Nghiên cứu và chế tạo cảm biến sinh học trên cơ sở công nghệ polyme in phân tử ứng dụng phát hiện một số phân tử nhỏ (protein, kháng nguyên, kháng sinh)

THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hóa chất và thiết bị

Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu có độ tinh khiết trên 95%, cho phép sử dụng trực tiếp mà không cần tinh chế thêm Các hóa chất này bao gồm:

 Gold (III) chloride trihydrate (HAuCl4) được sử dụng để tạo lớp hạt nano vàng(AuNPs) phân tán trên bề mặt điện cực mực in các bon (SPCE);

 p-Aminothiophenol (p-ATP): monome tạo poly(aminothiophenol) hoặc màng đơn lớp tự lắp ghép (SAM) trên điện cực AuNPs/SPCE;

 Cysteamine: tạo màng SAM trên điện cực AuNPs/SPCE;

 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) hydrochloride, N- hydroxysuccinimide (NHS): được sử dung để hoạt hóa nhóm -COOH của kháng thể Enrofloxacin (ENRO);

 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES): dung dịch đệm pha NHS và EDC;

 Protein phân tử nhỏ Sarcosine, 17β-estradiol và kháng sinh chloramphenicol (CAP), Ciprofloxacin (CF) và Norfloxacin (NOR);

 Kháng nguyên và kháng thể đơn dòng enrofloxacin (ENRO)

 Ethanolamin sử dụng thụ động hóa các liên kết không đặc hiệu sau bước cố định kháng thể lên bề mặt điện cực cảm biến;

 Dung dịch đệm muối photphat PBS 1X, 50% glycerol, pH=7,4: sử dụng pha kháng nguyên và kháng thể;

 KCl và cặp chất dò oxy hóa/khử K3Fe(CN)6 /K4Fe(CN)6: sử dụng đo phổ trở kháng phức;

 Ethanol, HCl và H2SO4: sử dụng làm sạch bề mặt điện cực;

Dung dịch đệm phosphate-buffered saline (PBS) được tạo ra bằng cách hòa tan các muối natri phosphate và natri clorua trong nước tinh khiết với nồng độ đạt 100 mM Sau khi pha chế, dung dịch PBS 100 mM sẽ được điều chỉnh pH bằng máy đo pH Hanna để đảm bảo độ chính xác.

Bộ phận chuyển đổi tín hiệu của cảm biến trong nghiên cứu là điện cực mực in các bon (SPCE) do hãng BioDevice Technology, Nhật Bản sản xuất SPCE có cấu trúc đặc biệt, giúp tối ưu hóa hiệu suất và độ nhạy trong các ứng dụng cảm biến.

Bài viết mô tả về một thiết bị điện hóa với ba điện cực tích hợp trên đế nhựa, bao gồm điện cực làm việc, điện cực đối và điện cực chuẩn, sử dụng mực in carbon và Ag/AgCl Diện tích bề mặt của điện cực làm việc là 2,64 mm² Thiết bị Ivium Vertex từ Ivium Technologies B.V., Eindhoven, Hà Lan, được sử dụng để tạo ra hạt nano vàng (AuNPs) trên điện cực làm việc của SPCE và thực hiện các phép đo phổ tổng trở (EIS).

Quy trình công nghệ chế tạo đầu thu sinh học nhân tạo MIP

Quy trình công nghệ chế tạo đầu thu sinh học nhân tạo MIP cho cảm biến phát hiện phân tử nhỏ, kháng nguyên và kháng sinh được mô tả qua 5 bước cơ bản như hình 2.1.

Bước 1 : Biến tính điện cực SPCE bởi lớp hạt nano vàng (AuNPs) mỏng, phân tán đều trên toàn bộ diện tích điện cực;

Bước 2 : Tạo lớp màng đơn lớp tự lắp ghép (SAM) của phân tử p- aminothiophenol (p-ATP) trên bề mặt điện cực AuNPs-SPCE;

Bước 3 : Gắn phân tử chất in lên điện cực SAM (p-ATP)/AuNPs-SPCE

Bước 4 : Tạo màng polyme có chứa phân tử chất in (MIP)

Bước 5 : Loại bỏ phân tử chất in ra khỏi màng polyme MIP

Sau khi tạo màng SAM, quy trình tiếp theo bao gồm cố định kháng thể và thực hiện phản ứng tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể Các bước 4 và 5 sẽ được thực hiện sau đó Mỗi loại đầu thu MIP sẽ có công nghệ đặc thù tại bước 4, giúp nâng cao độ nhạy của cảm biến MIP/EIS Tính đặc thù này được nghiên cứu dựa trên cấu trúc phân tử của các chất in và sự tương thích với monome p-ATP trong việc tạo màng polyme MIP Chi tiết từng bước trong quy trình công nghệ sẽ được trình bày ở các phần tiếp theo.

