu 34

2.2 Đối tượng nghiên cứu 35

2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 36

2.4 Phương pháp nghiên cứu 36

2.5 Phương pháp phân tích dữ liệu 53

4.3 Thử nghiệm đánh giá hoạt tính in vitro 109

KẾT LUẬN 122KIẾN NGHỊ 124

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUANTÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH-VIỆT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

2D Two dimension Hai chiều 3D Three dimension Ba chiều

ADMET

Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion and Toxicity

Hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính

NEU Bạch cầu trung tính CADD Computer-aided drug design Thiết kế thuốc có sự hỗ trợ của máy

tính CCVKN Chất chuẩn Viện kiểm nghiệm COPD Chronic obstructive pulmonary

disease Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính

Cryo-EM Cryo-electron microscopy Kính hiển vi điện tử đông lạnh CXCR1/2 Chemokine CXC receptor 1/2 Thụ thể chemokin CXCR1/2 DB Drugbank Ngân hàng thuốc

DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid ECL Extracellular loop Vòng ngoại bào EF Enrichment factor Hệ số làm giàu EGFR Epidermal growth factor receptor Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì ELISA Enzyme-linked immunosorbent

GH Goodness of hits Điểm số độ tốt của hit GPCR G protein coupled receptor Thụ thể liên kết với protein G HCPLNB Hợp chất phân lập nội bộ IC50

Half maximal inhibitory concentration Nồng độ ức chế 50% hoạt tính ICL Intracellular loop Vòng nội bào

ITC Isothermal titration calorimetry Phép đo nhiệt lượng chuẩn độ đẳng

nhiệt JNK Jun N-terminal kinase

LBP Ligand-based pharmacophore Pharmacophore dựa trên phối tử LPS Lipopolysaccharide

MAPK Mitogen Activated Protein

Kinase Protein kinase hoạt hóa mitogen MDs Molecular Dynamics Simulation Mô phỏng động lực học phân tử MM/GBSA Molecular mechanics

Generalized Born surface area

Cơ học phân tử tổng quát hóa diện tích bề mặt Born)

MM/PBSA Molecular mechanics Poisson -

Boltzmann surface area

Cơ học phân tử diện tích bề mặt Poisson – Boltzman

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide NADH Nicotinamide adenine

dinucleotide hydrogen Dạng khử của NAD

+

NADPH Nicotinamide adenine

dinucleotide phosphate hydrogen Dạng khử của NADP

+

NCI National Cancer Institute Viện Ung thư quốc gia NET Neutrophil extracellular trap Bẫy ngoại bào bạch cầu trung tính

NEU Neutrophil Bạch cầu trung tính ns Nano second Nano giây

OD Optical Density Mật độ quang PBS Phosphate-Buffered Saline Đệm muối photphat PDB Protein data bank Ngân hàng dữ liệu protein P-gp Glycoprotein

PI3K Phosphoinositide 3-kinase PLIF Protein-ligand interaction

bình phương SBP Structure-based pharmacophore Pharmacophore dựa trên cấu trúc SPR Surface plasmon resonance Cộng hưởng plasmon bề mặt

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các dạng biến thể tự nhiên của IL-8 3

Bảng 1.2 Dữ liệu cấu trúc protein IL-8/CXCR1/2 5

Bảng 1.3 Tương tác giữa các acid amin của IL-8 và CXCR1/2 ở vị trí hoạt động 7

Bảng 1.4 Vai trò của IL8-CXCR1/2 trong một số nhóm bệnh chính 11

Bảng 1.5 Một số thuốc phân tử nhỏ ức chế CXCR1/2 allosteric trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng 12

Bảng 1.6 Một số nghiên cứu in silico với mục tiêu IL-8/CXCR1/2 29

Bảng 1.7 Một số nghiên cứu in vitro đánh giá sự gắn kết 31

Bảng 1.8 Một số nghiên cứu in vitro về tác động của IL-8 trên tế bào ung thư 33

Bảng 2.1 Phần mềm sử dụng trong nghiên cứu 36

Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 37

Bảng 2.3 Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 38

Bảng 2.4 Thành phần hỗn hợp dung dịch trong giếng đo 51

Bảng 3.1 Tóm tắt các mô hình docking phân tử trong nghiên cứu 57

Bảng 3.2 Các thư viện hợp chất được dùng để sàng lọc ảo 58

Bảng 3.3 Kết quả sàng lọc qua các mô hình 3D-pharmacophore tìm chất gắn kết trên IL-8 58

Bảng 3.4 Kết quả sàng lọc qua các mô hình 3D-pharmacophore tìm chất gắn kết trên CXCR1/2 59

Bảng 3.5 Các chất gắn kết trên CXCR2 có điểm số docking ≤ –20 kJ.mol-1 và sự tương tác 65

Bảng 3.6 Kết quả dự đoán độc tính của các chất 72

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá mô hình A 74

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá mô hình B 74

Bảng 3.9 Kết quả “redocking” EBX vào vị trí gắn kết của CXCR2 76

Bảng 3.10 Các chất gắn kết trên CXCR2 với điểm số docking và sự tương tác tốt hơn phối tử đồng kết tinh EBX 77

Bảng 3.11 Giá trị RMSF của các acid amin trong khoang gắn kết khi MDs phức hợp ba phối tử với CXCR2 78Bảng 3.12 Dự đoán ADMET của EBX và hai chất tiềm năng 80Bảng 3.13 Kết quả đánh giá ức chế tương tác IL-8/CXCR2 của các chất thử nghiệm

tại nồng độ 100 μM 82 Bảng 4.1 Một số nghiên cứu sàng lọc SMPPII sử dụng mô hình pharmacophore

dựa trên PPI 90Bảng 4.2 Nghiên cứu gắn kết docking phân tử trên mục tiêu IL-8 93

Bảng 4.3 Kết quả sàng lọc in silico ở nghiên cứu hiện tại và các nghiên cứu đã

công bố 107Bảng 4.4 Các nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế gắn kết 111Bảng 4.5 Các nghiên cứu về sự tăng sinh tế bào ung thư tuyến tiền liệt do IL-8

kích thích 112Bảng 4.6 Các nghiên cứu về sự tăng sinh của một số dòng tế bào ung thư qua

trung gian IL-8 113Bảng 4.7 Hiệu quả ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư tuyến tiền liệt của một số

dẫn xuất benzamid 117Bảng 4.8 Tác dụng chống tăng sinh tế bào ung thư của tectochrysin 119

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc tinh thể IL-8 monomer 4

Hình 1.2 Minh họa cấu trúc CXCR1/2 trong phức IL-8/CXCR1/2/protein G 5

Hình 1.3 Minh họa vị trí tương tác giữa IL-8 với thụ thể CXCR1 (8IC0) và CXCR2 (6LFO) 6

Hình 1.4 Sự tương tác giữa IL-8 và kháng thể LY3041658 8

Hình 1.5 Sự tương tác giữa CXCR2 và chất ức chế EBX 8

Hình 1.6 Con đường dẫn truyền tín hiệu của IL-8/CXCR1/2 9

Hình 1.7 Cơ sở docking bằng công cụ FlexX/ LeadIT 16

Hình 1.8 Minh họa phương pháp đo lường sự gắn kết (A) ITC và (B) SPR 22

Hình 1.9 Kit thử nghiệm gắn kết IL-8/CXCR1/2 của hãng RayBioTech® 25

Hình 1.10 Cấu trúc của MTT và sản phẩm có màu formazan 27

Hình 2.1 Tóm tắt sơ đồ nghiên cứu sàng lọc dựa trên cấu trúc 34

Hình 2.2 Minh họa giao diện PLIF trong phần mềm MOE 2015.10 40

Hình 2.3 Cấu trúc các chất ức chế CXCR2 vị trí allosteric 41

Hình 2.4 Tóm tắt các bước tiến hành mô phỏng động lực học phân tử 45

Hình 2.5 Tóm tắt các bước tiến hành thử nghiệm ức chế tương tác 49

Hình 2.6 Tóm tắt thử nghiệm đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư do IL-8 cám ứng 52

Hình 3.1 Mô hình PhIL8-CXCR1 (A) và PhCXCR1-IL8 (B) 54

Hình 3.2 Mô hình PhIL8-CXCR2 (A) và PhCXCR2-IL-8 (B) 55

Hình 3.3 Mô hình PhIL8-LY3041658-S1 (A) và PhIL8-LY3041658-S2 (B) 56

Hình 3.4 Mô hình docking phân tử (vùng màu xanh): (A) D-IL8-CXCR1/2 và (B) D-IL8-LY3041658 57

Hình 3.5 Mô hình docking phân tử (vùng màu xanh): (A) D-CXCR1-IL8 và (B) D-CXCR2-IL8 57

Hình 3.6 Tỷ lệ chất dock thành công qua các mô hình gắn kết docking phân tử 59

Hình 3.7 Sự phân bố chất dock thành công theo khoảng điểm số docking 60

Hình 3.8 Sự tương tác của 4 chất tiềm năng trên khoang D-IL8-CXCR1 61

Hình 3.9 Sự tương tác của 11 chất tiềm năng trên khoang D-IL8-CXCR2 61

Hình 3.10 Sự tương tác của 4 chất tiềm năng trên khoang D-IL8-LY3041658 62

Hình 3.11 Phân tích PLIF các chất trong khoang gắn kết của IL−8 với CXCR1 (A), CXCR2 (B) và kháng thể LY3041658 (C) 62

Hình 3.12 Phân tích PLIF các chất trong khoang gắn kết của CXCR1/2 63

Hình 3.13 Sự tương tác của 19 chất tiềm năng trên khoang D-CXCR1-IL8 64

Hình 3.14 RMSD của 19 phức hợp tiềm năng 67

Hình 3.15 RMSF của protein tự do/phức hợp của các chất tiềm năng 68

Hình 3.16 Tỷ lệ liên kết hydro của các chất thuộc ngân hàng thuốc (DB) với acid amin của CXCR2 trong quá trình MDs 100ns 69

Hình 3.17 Tỷ lệ liên kết hydro của các chất thuộc thư viện ZINC (A), HCPLNB (B) và CCVKN (C) với acid amin của CXCR2 trong quá trình MDs 100ns 70

Hình 3.18 Năng lượng gắn kết tự do của 19 chất trong phức hợp với CXCR2 71

Hình 3.19 Biểu đồ “BOILED-Egg” của các chất phân tích 72

Hình 3.20 Mô hình A 73

Hình 3.21 Mô hình PhCXCR2-EBX và sự gióng hàng lên CXCR2 75

Hình 3.22 Mô hình gắn kết docking phân tử D-CXCR2-EBX (A) và 10 cấu dạng redocking của EBX trong khoang gắn CXCR2 (B) 75

Hình 3.23 Kết quả gắn kết docking phân tử qua mô hình D-CXCR2-EBX 76

Hình 3.24 Kết quả MDs của phức CXCR2/ZINC77105530 78

Hình 3.25 Kết quả MDs của phức CXCR2/ZINC93176465 79

Hình 3.26 Năng lượng gắn kết tự do của phức hợp CXCR2 và ZINC77105530, ZINC93176465, EBX 79

Hình 3.27 Tóm tắt kết quả nghiên cứu sàng lọc in silico 81

Hình 3.28 Hiệu quả ức chế tương tác IL-8/CXCR2 của ba chất tiềm năng theo nồng độ 83

Hình 3.29 Sự tăng sinh các dòng tế bào ung thư được cám ứng bởi IL-8 84

Hình 3.30 Tác động của IL-8 100 ng/mLvà/hoặc các chất thử nghiệm tại nồng độ 100 µM lên sự sống sót tế bào LNCaP 85

Hình 3.31 Tỷ lệ tế bào sống do tác động IL-8 và 6 chất thử nghiệm theo nồng độ 86Hình 3.32 Tỷ lệ tế bào sống do tác động của 6 chất thử nghiệm theo nồng độ 87 Hình 4.1 RMSD của các phức hợp CXCR2 với DB07754, ZINC1251190, acid usnic

và cefixim 97Hình 4.2 Minh họa vị trí các phối tử trong khoang gắn kết CXCR2 ở thời điểm 0 ns

(xanh lá), 50 ns (cam) và 100 ns (xanh dương) (A) DB07754, (B) ZINC1251190, (C) acid usnic và (D) cefixim 97Hình 4.3 Các nhóm cấu trúc của 6 hợp chất tiềm năng tham gia tương tác với acid

amin quan trọng của CXCR2 trong quá trình MDs 100Hình 4.4 Sự tương tác của bốn phối tử đại diện cho 4 thư viện chất tại khoang gắn kết CXCR2 trong quá trình gắn kết docking phân tử (A) và MDs 100 ns (B) 101Hình 4.5 Nhóm cấu trúc có khả năng gây độc tính (in đậm) của ZINC0220077 và

DB15327 104Hình 4.6 (A) Tương tác giữa CXCR2 và EBX1 (B) Sự gióng hàng EBX1 (xanh lá),

ZINC77105530 (cam) và ZINC93176465 (xanh dương) lên mô hình pharmacophore PhCXCR2-EBX 106Hình 4.7 Cấu trúc 2D của ZINC77105530 (A1), ZINC93176465 (A2) và sự hình

thành tương tác của hai phối tử trong docking phân tử (B1,B2) và MDs (C1,C2) 108Hình 4.8 Năng lượng gắn kết mỗi acid amin của CXCR2 với hai chất tiềm năng 109Hình 4.9 Minh họa vị trí của ba chất tiềm năng và ELR motif của IL-8 trong khoang

CXCR2 từ kết quả docking phân tử 110

ĐẶT VẤN ĐỀ

Interleukin (IL)-8, thuộc họ chemokin, là yếu tố tiền viêm đóng vai trò then chốt trong việc kích hoạt bạch cầu trung tính và liên quan đến các bệnh lý viêm như bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD), hen phế quản, vẩy nến hoặc viêm khớp dạng thấp.1Nhiều bằng chứng cũng cho thấy IL-8 thúc đẩy sự hình thành mạch, tăng sinh, di chuyển, xâm lấn và di căn của tế bào ung thư phổi, vú, ruột kết, bàng quang, tuyến tiền liệt, gan, tử cung hay một dòng tế bào khối u khác.2,3 Vai trò IL-8 được thể hiện qua sự gắn kết với hai thụ thể kết hợp protein G (GPCR), là CXCR1 và CXCR2, tại vị trí hoạt động

(orthosteric) ở ngoại bào Bên cạnh đó, một vùng gắn kết dị lập thể nội bào (allosteric)

cũng đã được phát hiện trong cấu trúc thực nghiệm của các phức hợp phối tử và GPCR.1,4-6 Các chất tác động ở vị trí allosteric nội bào có thể điều chỉnh chức năng của

thụ thể dẫn đến ảnh hưởng tới sự liên kết của phối tử nội sinh (IL-8) và GPCR (CXCR1/2).5 Do đó, tìm kiếm các chất gắn kết vào vị trí orthosteric hoặc allosteric,

ngăn chặn tương tác IL-8/CXCR1/2, có thể là các chiến lược phát triển thuốc hiệu quả để phát hiện liệu pháp mới trong điều trị các bệnh lý kể trên

Trong hai thập kỷ qua, một số kháng thể đơn dòng (ABX-IL8, HuMax IL-8), thuốc có nguồn gốc peptid (CXCL8 K11R G31P), acid nuleic (miR-155, miR-708) với đích tác động là IL-8/CXCR1/2 đã được nghiên cứu.5,7 Những liệu pháp sinh học này cho thấy điểm yếu không thể tránh khỏi như nguy cơ nhiễm khuẩn, chi phí cao và yêu cầu tiêm tĩnh mạch.8 Ngược lại, chất ức chế phân tử nhỏ với ưu điểm rẻ hơn và có thể được dùng bằng đường uống, các chất đối kháng phân tử nhỏ thụ thể CXCR1/2 (AZD5069, danirixin, elubrixin, navarixin, SX-682 hay reparixin) đã được khám phá và thử nghiệm lâm sàng.3-5,7,9 Tuy nhiên, những chất này đều tác động trên thụ thể tại vị trí

allosteric và chưa có thuốc nào được phê duyệt điều trị hoặc một số thuốc đã thất bại

trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng vì hiệu quả thấp (elubrixin hay danirixin trên bệnh nhân COPD, viêm ruột hay xơ nang) hoặc đặc tính dược động học kém (SX-56).5,10 Các

nghiên cứu với cách tiếp cận dựa trên phối tử tại vị trí allosteric của nhóm tác giả

Madea,11 Ha,12 Thái Khắc Minh13 hoặc Lê Minh Trí và cộng sự14 đã sử dụng mô hình tương đồng CXCR2 và thực hiện docking phân tử bằng cách dự đoán khoang gắn kết

trên thụ thể hay nghiên cứu in silico của nhóm tác giả Boraek15 tiến hành docking mù trên toàn bộ IL-8 Theo đó, kết quả thu được ở những nghiên cứu trên cho thấy các ứng viên tiềm năng có cách thức tương tác khác nhau với CXCR211,12 hoặc tiềm năng gắn kết yếu trên IL-8.15 Hơn nữa, cho đến nay chưa có phân tử nhỏ ức chế IL-8/CXCR1/2

tại vị trí orthosteric được nghiên cứu và công bố với lý do chính đến từ việc thiếu cấu

trúc thực nghiệm và thông tin tương tác trong phức hợp IL-8 và thụ thể tại vị trí này.4,6

Hiện nay, thiết kế thuốc có sự hỗ trợ của máy tính (CADD) hay còn gọi phương

pháp in silico là công cụ hỗ trợ đắc lực, góp phần đẩy nhanh quá trình phát triển thuốc

một cách hiệu quả hơn về chi phí cũng như giảm thiểu thất bại trong các giai đoạn thử nghiệm cuối.16 Trong CADD, thông tin cấu trúc protein là yếu tố cần thiết, đồng thời tỷ lệ sàng lọc các chất tiềm năng cao với ái lực gắn kết tốt đạt được khi xác định vị trí tương tác protein-protein (PPI).4 Đáng chú ý, các cấu trúc phức hợp của IL-8 và CXCR1/2 được công bố (2020-2023) bằng các phương pháp hiện đại như tinh thể học tia X (X-ray) hoặc kính hiển vi điện tử đông lạnh (cryo-EM)6,17,18, là những cấu trúc có độ chính xác cao hơn so với mô hình tương đồng sử dụng trong nhiều nghiên cứu trước.11-14 Đồng thời, với các cấu trúc mới này, PPI tại những acid amin quan trọng