Hình 2.1 Quy trình công nghệ chế tạo đầu thu sinh học nhân tại MIP phát hiện phân tử nhỏ

(protein, kháng nguyên và kháng sinh) trên điện cực SPCE.

2.2.1 Chuẩn bị điện cực in carbon biến tính hạt vàng (AuNPs-SPCE)

Phương pháp điện hóa quét thế tuần hoàn (cyclic voltammetry) được áp dụng để tổng hợp lớp hạt nano vàng (AuNPs) mỏng trên bề mặt điện cực SPCE Kích thước và mật độ của AuNPs phụ thuộc vào nồng độ HAuCl4 và số vòng quét CV Dựa trên các nghiên cứu trước đây của nhóm BM Vật liệu điện tử, Viện VLKT, ĐHBKHN, điều kiện tổng hợp tối ưu được xác định với nồng độ 100 µM HAuCl4 trong dung dịch đệm PBS 100 mM và 20 vòng quét CV.

35 àL dung dịch HAuCl4 được nhỏ lên bề mặt SPCE để bao phủ cả ba điện cực, bao gồm điện cực chuẩn Ag/AgCl, điện cực đối và điện cực làm việc Thiết lập phần mềm Ivium Vertex ở chế độ quét thế tuần hoàn trong dải điện áp từ -600 mV đến +500 mV so với Ag/AgCl, với tốc độ quét 50 mV/s và 20 vòng quét Sau đó, điện cực được rửa bằng ethanol và nước cất hai lần, rồi sấy khô bằng khí N2 Để làm sạch bề mặt điện cực, quét trong dung dịch H2SO4 1 M với tốc độ 50 mV/s trong dải điện áp từ -200 đến +1400 mV so với Ag/AgCl cho đến khi có đáp ứng điện hóa ổn định, thường sau 5 vòng quét Cuối cùng, điện cực được rửa lại và sấy khô, chuẩn bị cho quá trình chế tạo đầu thu sinh học MIP với điện cực carbon biến tính hạt vàng (AuNPs-SPCE).

Biểu diễn đặc trưng dòng - thế khi biến tính điện cực in các bon bằng lớp hạt Au mỏng cho thấy sự xuất hiện của píc khử Au (III) sang Au (0) tại điện áp -0.4 V so với Ag/AgCl Việc phủ hạt nano Au lên bề mặt điện cực SPCE không chỉ cải thiện tính năng của điện cực mà còn tạo điều kiện cho các monome p-ATP gắn kết, từ đó hình thành nền tảng cho việc tạo màng polyme MIP sau này.

Hình 2.2 Đặc trưng dòng-thế khi hệ điện cực được quét CV 20 vòng trong dung dịch PBS

100 mM chứa 100 àM HAuCl 4 với tốc độ quột 50 mV trong dải điện ỏp từ -600 mV đến

2.2.2 Tạo lớp màng SAM (p-ATP) trên điện cực AuNPs-SPCE Đầu tiên, p-ATP được hòa tan trong dung môi ethanol để đạt được nồng độ 25 mM Ngâm điện cực AuNPs-SPCE trong dung dịch này, để qua đêm trong buồng tối ở nhiệt độ phòng (khoảng 15 tiếng) Một lớp đơn phân tử p-ATP sẽ được hình thành do sự tự lắp ráp của các phân tử p-ATP lên trên bề mặt của Au thông qua liên kết thiol tức là liên kết giữa nguyên tử lưu huỳnh của nhóm -SH (thiol) và vàng Như vậy trên bề mặt điện cực lúc này sẽ có một lớp màng SAM có nhóm -

NH2 hướng ra ngoài Nhóm này đóng vai trò là đích oxy hóa để tạo mạch chính cũng như liên kết chéo trong quá trính polyme hóa.