(hot-spot/key residue) được xác định thông qua nghiên cứu thực nghiệm đột biến

điểm.6,17,18 Đây là cơ sở cho nghiên cứu in silico dựa trên cấu trúc để sàng lọc các phân tử nhỏ tiềm năng ức chế IL-8/CXCR1/2 trước khi đưa vào thử nghiệm in vitro Do vậy,

đề tài “Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2” được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu:

1 Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác IL-8/CXCR1/2 tại vị trí hoạt động (orthosteric)

2 Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác IL-8/CXCR2 tại vị trí dị lập thể (allosteric)

3 Đánh giá khả năng ức chế tương tác IL-8/CXCR2 và ức chế tăng sinh tế bào ung thư

qua trung gian IL-8 của các chất tiềm năng bằng thử nghiệm in vitro

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Interleukin-8

Năm 1987-1988, một yếu tố hóa ứng động bạch cầu đặc biệt đã được tinh chế từ môi trường bạch cầu đơn nhân khi kích thích bằng lipopolysacarid (LPS) và sau đó được gọi là CXCL8 hay interleukin (IL)-8.3,5,6,9 IL-8 thuộc nhóm chemokin, là một họ cytokin lớn có cấu trúc polypeptid 6 – 14 kDa, được biết đến với vai trò quan trọng trong bệnh lý ung thư và điều hòa sự ổn định của các tế bào miễn dịch IL-8 ít hoặc hầu như không biểu hiện trong điều kiện sinh lý bình thường hoặc bởi các tế bào không ung thư (non-cancerous cells).19,20 Tuy nhiên, IL-8 có thể được giải phóng từ bạch cầu và các loại tế bào khác để đáp ứng với nhiều kích thích hay tín hiệu khác nhau Đó là các kích thích gây viêm nội sinh hoặc ngoại sinh (LPS, IL-1, TNF-α hay vi khuẩn, virus), tín hiệu stress do môi trường, hóa chất, hoặc tín hiệu do hormon gây ra (như estrogen và androgen).3,20Bên cạnh đó, nhiều tế bào khối u bao gồm vú, cổ tử cung, phổi, đại tràng, dạ dày, tuyến tiền liệt hay buồng trứng, đã được chứng minh có biểu hiện rõ rệt chemokin này.9,20

1.1.1 Cấu trúc của interleukin-8 và thụ thể 1.1.1.1 Cấu trúc của interleukin-8

IL-8 lần đầu tiên được tổng hợp dưới dạng protein ban đầu có 99 acid amin và sau khi cắt chuỗi tín hiệu (peptid signal) 22 acid amin tạo ra dạng trưởng thành, thường được kí hiệu là IL-8(1-77) Quá trình xử lý ngoại bào bằng cách cắt đầu N thu được

nhiều biến thể (Bảng 1.1), trong đó biến thể IL-8(6-77) là dạng phổ biến nhất với

72 acid amin và trọng lượng phân tử 8,383 kDa.21,22 Việc loại bỏ 5-8 acid amin làm tăng đáng kể hoạt tính của IL-8, có thể gấp 30 lần so với IL-8(1-77).3

Bảng 1.1 Các dạng biến thể tự nhiên của IL-8 Các dạng tự nhiên của IL-8 Hoạt tính sinh học so sánh với IL-8 (1-77)

IL-8 (2-77) Xấp xỉ IL-8 (3-77) Xấp xỉ IL-8 (6-77) Mạnh hơn IL-8 (7-77) Mạnh hơn IL-8 (8-77) Mạnh hơn IL-8 (9-77) Mạnh hơn

IL-8 có thể tồn tại thuận nghịch dưới dạng monomer hoặc dimer Cấu trúc

monomer của IL-8 như mô tả ở Hình 1.1 (minh họa từ mã PDB 4XDX, độ phân giải 0,95 Å) với một chuỗi ngắn, hình dạng linh động ở đầu N, ba sợi β đối song song

(β1,2,3-strands) nối với nhau bởi các vòng 30s, 40s, 50s và một chuỗi xoắn α (α-helix) kéo dài từ phân tử acid amin thứ 57 đến đầu C Cấu trúc ổn định bởi cầu nối disulfid được hình thành bởi Cys7-Cys34 và Cys9-Cys50 Hai acid amin cystein (Cys7 và Cys9) được phân tách bằng Gln8.9,21-23 Trình tự ba acid amin là Glu4-Leu5-Arg6 (mô típ ELR) được chứng minh có vai trò rất quan trọng trong việc tương tác với các thụ thể.3

Hình 1.1 Cấu trúc tinh thể IL-8 monomer 1.1.1.2 Cấu trúc thụ thể của interleukin-8

CXCR1 và CXCR2 là thụ thể của IL-8, thuộc họ thụ thể liên kết với protein G (GPCR), chứa bảy vòng xoắn alpha, mỗi vòng kéo dài theo độ dày lớp phospholipid kép

của màng tế bào như minh họa ở Hình 1.2 với mã PDB 8IC0 (IL-8/CXCR1)18 và 6LFO (IL-8/CXCR2).6 CXCR1 và CXCR2 là các protein gồm lần lượt 350 và 360 acid amin, cấu trúc giống nhau 76% và hiệu lực liên kết với IL-8 cũng tương tự nhau (Kd ≈ 4 nM) Điểm khác biệt lớn giữa hai thụ thể này là ở vòng ngoại bào thứ 2 và CXCR2 có thể tương tác với các ELR chemokin khác (CXCL1-3, CXCL5-7) với ái lực cao hơn CXCR1 Cấu trúc của các thụ thể CXCR1/2 gồm bảy miền xuyên màng (TMD), ba vòng ngoại bào (ECL1-3) và ba vòng nội bào (ICL1-3) Đầu N gồm miền xuyên màng 4

(TMD4) và vòng 2 ngoại bào (ECL2) của CXCR1/2 đóng vai trò rất quan trọng khi liên kết với phối tử và thể hiện hoạt tính đặc hiệu.3,6,9,24

Hình 1.2 Minh họa cấu trúc CXCR1/2 trong phức IL-8/CXCR1/2/protein G

Việc xác định cấu trúc của protein với độ phân giải cao là rất cần thiết trong quá trình thiết kế thuốc.25 Các cấu trúc protein của IL-8 hoặc CXCR1/2 được phát hiện bằng các phương pháp hiện đại như tinh thể học tia X (X-ray) hoặc kính hiển vi điện tử đông

lạnh (Cryo-EM) tính tới thời điểm hiện nay được liệt kê như Bảng 1.2

Bảng 1.2 Dữ liệu cấu trúc protein IL-8/CXCR1/2 Cấu trúc

protein

Mã PDB Phương

pháp xác định

Độ phân

giải

Chuỗi Nghiên cứu

IL-8 1ICW X-ray 2,01 Å A/B Eigenbrot (1997)

1QE6 X-ray 2,35 Å A/B/C/D Gerber (2000)

3IL8 X-ray 2,00 Å A Baldwin (1992) 4XDX X-ray 0,95 Å A Ostrov (2015)

5D14 X-ray 2,00 Å A Ostrov (2015) 6N2U X-ray 1,25 Å A Park (2019)

IL-8/CXCR1/ protein G

8IC0 Cryo-EM 3,41 Å IL-8: F

CXCR1: A

Ishimoto (2023)

IL-8/CXCR2/ protein G

6LFO Cryo-EM 3,40 Å IL-8: D

CXCR2: E

Liu (2020) IL-8/

LY3041658

6WZM X-ray 2,28 Å IL-8: E/F

LY3041685: A/B/C/D

Boyles (2020)

CXCR2/EBX 6LFL X-ray 3,20 Å CXCR2: A

EBX: B

Liu (2020)

1.1.2 Sự tương tác IL-8/CXCR1/2

IL-8 thể hiện tác dụng thông qua gắn kết cùng hai thụ thể liên kết với protein G, CXCR1 và CXCR2, được đồng biểu hiện rộng rãi trong các tế bào như bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân, tế bào lympho Các nghiên cứu trước đây đã đề xuất một cơ

chế tương tác giữa IL-8 với CXCR1/2 tại vị trí hoạt động như Hình 1.3 (minh họa từ

cấu trúc phức hợp với mã ngân hàng dữ liệu protein (PDB) lần lượt là 8IC018 và 6LFO6) - Vị trí 1: Vòng N (N-loop) của IL-8 và đầu N của thụ thể

- Vị trí 2: Đầu N của IL-8 và các acid amin ở vòng ngoại bào của thụ thể Hơn nữa, trong khi vị trí 1 chịu trách nhiệm huy động IL-8 ban đầu, thì các tương tác ở vị trí 2 được cho là đóng vai trò quan trọng trong việc kích hoạt CXCR1/2.3,9,17,26

Hình 1.3 Minh họa vị trí tương tác giữa IL-8 với thụ thể CXCR1 (8IC0) và

CXCR2 (6LFO)

Thông tin tương tác tại vị trí 2 đã được xác định rõ trong công bố của các nhóm tác giả Ishimoto (IL-8/CXCR1)18 và Liu (IL-8/CXCR2).6 Đặc biệt, các nghiên cứu trên cũng ghi nhận những acid amin quan trọng tham gia gắn kết tại vị trí này thông qua thử

nghiệm đột biến điểm (Bảng 1.3)

Bảng 1.3 Tương tác giữa các acid amin IL-8 và CXCR1/2 ở vị trí hoạt động6,18

Lys3 (Cho) Liên kết hydro (nhận)

CXCR1 (Mã PDB 8IC0)

Glu291 Glu4* (Nhận) Liên kết hydro (cho) Arg203* Glu4* (Nhận) Liên kết hydro (cho) Arg269

Arg6* (+) Liên kết cầu muối (–) Asp265* Glu4* (–) Liên kết cầu muối (+)

CXCR2 (Mã PDB 6LFO)

Arg208*/Arg212*/ Arg278* Glu4* (Nhận) Liên kết hydro (cho) Tyr197* Leu5* Kỵ nước Val187/Val192 Leu5* (Cho) Liên kết hydro (nhận) Tyr197* Arg6* (Cho) Liên kết hydro (nhận) Thr285 Gly31 (Cho) Liên kết hydro (nhận) Thr204 Pro32 (Cho) Liên kết hydro (nhận) Thr204 Ghi chú: *Các acid amin quan trọng cho sự gắn kết giữa chemokin và thụ thể, PDB (protein data bank): ngân hàng dữ liệu protein

Cụ thể, Glu4, Leu5 và Arg6 thuộc mô típ ELR khi được thay thế bằng Ala cho thấy sự giảm ái lực gắn kết với thụ thể lần lượt khoảng 100, 100 và 1000 lần.27Ishimoto và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm và cho kết luận với các đột biến trên một số acid amin của CXCR1, như Tyr188, Arg203 và Asp265 thành Ala dẫn đến giảm khả năng gắn kết của thụ thể lên IL-8 so với CXCR1 tự nhiên.18 Tương tự, nhóm tác giả Liu cũng xác nhận các đột biến tại Tyr197, Arg208, Arg212 và Arg278 trên CXCR2 gây giảm sự gắn kết của với IL-8 cũng như hoạt tính của thụ thể.6

Bên cạnh đó, cấu trúc IL-8 và kháng thể LY3041658 (6WZM) hay phức hợp

thụ thể CXCR2 và chất ức chế allosteric EBX (6LFL) cũng như sự tương tác lần lượt

được mô tả ở Hình 1.4 và Hình 1.5.6,17

Hình 1.4 Sự tương tác giữa IL-8 và kháng thể LY3041658

(a) Cấu trúc tia X của phức hợp IL-8/LY3041658 (Mã PDB 6WZM) và các vị trí liên kết (b) và (c) các acid amin quan trọng trên bề mặt liên kết của IL-8 (cam) và kháng thể LY3041658: chuỗi nặng (xám) và chuỗi nhẹ (hồng)

Hình 1.5 Sự tương tác giữa CXCR2 và chất ức chế EBX

(A) Cấu trúc X-ray của phức CXCR2/EBX (6LFL), (B) Một số acid amin ở vị trí liên kết của thụ thể CXCR2 (đỏ) và EBX (xám)

1.1.3 Quá trình dẫn truyền tín hiệu IL-8/CXCR1/2

Đường dẫn truyền tín hiệu qua trung gian protein G bắt đầu bằng sự gắn kết của IL-8 với thụ thể của nó dẫn đến sự phân ly của tiểu đơn vị Gβγ và Gα từ G proteinα βγ, Gα

liên kết với vòng nội bào 2, 3 và đầu C của thụ thể (Hình 1.6).3

Hình 1.6 Con đường dẫn truyền tín hiệu của IL-8/CXCR1/2

“Nguồn: Cambier, 2023”3

Đối với tín hiệu qua trung gian CXCR1/2, Gα chủ yếu thuộc loại Gα ức chế (Gαi) Gαi ức chế chức năng của adenylyl cyclase làm giảm adenosin monophosphat vòng (cAMP) Còn tiểu đơn vị Gβγ kích hoạt phospholipase C (PLC) β2 chuyển đổi phosphatidylinositol (4,5)-biphosphat (PIP2) thành inositol 1,4,5-trisphotphat (IP3) và diacylglycerol (DAG) Kết quả gây ra sự giải phóng Ca2+ từ lưới nội chất vào bào tương và kích hoạt các protein kinase nhạy cám với Ca2+ như protein kinase C (PKC) Đồng thời, sự kích hoạt con đường tín hiệu PKC phụ thuộc phospholipase C cũng đặc trưng cho các tế bào ung thư sau khi được kích thích bằng IL-8 Hơn nữa, phosphoinositid 3-kinase (PI3K) sẽ được kích hoạt bởi tiểu đơn vị Gβγ, chuyển PIP2 thành phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphat (PIP3) dẫn đến kích hoạt GTPase Rac, phosphokinase B (PKB hoặc Akt) và kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào (ERK1/2)

ERK1/2 cũng có thể được kích hoạt bằng con đường tín hiệu cổ điển ERK mà việc kích hoạt có thể phụ thuộc vào hoạt động PI3K.9,24,26

Ras-Raf-MEK-Kết quả của các quá trình truyền tín hiệu qua trung gian protein G trên tạo ra các chức năng bạch cầu trung tính (NEU) như polymer hóa actin (cần thiết cho sự di chuyển của NEU), tái điều chỉnh và kích hoạt sự kết dính phân tử, hóa ứng động, thực bào, và hình thành bẫy ngoại bào bạch cầu trung tính (NET) Ngoài ra, trục tín hiệu IL-8/CXCR1/2 còn liên quan đến sự tăng sinh, di chuyển và xâm lấn của các tế bào ung thư thông qua kích hoạt các tầng tín hiệu xuôi dòng như PIP3/Akt, Ras-Raf-MEK-ERK hay JAK/STAT3.2,3

1.1.4 Vai trò của IL-8/CXCR1/2 trong các bệnh lý 1.1.4.1 IL-8 và các bệnh lý viêm

Viêm là phản ứng phức tạp của cơ thể tại mô liên kết nhằm loại trừ tác nhân gây viêm và sửa chữa tổn thương Cho dù là một cơ chế bảo vệ cơ thể chống lại các yếu tố gây bệnh, viêm cũng là phản ứng bệnh lý Sự gia tăng các chất trung gian gây viêm như IL-8 dẫn đến trầm trọng phản ứng viêm gây đau, tổn thương mô lành và rối loạn chức năng cơ quan Đồng thời, tương tác giữa IL-8 và thụ thể CXCR1/2 đã được chứng minh có liên quan đến một số bệnh lý viêm phổ biến như viêm phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD), hen phế quản, xơ nang, bệnh viêm ruột.2,3,9,19,28

1.1.4.2 IL-8 và bệnh lý ung thư

Hiện nay, nhiều nghiên cứu chỉ ra mối liên hệ mật thiết giữa IL-8 và sự phát triển, di căn của khối u ác tính Các tế bào khối u thường biểu hiện quá mức IL-8, qua đó tăng cường các tín hiệu dẫn truyền tác động đến tế bào ung thư, tế bào nội mô và đại thực bào thông qua hai thụ thể CXCR1/2 Nhờ vào các con đường tín hiệu tự kích hoạt, IL-8 thúc đẩy sự tăng sinh của chính các tế bào ung thư tiết ra chemokin này Thêm vào đó, tế bào nội mô mao mạch khối u cũng được hoạt hóa dẫn đến tăng cường sự hình thành mạch máu mới và thu hút bạch cầu trung tính tập trung tại vị trí khối u Song song với việc đẩy mạnh sự xâm lấn, di căn đến các mô hoặc cơ quan lân cận của tế bào ung thư, IL-8 còn cám ứng đại thực bào tiết các yếu tố tăng trưởng dẫn đến sự tăng sinh tế bào tại vị trí khối u.3,9,21,22,24,26,28,29