2.2.3 Gắn các phân tử chất in vào màng SAM

Trong quá trình này, phân tử chất in được gắn vào màng SAM (p-ATP) trên bề mặt điện cực thông qua lực hút tĩnh điện giữa đế Au và phân tử chất in phân cực Đầu tiên, nồng độ tối ưu của chất in được xác định trong môi trường axit nhẹ như HCl Sau đó, 35 µL dung dịch này được nhỏ lên ba điện cực AuNPs-SPCE và áp thế -600 mV so với Ag/AgCl trong 600 giây Trong thời gian này, các nguyên tử Nitơ trong nhóm -NH2 của màng SAM bị proton hóa thành nhóm -NH2 + Dưới điện thế không đổi, các phân tử chất in tích điện âm được kéo gần lại bề mặt điện cực SAM(p-ATP)/AuNPs-SPCE nhờ lực hút tĩnh điện.

Dung dịch tạo màng polyme được pha trong dung dịch đệm 100 mM KCl/50 mM PBS với 12 mM p-ATP và chất in ở nồng độ xác định Sau đó, 35 L dung dịch này được nhỏ lên ba điện cực và tiến hành quét thế tuần hoàn trong khoảng điện áp từ -200 mV đến +600 mV so với Ag/AgCl với tốc độ quét 50 mV/s và số vòng quét xác định Màng polyme in phân tử hình thành dần dần trên bề mặt điện cực, đạt độ dày phù hợp tùy thuộc vào số vòng quét Quá trình hình thành màng polyme diễn ra thông qua liên kết polyme liên hợp của cặp electron từ nguyên tử nitơ của phân tử p-ATP, tạo ra chuỗi poly (p-ATP) với cấu trúc xen kẽ giữa vòng phenyl và nhóm chức chứa gốc nitơ trong môi trường có độ pH 6,86.

N sẽ bị proton hóa một phần, tạo ra các hạt mang điện trong ma trận polyme, giúp màng MIP có tính dẫn điện Trong quá trình trùng hợp, các phân tử chất in liên kết với p-ATP thông qua liên kết hidro giữa nguyên tử O/N và H Tỉ lệ giữa chất in và nồng độ monome p-ATP ảnh hưởng đến số liên kết hình thành và độ ổn định của màng polyme trên bề mặt điện cực Tỉ lệ nồng độ thường được chọn từ 3:1 đến 6:1 để tối ưu hóa sự tổng hợp màng polyme MIP Nghiên cứu này xác định tỉ lệ tối ưu giữa monome p-ATP và chất in là 4:1 dựa trên kích thước và cấu trúc của phân tử chất in.

Một loạt phân tử nhỏ đã được lựa chọn để nghiên cứu và phát triển cảm biến với độ nhạy, độ chọn lọc và giới hạn phát hiện phù hợp cho ứng dụng chẩn đoán Các phân tử này được phân loại thành ba nhóm chính: protein, kháng nguyên và kháng sinh, nhằm tối ưu hóa hiệu quả của cảm biến trong lĩnh vực y tế.

MIP (Molecularly Imprinted Polymer) nhận diện phân tử dựa trên hình dạng, kích thước và nhóm chức hóa học của chất phân tích Do đó, các phân tử nhỏ được chọn làm chất phân tích một cách có chủ đích Trong nhóm protein, sarcosine và 17β-estradiol (E2) được lựa chọn vì chúng có cấu trúc hóa học hoàn toàn khác biệt.

Enrofloxacin (ENRO) là một loại kháng sinh có hoạt tính phổ rộng, thường được sử dụng trong điều trị các bệnh truyền nhiễm ở động vật Tuy nhiên, việc sử dụng ENRO có thể dẫn đến tồn dư trong cơ thể động vật, gây ra sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc và dị ứng Do đó, cần thiết phải kiểm soát chặt chẽ việc sử dụng kháng sinh trong thú y, bao gồm cả điều trị và dự phòng, cũng như phát triển các phương pháp sàng lọc nhanh và nhạy để phát hiện dư lượng kháng sinh Phương pháp sàng lọc phổ biến hiện nay là sử dụng phản ứng miễn dịch kháng nguyên-kháng thể để phát hiện kháng nguyên ENRO Ngoài ra, việc sử dụng kháng sinh trong điều trị động vật, đặc biệt là thủy hải sản, cũng đặt ra lo ngại về dư lượng thuốc trong chuỗi thức ăn và sự kháng thuốc của vi khuẩn, dẫn đến việc thiết lập giới hạn dư lượng tối đa (MRL) cho một số loại kháng sinh như phenicol và fluoroquinolon Do đó, nghiên cứu cũng tập trung vào các phân tử kháng sinh chloramphenicol, ciprofloxacin và norfloxacin, với cấu trúc hóa học của chúng được trình bày trong Hình 2.3.

Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của các chất phân tích lựa chọn trong nghiên cứu.