1.1.4.3 IL-8 và bệnh lý khác

Ngoài nồng độ IL-8 tăng cao được tìm thấy trong mô viêm và tuần hoàn máu trong một số bệnh lý viêm và ung thư, IL-8/CXCR1/2 còn tham gia vào cơ chế bệnh

sinh của các bệnh tim mạch, thần kinh, tự miễn, thận và bệnh nhiễm trùng Bảng 1.4

mô tả tóm tắt vai trò của IL-8/CXCR1/2 trong một số nhóm bệnh chính.1-3,9

Bảng 1.4 Vai trò của IL8-CXCR1/2 trong một số nhóm bệnh chính1-3,9

Nhóm bệnh Vai trò của IL8-CXCR1/2

Bệnh viêm khớp Huy động và kích hoạt NEU, thúc đẩy sự hình thành mạch và duy trì

sự ổn định kiểu hình sụn trong viêm xương khớp mạn tính Tổn thương phổi

cấp/ Hội chứng suy hô hấp cấp

Huy động NEU dẫn đến tổn thương phổi liên quan đến tế bào này Các phức hợp miễn dịch của các tự kháng thể chống IL-8 ngăn chặn quá trình chết theo chương trình của bạch cầu trung tính tự phát Hen phế quản Huy động NEU, gây co thắt phế quản bằng cách kích thích các tế bào

cơ trơn đường thở biểu hiện CXCR1/2 Viêm phổi tắc

Ung thư Thúc đẩy sự sống sót, tăng sinh và di chuyển của tế bào khối u

Kích thích hình thành mạch máu mới trong tế bào khối u Thúc đẩy sự xâm lấn và di căn

Huy động bạch cầu trung tính liên quan đến khối u Kích thích giải phóng NET

Huy động đại thực bào liên quan đến khối u và miễn dịch Bệnh vẩy nến Kích thích sự tự tiết của các tế bào sừng biểu hiện CXCR2 gây tổn

thương da, huy động NEU, kích thích tạo mạch Bệnh viêm ruột Huy động và kích hoạt NEU, đại thực bào, gây viêm Tăng huyết áp

động mạch

Thúc đẩy tăng huyết áp và rối loạn chức năng mạch máu bằng cách huy động tế bào tiền viêm CCR2+

Xơ vữa động mạch

Tạo sự kết dính và hóa ứng động các tế bào biểu hiện CXCR2 và NEU, dẫn đến hình thành mảng xơ vữa

Bệnh thận Huy động NEU và gây tổn thương thận COVID-19 Tăng hoạt hóa NEU trong máu, phổi với phân giải protein

Hình thành NET

1.1.5 Các liệu pháp điều trị với mục tiêu IL-8/CXCR1/2

IL-8 và thụ thể CXCR1/2 đã được chứng minh là mục tiêu điều trị đầy hứa hẹn trong nhiều bệnh lý Theo đó, hầu hết nghiên cứu lâm sàng tập trung vào việc ức chế tương tác giữa chemokin và thụ thể bằng cách sử dụng các thuốc cấu trúc phân tử nhỏ, kháng thể đơn dòng hoặc thuốc peptid có nguồn gốc từ IL-8 hoặc CXCR1/2 Trong số

các nhóm kể trên, các chất phân tử nhỏ đối kháng CXCR1/2 ở vị trí allosteric nội bào

rất được quan tâm.2,3,5,9,23 Một số thuốc đang nghiên cứu ở giai đoạn thử nghiệm lâm

sàng được liệt kê ở Bảng 1.5

Bảng 1.5 Một số thuốc phân tử nhỏ ức chế CXCR1/2 allosteric trong giai đoạn

thử nghiệm lâm sàng Tên thuốc

(công ty)

Chỉ định Thử nghiệm lâm sàng mới nhất

Reparixin*/ Repertaxin* (Dompé)

Ghép tụy NCT01967888 (Pha 2/3: hoàn thành) Rối loạn chức năng mô ghép

sau ghép thận, gan, phổi

NCT00248040, NCT03031470, NCT00224406 (Pha 2: hoàn thành) Ung thư vú NCT05212701 (Pha 2: đang thực hiện) COVID-19 NCT05254990 (Pha 3: đang thực hiện) Ladarixin*

(Merck)

Bệnh vảy nến NCT00684593 (Pha 2: hoàn thành) Khối u rắn tiến triển/ di căn NCT03473925 (Pha 2: hoàn thành) Hen phế quản NCT00688467 (Pha 2: hoàn thành) Elubrixin**

(AstraZeneca)

Hen NCT01704495 (Pha 2: hoàn thành) COPD NCT01233232 (Pha 2: hoàn thành) Ung thư tuyến tiền liệt di căn NCT03177187 (Pha 2: đang thực hiện) Khối u rắn tiến triển và ung

thư đầu cổ NCT02499328 (Pha 2: đang thực hiện) AZD4721**

(AstraZeneca)

Mụn mủ lòng bàn tay NCT05194839 (Pha 2: đang thực hiện) Viêm tuyến mồ hôi NCT05348681 (Pha 2: đang thực hiện)

Tuy nhiên, tại vị trí orthosteric cho đến nay vẫn chưa có phân tử nhỏ ức chế

IL-8/CXCR1/2 được công bố, bởi sự tương tác giữa IL-8 và thụ thể chưa được xác định

cụ thể Các nghiên cứu in silico trước đây chỉ ghi nhận thông tin gắn kết gồm vòng N

của IL-8 (acid amin 1-20) tiếp cận với đầu N của thụ thể (acid amin 1-35) và đầu N của IL-8 (mô típ ELR) với các acid amin ở vòng ngoại bào của thụ thể (ECL1-3).3,9,17,26 Bề mặt tương tác protein-protein (PPI) lớn không phải là mục tiêu lý tưởng của sự khám phá và phát triển thuốc phân tử nhỏ.30 Do đó, một số nghiên cứu thực hiện theo hướng thiết kế và tổng hợp thuốc cấu trúc sinh học có nguồn gốc từ IL-8 hoặc CXCR1/2 tham gia tại các vùng gắn kết trên để ngăn chặn tương tác giữa chemokin và thụ thể.7,31,32 Khi bề mặt tương tác giữa IL-8 và thụ thể CXCR1/2 cùng với các acid amin quan trọng tại vùng này được xác định rõ sẽ là một chiến lược tiềm năng trong thiết kế thuốc phân tử nhỏ ức chế PPI

1.2 Nghiên cứu sàng lọc in silico

Thiết kế thuốc có sự hỗ trợ của máy tính (computer-aided drug design, CADD) đã được áp dụng rộng rãi trong giai đoạn đầu của quá trình khám phá thuốc và góp phần đẩy nhanh quá trình phát triển thuốc một cách hiệu quả hơn về chi phí cũng như giảm thiểu thất bại trong các giai đoạn thử nghiệm cuối.16 Nhìn chung, CADD có thể được phân loại thành thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc, thiết kế thuốc trên phối tử và thiết kế

thuốc de novo Dưới đây là phần mô tả cụ thể một số phương pháp chính thường được

sử dụng trong thiết kế thuốc

1.2.1 Mô hình pharmacophore 1.2.1.1 Khái niệm

Pharmacophore là tập hợp tất cả các đặc tính không gian và điện tử cần thiết để đảm bảo cho sự tương tác tối ưu của phân tử xác định với mục tiêu là cấu trúc sinh học chuyên biệt để hoạt hóa (hay ức chế) đáp ứng sinh học của mục tiêu này Pharmacophore không đại diện cho một phân tử hoặc nhóm chức cụ thể nào, khái niệm này đơn thuần mô tả khả năng tương tác phân tử chung của một nhóm hoạt chất đối với cấu trúc mục tiêu Pharmacophore được xem như mẫu số chung lớn nhất của tập hợp các phân tử có hoạt tính Mô hình pharmacophore được xác định bằng các yếu tố có khả năng tạo liên

kết hydro cho/nhận, liên kết tĩnh điện âm/dương, liên kết kỵ nước hay vòng thơm và thể hiện bởi các nguyên tử, các vòng và các điểm giả định (virtual points).33

Một mô hình pharmacophore có thể được tạo ra theo hai cách, đó là mô hình dựa trên phối tử (LBP), trong đó một tập hợp các phân tử có hoạt tính được xếp chồng lên nhau và các đặc tính hóa học cần thiết cho hoạt tính sinh học của chúng được phát hiện Trong khi mô hình dựa trên cấu trúc (SBP) được thực hiện bằng cách thăm dò các điểm tương tác protein và protein (PPI) hay tương tác protein và phối tử Thời gian gần đây, số lượng cấu trúc 3D protein với độ phân giải cao được công bố ngày càng nhiều nên SBP cũng được quan tâm hơn.34

1.2.1.2 Mô hình pharmacophore dựa trên cấu trúc

Cách tiếp cận dựa trên cấu trúc có tên gọi như vậy vì thực tế cấu trúc 3D của protein là điều kiện tiên quyết để xây dựng mô hình SBP Mô hình SBP có thể được phân loại thành hai phân nhóm, đó là dựa trên cấu trúc phức hợp protein-phối tử (dạng

holo) và chỉ dựa trên protein (không có phối tử, dạng apo).33,34 Với sự sẵn có của phức hợp protein - phối tử, việc xác định thủ công vị trí gắn kết phối tử và các điểm tương tác chính giữa phối tử và protein mục tiêu, cùng với thông tin từ dữ liệu thực nghiệm như đột biến điểm trên các acid amin quan trọng sẽ tạo điều kiện thuận lợi để thiết lập mô hình SBP Trong trường hợp chỉ có cấu trúc protein mục tiêu, các công cụ tin sinh học dựa trên những phương pháp khác nhau để kiểm tra bề mặt protein và tìm kiếm các vị trí liên kết phối tử tiềm năng theo các thuộc tính khác nhau.35 Việc thiết lập và lựa chọn các đặc tính (features) pharmacophore có thể đạt độ chính xác cao hơn khi sử dụng cấu trúc phức hợp protein - phối tử Thông tin 3D của phức hợp protein và phối tử giúp xác định và sắp xếp không gian của các đặc điểm pharmacophore tương ứng với các nhóm chức năng có liên quan trực tiếp đến tương tác với mục tiêu Hơn nữa, sự hiện diện của phức hợp cho phép tính toán các hạn chế về không gian từ hình dạng vị trí liên kết thông qua việc bổ sung các thể tích loại trừ.33