Để phát triển cảm biến với độ nhạy và chọn lọc cao, các kỹ thuật bổ sung đã được áp dụng trong quá trình tổng hợp màng polymer MIP, dựa trên đặc điểm của công nghệ MIP và cấu trúc hóa học của các chất phân tích Những kỹ thuật này sẽ được mô tả chi tiết trong phần tiếp theo.

Quy trình công nghệ được trình bày trên hình 2.4 Đối với cảm biến này, có các kỹ thuật được thêm vào như sau:

Bước 1: Tạo màng đơn lớp tự lắp ghép (SAM) của Cysteamine và p- aminothiophenol trên điện cực AuNPs-SPCE.

Hình 2.4 trình bày sơ đồ quy trình thực nghiệm trong việc chế tạo cảm biến, sử dụng đầu thu sinh học tự nhiên kháng thể ENRO kết hợp với đầu thu sinh học nhân tạo ENRO-MIP.

Bước 2: Hoạt hóa nhóm -COOH của kháng thể ENRO bằng NHS và EDC Kháng thể ENRO được pha trong dung dịch đệm PBS 100 mM (pH là 7,4) với nồng độ

Hỗn hợp dung dịch NHS và EDC được pha trong đệm MES (pH 4,7) với nồng độ 0,1 M và 0,2 M Sau đó, 10 µL dung dịch EDC-NHS được thêm vào 90 µL dung dịch kháng nguyên ENRO, trộn đều bằng máy vortex và để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Trong quá trình này, EDC-NHS sẽ phản ứng với nhóm cacboxyl của kháng thể ENRO, tạo thành nhóm ester trung gian có khả năng liên kết với nhóm amin (-NH2) của màng SAM, hình thành liên kết amit bền vững.

Bước 3: Cố định khỏng thể ENRO đó hoạt húa nhúm -COOH Nhỏ 2 àL khỏng thể

Quy trình phân tích dư lượng và hàm lượng kháng sinh Norfloxacin

2.3.1 Phân tích dư lượng kháng sinh NOR trong nước hồ nuôi thủy sản

Chúng tôi thực hiện nghiên cứu để xác định dư lượng kháng sinh trong nước nuôi trồng thủy sản, cụ thể là hồ nuôi cá Bớp tại Phú Yên Sau khi liên hệ với trang trại sản xuất thủy sản giống, chúng tôi nhận được thông tin chi tiết về các loại kháng sinh và thời gian sử dụng Mẫu nước được thu thập ngẫu nhiên từ 5 vị trí của hồ nuôi cá Bớp trong giai đoạn sinh trưởng Phân tích sẽ được thực hiện bằng hai phương pháp: cảm biến tự chế và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Quy trình phân tích bắt đầu bằng việc xử lý mẫu nước, được bảo quản lạnh ở 4°C, sau đó lắng và lấy 70% nước ở phần trên Chúng tôi pha loãng nước với axit axetic (10%) theo tỷ lệ 9:1 và rung siêu âm để hòa tan kháng sinh NOR Mẫu nước sau đó được phân tích bằng cảm biến, với 2 µL mẫu được nhỏ lên cảm biến và để trong 15 phút Giá trị điện trở truyền điện tích thu được sẽ được so sánh với đường chuẩn để xác định dư lượng kháng sinh Để kiểm chứng độ thu hồi, chúng tôi thêm kháng sinh chuẩn vào mẫu nước và phân tích lại, cho thấy cảm biến có độ thu hồi cao (> 95%) Cuối cùng, để kiểm chứng độ lặp lại, chúng tôi phân tích 3 mẫu nước tương tự và đo nồng độ như các mẫu đã phân tích trước đó.

Hình 2.7 Quy trình phân tích xác định hàm lượng kháng sinh Norfloxacin của mẫu nước hồ nuôi thủy sản theo 2 phương pháp EIS và HPLC

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để phân tích dư lượng kháng sinh Norfloxacin trong nước hồ nuôi cá Bớp Đầu tiên, kháng sinh Norfloxacin được mua từ Sigma với độ tinh khiết 98% và được pha chế để tạo thành dung dịch chuẩn có nồng độ 500 µg/mL Dung dịch này được pha loãng và lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm vào hệ thống HPLC Các mẫu nước hồ nuôi cũng được chuẩn bị tương tự và sau đó được phân tích để xác định hàm lượng Norfloxacin Kết quả phân tích được ghi lại và so sánh với đường chuẩn đã xây dựng, cho phép tính toán độ thu hồi của mẫu Biểu đồ đường chuẩn được xây dựng với sáu mức nồng độ khác nhau, từ đó xác định độ dốc và độ tuyến tính của đường chuẩn.