1.2.1.3 Ứng dụng mô hình pharmacophore trong sàng lọc ảo

Trong nhiều thập kỉ qua, mô hình pharmacophore đã trở thành một trong những công cụ quan trọng của quá trình khám phá thuốc Ứng dụng phổ biến nhất của mô hình

pharmacophore là trong sàng lọc ảo từ cơ sở dữ liệu hợp chất lớn nhằm xác định các phân tử mới với các đặc điểm dược lý cần thiết có khả năng tác động lên một mục tiêu cụ thể Do mô hình pharmacophore đại diện các chức năng hóa học và mối quan hệ không gian, nên kết quả thu được thường bao gồm các hợp chất có cấu trúc đa dạng.16,33,34,36 Tương tác protein-protein là mục tiêu đầy hứa hẹn để kiểm soát sự dẫn truyền tín hiệu trong cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh lý trong đó có ung thư Mô hình pharmacophore với các đặc tính “bắt chước” các tương tác quan trọng trên bề mặt PPI sẽ thúc đẩy việc khám phá các chất phân tử nhỏ ức chế tương tác protein-protein (SMPPII) thông qua sàng lọc ảo.36,37

1.2.2 Mô hình gắn kết docking phân tử 1.2.2.1 Khái niệm

Docking phân tử (molecular docking) là một kỹ thuật thiết lập mô hình phân tử được sử dụng để dự đoán cách một protein tương tác với các phân tử nhỏ (phối tử).38Docking phân tử có thể được phân thành ba loại chính, bao gồm docking protein - ligand, protein - acid nucleic và protein - protein Trong đó, docking protein - ligand được nghiên cứu phổ biến nhất trong lĩnh vực thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc.39 Docking protein - ligand lại có thể phân loại theo cách sau: (a) Docking cố định, trong đó cả thụ thể và phối tử đều được giữ cố định; (b) Docking phối tử linh hoạt, trong đó thụ thể được giữ cố định, nhưng phối tử linh hoạt và (c) Docking linh hoạt, nghĩa là thụ thể và phối tử linh hoạt Cho đến nay, các thuật toán docking thường gặp nhất là sử dụng mô hình phối tử linh hoạt/protein cố định.34,40 Các phần mềm docking và thuật toán tìm kiếm đã được báo cáo như FlexX, Autodock, Discovery Studio, Glid, Fred hay Gold.41 Nghiên cứu chọn công cụ FlexX tích hợp trong LeadIT 2.1.842 sử dụng đơn giản để xây dựng các mô hình docking phân tử dựa trên cấu trúc của IL-8 và thụ thể CXCR1/2

1.2.2.2 Docking phân tử bằng FlexX/LeadIT

FlexX là công cụ docking dựa trên mảnh cấu trúc với các thuật toán xây dựng tăng dần để tìm kiếm cấu dạng, gồm ba giai đoạn: (1) Lựa chọn mảnh cơ sở, có nghĩa là phân chia phối tử thành các mảnh nhỏ bằng cách cắt đứt ở các liên kết đơn không vòng (2) Đặt các mảnh cơ sở được lựa chọn vào vị trí gắn kết được tạo thành do sự sắp xếp

thẳng hàng của bộ ba nguyên tử thuộc mảnh phối tử và bộ ba điểm của túi gắn kết mục tiêu Những bộ ba điểm này là tâm những quả cầu alpha thể hiện cho vị trí gắn kết vừa

khớp nhất (Hình 1.7) (3) Xây dựng phức hợp theo cách tăng dần bằng cách liên kết với

các phần còn lại của phối tử Tại mỗi giai đoạn, một cấu dạng bền nhất hay có mức năng lượng thấp nhất sẽ được chọn và chuyển sang bước xây dựng tiếp theo Do đó, phương pháp này phụ thuộc vào việc lựa chọn mảnh cơ sở và vị trí gắn kết.43,44 Hàm số tính điểm phụ thuộc vào số lượng liên kết quay và diện tích bề mặt của các tương tác hydro, ion, vòng thơm và kỵ nước.43

Hình 1.7 Cơ sở docking bằng công cụ FlexX/ LeadIT

“Nguồn: Corbeil CR, 2009”44

Một số phương pháp đã được ghi nhận để đánh giá mô hình docking phân tử Trong đó, một cách thường sử dụng là redocking (tái gắn kết) một hợp chất có cấu dạng và hướng gắn kết đã biết vào vị trí tác động của mục tiêu, thông thường từ cấu trúc đồng kết tinh.45,46 Một phương pháp đánh giá khác là sử dụng tập decoy, gồm các các chất

không có hoạt tính được tạo ra từ các chất có hoạt tính đã biết với đích tác động đang nghiên cứu Sau khi xếp loại các chất trong tập decoy dựa vào điểm số docking đồ thị đường cong ROC (receiver operating characteristic) và phần diện tích dưới đường cong (Area under the curve - AUC) của đường cong ROC được thiết lập Một mô hình docking với giá trị AUC càng cao thì càng có khả năng phân loại hiệu quả chất có/không có hoạt tính và càng đáng tin cậy.46,47

1.2.2.3 Ứng dụng docking phân tử trong sàng lọc ảo

Các phương pháp khác nhau được kết hợp liên tiếp trong quy trình sàng lọc

in silico có tính chất phân cấp trong đó bước sau sẽ phức tạp hơn, đòi hỏi tính toán

nhiều hơn bước trước đó, đồng thời tại mỗi bước kế tiếp các hợp chất ít tiềm năng nhất sẽ bị loại bỏ.36 Như đã mô tả ở phần trên, mô hình pharmacophore phù hợp để sàng lọc đầu tiên trên cơ sở dữ liệu lớn để xác định các hợp chất đáp ứng các yêu cầu về chức năng hình học và hóa học đơn giản Docking phân tử được áp dụng tiếp theo nhằm dự đoán cách thức liên kết cũng như ái lực gắn kết bằng cách sử dụng chức năng tính điểm (điểm số docking).4,16,34,36 Nhìn chung, ứng dụng chính của docking phân tử trong quá

trình sàng lọc in silico được ghi nhận:

Xác định ứng viên tiềm năng (hit): Docking phân tử thông qua chức năng tính điểm có thể sàng lọc một cách hiệu quả từ cơ sở dữ liệu lớn với mục đích xác định các hợp chất có khả năng gắn kết tốt với protein mục tiêu

Tối ưu hóa ứng viên tiềm năng: Docking phân tử cũng được sử dụng để xác định cấu dạng và cách thức gắn kết khi phối tử tương tác với protein, cung cấp cơ sở cho việc thiết kế các chất có hoạt tính tương tự hoặc mạnh hơn hay chọn lọc hơn.4,34,36

1.2.3 Mô phỏng động lực học phân tử và tính toán năng lượng gắn kết tự do 1.2.3.1 Mô phỏng động lực học phân tử

Mô phỏng động lực học phân tử (MDs) là quá trình dự đoán cách mà tất cả nguyên tử trong một protein hoặc một hệ thống phân tử khác chuyển động theo thời gian dựa trên một mô hình vật lý chung chi phối tương tác giữa các nguyên tử.48,49 Những mô phỏng này có thể cung cấp thông tin quan trọng ở mức độ phân tử, bao gồm thay đổi về cấu dạng, gắn kết phối tử và sự gấp cuộn protein, cũng như tiết lộ vị trí của từng hạt

nguyên tử và vận tốc của chúng Điều quan trọng là những mô phỏng như vậy cũng có thể dự đoán các phân tử sinh học sẽ phản ứng như thế nào ở cấp độ nguyên tử đối với các nhiễu loạn như đột biến, quá trình phosphoryl hóa hay proton hóa.48 Để làm được điều này, quá trình mô phỏng đòi hỏi việc cung cấp thông số mô tả các năng lượng tương tác trong một “trường lực” (force field) Khi tiến hành MDs, toàn bộ hệ gồm protein và phối tử sẽ được đặt trong một hộp giả định với dung môi nước và các ion nhằm trung hoà điện tích của hệ Sau đó, hệ sẽ được tiến hành đưa đến nhiệt độ, áp suất nhất định bằng các mô hình bể đẳng nhiệt hoặc đẳng áp giả định nhằm mô phỏng tối đa ở mức độ máy tính môi trường sinh lý của cơ thể Các tương tác và sự thay đổi cấu dạng của protein cũng như phối tử sẽ được lưu lại thành các hình ảnh quỹ đạo (trajectories) và có thể sử dụng để đánh giá độ ổn định của phức hợp trong suốt quá trình gắn kết.49

Việc ứng dụng MDs có khả năng cải thiện độ chính xác, giảm thiểu khả năng thất bại trong quá trình khám phá thuốc mới Trong vài thập kỷ qua, với sự phát triển của công nghệ thông tin, những cải tiến trong phần cứng máy tính, các thuật toán và cả các phần mềm cho phép quá trình mô phỏng dài hơn và tiết kiệm tài nguyên hơn MDs với phần cứng chuyên dụng cao đã dẫn đến sự gia tăng nhanh về tốc độ tối đa có thể đạt được, cho phép một số mô phỏng nhất định đạt khoảng thời gian mili giây Có lẽ quan trọng hơn, GPU (Graphics Processing Unit - đơn vị xử lý đồ họa) đã thúc đẩy quá trình thực hiện được diễn ra nhanh gấp nhiều lần Tiềm năng ứng dụng to lớn đã dẫn đến việc phát triển nhiều gói phần mềm để phục vụ cho quá trình thực hiện MDs, bao gồm GROMACS, AMBER, NAMD, CHARMM, LAMMPS, và Desmond Bên cạnh đó, một số phần mềm khác cũng được sử dụng để hỗ trợ cho việc phân tích kết quả có thể kể đến như MDTraj, VMD, MDAnalysis.48

1.2.3.2 Tính toán năng lượng gắn kết tự do

Thông qua quá trình mô phỏng động lực học phân tử, độ ổn định của sự gắn kết giữa protein và phối tử tại vị trí gắn kết được xác định Tuy nhiên việc định lượng khả năng gắn kết mạnh hay yếu phải dựa vào phương pháp tính toán năng lượng gắn kết tự do với kí hiệu là ∆Gbind Phương pháp diện tích bề mặt cơ học phân tử Poisson – Boltzman (MM/PBSA) và phương pháp diện tích bề mặt cơ học phân tử tổng quát Born

(MM/GBSA) là những phương pháp phổ biến để ước tính năng lượng tự do gắn kết giữa các phối tử phân tử nhỏ với các đại phân tử sinh học Việc kết hợp giữa mô hình mô tả phân tử docking, mô phỏng động lực học phân tử và MM/PB(GB)SA được chứng minh có khả năng xác định cấu dạng phối tử liên kết chính xác hơn so với các phương pháp docking thuần túy Phương pháp này hứa hẹn đóng vai trò vai trò chính trong các nghiên cứu sàng lọc ảo trong tương lai.50-53

1.2.4 Phân tích hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính

Dữ liệu về các đặc tính như hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính (ADMET) là một phần thiết yếu trong việc khám phá và phát triển các loại thuốc mới

Cả mô hình in vitro cũng như in vivo đều phải cung cấp các thông số này của thuốc, tuy

nhiên thường tốn kém nhiều thời gian và chi phí.54 Trong những thập kỷ gần đây, các

kỹ thuật in silico đã được áp dụng để dự đoán các đặc tính ADME của thuốc ở giai đoạn

đầu giúp sàng lọc nhanh chóng và toàn diện của các chất, sau đó sẽ nghiên cứu sâu hơn

với các thử nghiệm in vitro hay in vivo, tạo thuận lợi cho các phương pháp tiếp cận khám

phá và phát triển thuốc.55,56 Hiện nay, có sẵn nhiều loại phần mềm dùng để đánh giá ADMET của các ứng viên, như phần mềm thương mại gồm CASE ULTRA, DEREK, META-PC, METEOR hay GUSAR hoặc phần mềm truy cập mở trực tuyến ADMETlab, admetSAR, pkCSM, SwissADME, ProTox 3.0 phổ biến, được tích hợp đầy đủ với các nền tảng dự đoán ADMET, có khả năng loại trừ các chất không mong muốn, giảm số lượng tổng hợp và mức độ thất bại trong các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng.57

1.2.5 Thư viện các chất sàng lọc ảo 1.2.5.1 Thư viện ngân hàng thuốc

DrugBank là một cơ sở dữ liệu trực tuyến miễn phí, cung cấp thông tin về đặc điểm, cơ chế, tương tác, đích tác động hay thông tin tương tác của các thuốc đã được FDA phê duyệt cũng như các loại thuốc đang trong quá trình nghiên cứu, thử nghiệm DrugBank phiên bản mới nhất là DrugBank 5.0 cho thấy những cải tiến đáng kể và nội dung phong phú của cơ sở dữ liệu này Điểm nổi bật phải kể đến là về số lượng, chất lượng và tính nhất quán của chỉ định thuốc, thông tin về cách liên kết, tương tác thuốc, thông tin về ảnh hưởng của thuốc ở nhiều mức độ Thêm vào đó, thông tin về tình trạng

của các thử nghiệm lâm sàng của thuốc hiện có cũng được bổ sung Sự phát triển liên tục hơn 10 năm qua với những cải tiến rõ rệt để phù hợp với nhu cầu nghiên cứu và phát triển thuốc, DrugBank hiện là một trong những nguồn tài nguyên được sử dụng rộng rãi trên thế giới vì nội dung phong phú, chất lượng tốt và nguồn gốc chính thống.58

1.2.5.2 Thư viện ZINC (ZINC database) và công cụ ZINCpharmer

ZINC là một cơ sở dữ liệu miễn phí bao gồm các hợp chất đã thương mại hóa dùng trong các nghiên cứu sàng lọc ảo Được công bố vào năm 2005 bởi Irwin và Shoichet với 727.842 phân tử, đến nay ZINC tiếp tục tăng quy mô với phiên bản mới nhất ZINC20 bao gồm 1,4 tỷ chất, đa phần mua được Trong số 736 triệu phân tử giống thuốc trong ZINC, 509 triệu sẵn có, cho phép tải xuống miễn phí ở một số định dạng tệp phổ biến như SMILES, mol2 hay 3D SDF.59

ZINCPharmer là một công cụ trực tuyến để sàng lọc và tìm kiếm các hợp chất trong cơ sở dữ liệu ZINC thông qua mô hình pharmacophore ZINCPharmer cung cấp các công cụ để xây dựng và tinh chỉnh mô hình pharmacophore trực tiếp từ cấu trúc phân tử Việc tìm kiếm 176 triệu cấu dạng từ 18,3 triệu hợp chất cần thời gian chưa đến một phút Việc tìm kiếm nhanh chóng các chất từ công cụ ZINCPharmer giúp tiết kiệm tối đa thời gian nghiên cứu và hạn chế tiêu tốn tài nguyên máy tính.60

1.2.5.3 Thư viện NCI (NCI database)

Thư viện NCI được phát triển từ dự án của nhóm thiết kế thuốc có sự hỗ trợ máy tính, thuộc Viện Ung thư quốc gia (Mỹ) do tiến sĩ Nicklaus đứng đầu Đây là một cơ sở dữ liệu tập hợp khoảng nửa triệu cấu trúc, thường dùng trong sàng lọc các chất cho hoạt tính chống ung thư Khoảng 50% cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi các thỏa thuận bảo mật với các nhà cung cấp, trong khi 50% còn lại có thể truy cập miễn phí và được chuyển đổi thành nhiều định dạng khác nhau Những nỗ lực hiện tại, có sự phối hợp với nhiều nhóm và công ty khác nhau, đang được tiến hành để tăng đáng kể số cấu trúc cũng như số lượng và phạm vi của các thuộc tính trong khuôn khổ của dự án này Điều này nhằm

biến thư viện NCI thành một nguồn tài nguyên lớn trong việc sàng lọc in silico và thiết

kế thuốc có sự hỗ trợ của máy tính.61

1.2.5.4 Một số cơ sở dữ liệu có khả năng tiếp cận tại Việt Nam

Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương và viện Kiểm nghiệm Thuốc thành phố Hồ Chí Minh là hai cơ quan đầu ngành kiểm nghiệm, trực thuộc Bộ Y tế Trong các viện, khoa thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu chịu trách nghiệm xây dựng ngân hàng chất chuẩn và nhiều nhiệm vụ chuyên môn khác Các viện đã thiết lập được hơn 300 chất chuẩn hóa học, trên 100 chuẩn dược liệu và gần 30 chất chuẩn chiết từ dược liệu Danh mục chất chuẩn được công bố, cập nhật và có thể tải trên trang thông tin điện tử chính thức của các viện (http://vienkiemnghiem.gov.vn/chat-chuan-doi-chieu/) Ngoài ra, nghiên cứu còn sử dụng một tập chất phân lập nội bộ từ bộ môn Hóa Dược gồm 29 chất thuộc nhóm flavonoid hay polyphenol

1.3 Thử nghiệm đánh giá hoạt tính in vitro

1.3.1 Thử nghiệm đánh giá khả năng tương tác protein-phối tử

Tương tác giữa các phân tử sinh học là cốt lõi của hầu hết mọi hiện tượng/phản ứng sinh học, như tương tác thụ thể - phối tử (receptor - ligand), truyền tín hiệu hay điều hòa biểu hiện gen Tất cả đều được kiểm soát bởi sự nhận dạng gắn kết cụ thể của các phân tử, vì vậy nhu cầu về các phương pháp để mô tả sự tương tác của các phân tử sinh học rất được các nhà nghiên cứu quan tâm Những phương pháp như vậy đã được phát triển và cải tiến trong những năm gần đây, có thể kể đến như phép đo nhiệt lượng chuẩn độ đẳng nhiệt (ITC), cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) hay thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzym (ELISA)

1.3.1.1 Phương pháp đo nhiệt lượng chuẩn độ đẳng nhiệt

i Nguyên tắc

Phương pháp đo nhiệt lượng chuẩn độ đẳng nhiệt là một trong những kỹ thuật vật lý thường được sử dụng để nghiên cứu sự tương tác protein - phối tử Sự hình thành các tương tác protein - phối tử là một quá trình thuận nghịch do nhiệt liên quan đến sinh nhiệt hoặc hấp thụ nhiệt tùy thuộc vào kiểu liên kết, có thể được phát hiện bằng phép đo nhiệt lượng Thiết bị ITC bao gồm hai ngăn (cell), đó là một ngăn mẫu dành cho đại phân tử (protein IL-8/CXCR1/2) và ngăn còn lại là ngăn tham chiếu, chứa dung môi

Cả hai ngăn được giữ ở nhiệt độ và áp suất ổn định (Hình 1.8A)

Hình 1.8 Minh họa phương pháp đo lường sự gắn kết (A) ITC và (B) SPR

“Nguồn: Wu X, 2022”62

Phối tử được bơm từ ống tiêm vào ngăn mẫu và được chuẩn độ sau đó Trong phương pháp ITC, hai chất được đo ái lực gắn kết được trộn lẫn trong ngăn mẫu (sample cell) bằng một đầu bơm mẫu được kiểm soát bằng hệ thống vi tính Sự thay đổi nhiệt năng được đo lường tương ứng với năng lượng cần thiết để duy trì nhiệt độ của ngăn mẫu bằng với nhiệt độ của ngăn tham chiếu (reference cell) với độ chính xác cao Ở

Hình 1.8A, trục tung của biểu đồ ITC cho thấy sự thay đổi về nhiệt trên mỗi đơn vị thời

gian (tính bằng cal/s) và trục hoành biểu thị thời gian Trong quá trình chuẩn độ, hệ thống điều chỉnh đầu ra theo đường cong giải phóng nhiệt và các thông số nhiệt động có thể được tính toán để mô tả liên kết phối tử.62,63

ii Ứng dụng

ITC là một trong những phương pháp thử nghiệm hiệu quả nhất để xác định sự tương tác với nhiều ưu điểm gồm độ nhạy và độ chính xác cao, tính ổn định, không cần thuốc thử hoặc protein đánh dấu Do yêu cầu thời gian dài cho mỗi lần chuẩn độ và lượng lớn protein cần thiết (khoảng 0,5 mg), ITC thường sử dụng để sàng lọc thứ cấp.62,63

Barter và cộng sự đã sử dụng phương pháp ITC mô tả đặc điểm gắn kết giữa 8 monomer với CXCR1/2 tại hai vị trí bao gồm đầu N (vị trí 1) và/hoặc vòng ngoại bào 3 (vị trí 2) của thụ thể Thực hiện thử nghiệm bằng cách bơm IL-8 (0,01 đến 0,03 mM) trong ngăn mẫu; ngăn đối chiếu chứa nước cất Lần đầu bơm 3 μL, sau đó mỗi lần bơm

IL-là 8 μL (thực hiện 36 lần bơm) với thời gian cân bằng 5 phút giữa các lần Dữ liệu ITC được phân tích trong Origin ITC ver5.0 (MicroCal Inc., Northampton, MA).64

1.3.1.2 Phương pháp cộng hưởng plasmon bề mặt

i Nguyên tắc

Cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) là một công cụ nghiên cứu về tương tác hay gắn kết cho các phân tử sinh học Đo lường sự gắn kết dựa trên phương pháp SPR liên quan đến việc cố định phân tử sinh học trên bề mặt của chip cám biến đơn lớp như dextran carboxymethylat được gắn đồng hóa trị với bề mặt vàng Sau đó cho các dung dịch với nồng độ chất phân tích khác nhau chảy qua và liên kết liên tục với protein Điều này dẫn đến sự thay đổi độ khúc xạ chỉ số của bề mặt kim loại và sự dịch chuyển góc SPR Cuối cùng, việc khớp dữ liệu biểu đồ cám biến với một mô hình động học gắn kết thích hợp cho phép tính toán các thông số động học như hằng số liên kết (ka), phân ly (kd) và ái lực gắn kết (Hình 1.8B) Kể từ lần đầu tiên được giới thiệu vào đầu những

năm 1990, SPR đã được chứng minh là một trong những công cụ tốt để xác định tính đặc hiệu, ái lực và các thông số động học trong quá trình gắn kết của đại phân tử Phương pháp này có thể xác định sự tương tác trong nhiều loại liên kết, bao gồm protein-protein, protein-DNA, enzym-cơ chất hoặc chất ức chế, thụ thể-thuốc, màng lipid-protein, protein-polysacarid, tế bào hoặc virus-protein, và một số loại khác SPR đã được ứng dụng phổ biến bởi đây là một kỹ thuật không đánh dấu, chỉ một trong số các phân tử tương tác phải được cố định trên bề mặt cám biến và áp dụng trên nhiều loại môi trường, bắt chước các môi trường sinh học như màng tế bào.62,65-67

ii Ứng dụng

Phương pháp SPR được nhóm tác giả Jiang sử dụng để mô tả đặc điểm gắn kết của các peptid chiết xuất từ IL-8 gồm peptid p_wt14 và peptid đột biến p_K15A với đầu N của CXCR1 (CXCR1p) 10μM p_wt14 và p_K15A được pha loãng vào dung dịch đệm natri acetat 10mM ở pH 5,0 và cố định vào chip cám biến với tốc độ dòng chảy 5 μl/phút Dữ liệu về động học và ái lực gắn kết phối tử - thụ thể đạt được bằng cách dùng bảy nồng độ CXCR1p (0μM, 15μM, 30μM, 120μM, 240μM, 360μM và 480μM) trên chip theo tuần tự ở tốc độ dòng chảy 50μl/phút trong 2 phút Tín hiệu phản hồi được

đo tại hai thời điểm 0 và 120 giây để thu được thông tin về tốc độ CXCR1p liên kết và phân ly từ p_wt14/ p_K15A Đường cong liên kết cân bằng thu được cho mỗi peptid, từ đó xác định kd của liên kết của peptid IL-8 (p_wt14 và p_K15A) với CXCR1p.31

1.3.1.3 Thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzym (ELISA)

i Nguyên tắc

ELISA hoạt động dựa trên phản ứng kháng nguyên-kháng thể, phức hợp tạo thành được đánh dấu bằng cách sử dụng các enzym như phosphatase kiềm (ALP), horseradish peroxidase (HRP) Kháng nguyên trong pha lỏng được cố định trên pha rắn, ví dụ đĩa vi thể làm từ polystyren, polyvinyl clorid hay polypropylen Sau đó, kháng nguyên sẽ phản ứng với một kháng thể cụ thể, kháng thể này được phát hiện bởi kháng thể thứ cấp có gắn enzym Sự thay đổi màu bằng cách sử dụng cơ chất tạo màu tương ứng với sự hiện

diện của kháng nguyên Ví dụ, ALP thủy phân para-nitrophenyl phosphat (pNPP) để tạo ra para-nitrophenol, có thể được phát hiện ở bước sóng 405 nm (màu vàng) hay HRP

xúc tác quá trình chuyển đổi các cơ chất như muối diamoni của acid

2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin)-6-sulfonic (ABTS), 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidin (TMB) và

octo-phenylenediamin (ODP) thành sản phẩm có màu Các phản ứng enzym-cơ chất này thường hoàn thành trong vòng 30-60 phút và phản ứng dừng lại khi thêm dung dịch thích hợp, như natri hydroxid, acid clorhydrid, acid sulfuric hay natri carbonat cho từng phản ứng Cuối cùng, các sản phẩm có màu được phát hiện bằng máy đo quang phổ đa giếng và từ đó định lượng gián tiếp các chất phân tích quan tâm.68-70

ii Ứng dụng

Hiện nay, nhiều bộ kit ELISA thương mại dựa trên các phương pháp tiếp cận như ELISA sandwich và ELISA cạnh tranh được cung cấp bởi nhiều công ty sinh học trên thế giới dùng trong các nghiên cứu sàng lọc Để đánh giá khả năng gắn kết giữa phối tử đích (IL-8) và thụ thể (CXCR1/2) khi có mặt chất ức chế tiềm năng, nghiên cứu sử dụng bộ kit thử nghiệm gắn kết IL-8/CXCR1/2 của hãng RayBioTech đã được cấp bằng sáng

chế (Hình 1.9) Sử dụng cách tiếp cận này, các chất ức chế có thể được sàng lọc theo

kiểu thông lượng cao, thúc đẩy sự phát triển của liệu pháp điều trị liên quan đến IL-8/CXCR1/2