2.3.2 Phân tích hàm lượng kháng sinh Norfloxacin trong dược phẩm

Chúng tôi tiến hành phân tích hàm lượng kháng sinh Norfloxacin trong thuốc kháng sinh NOR 400 mg, bao gồm 400 mg Norfloxacin và tá dược Kháng sinh này chỉ có tác dụng điều trị nhiễm khuẩn, không hiệu quả với nhiễm virus như cảm lạnh hay cúm NOR 400 mg là một loại kháng sinh phổ biến, dễ dàng mua tại hiệu thuốc mà không cần đơn bác sĩ Để xác định hàm lượng Norfloxacin trong thuốc, chúng tôi sử dụng hai phương pháp: quang phổ UV-vis và cảm biến NOR-MIP/EIS.

Hình 2.8 Thuốc kháng sinh Norfloxacin 400 mg.

Quy trình phân tích kháng sinh Norfloxacin được thực hiện như sau: sau khi nghiền viên thuốc thành bột, hỗn hợp được hòa tan trong 20 mL dung dịch axit acetic 1% và rung siêu âm trong 20 phút Hỗn hợp sau đó được lọc qua màng lọc 0,45 µm và ly tâm ở tốc độ 6000 rpm trong 5 phút Tiếp theo, hỗn hợp được pha loãng với nhiều nồng độ khác nhau để phục vụ cho phân tích UV-vis và điện hóa Cuối cùng, 2 µL dung dịch được nhỏ lên cảm biến điện hóa NOR-MIP, sau 15 phút cảm biến được rửa sạch và sấy khô trước khi tiến hành phân tích điện hóa Giá trị điện trở truyền điện tích chênh lệch ΔRCT được ghi lại và so sánh với đường chuẩn để xác định nồng độ kháng sinh.

Quy trình xác định nồng độ kháng sinh Norfloxacin trong thuốc kháng sinh 400 mg được thực hiện bằng phương pháp điện hóa và UV-VIS Để phân tích hàm lượng kháng sinh, cần xây dựng đường chuẩn từ mẫu chuẩn Norfloxacin (98%) được pha loãng trong acid acetic 1% với nồng độ 10 mg/mL Mẫu được pha loãng thành nhiều nồng độ từ 1 àg/mL đến 40 àg/mL, và đường chuẩn được xây dựng dựa trên mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh hấp thụ Phân tích được thực hiện trong dải bước sóng từ 200 đến 400 nm, do Norfloxacin có tính hấp thụ mạnh trong tia cực tím Sau khi đo mẫu chuẩn, giá trị diện tích đỉnh lớn nhất được ghi lại và phân tích ba lần để lấy giá trị trung bình Mẫu thuốc được pha loãng 20.000 lần (20 àg/mL), 40.000 lần (10 àg/mL) và 200.000 lần (2 àg/mL), với độ sai số rất thấp (< 3%) Kết quả trung bình được so sánh với đường chuẩn để xác định hàm lượng Norfloxacin trong thuốc.

Các thông số đánh giá hoạt động của cảm biến

2.4.1 Độ nhạy của cảm biến Độ nhạy là tính đáp ứng tín hiệu của cảm biến khi thay đổi nồng độ chất cần phân tích hay khả năng phát hiện sự thay đổi tín hiệu tín hiệu khi có sự thay đổi về nồng độ chất cần phân tích Đối với cảm biến phổ tổng trở, độ nhạy của cảm biến được xác định bởi tỷ số giữa sự thay đổi của giá trị điện trở truyền điện tích  R ct và sự thay đổi nồng độ chất phân tích tương ứng C theo công thức:

2.4.2 Khoảng tuyến tính của cảm biến

Khoảng tuyến tính của cảm biến được xác định từ nồng độ thấp nhất đến nồng độ cao nhất mà tín hiệu đáp ứng của cảm biến tuân theo phương trình tuyến tính Nghiên cứu này nhằm phát hiện các phân tử nhỏ để cảnh báo sớm, do đó khoảng nồng độ khảo sát và khoảng tuyến tính sẽ tương ứng với mức độ cảnh báo của từng chất phân tích.

2.4.3 Độ lặp lại của cảm biến Độ lặp lại của cảm biến được xác định thông qua khảo sát hoạt động của 3-10 cảm biến độc lập được chế tạo với cùng quy trình thực nghiệm và được khảo sát tại cùng nồng độ chất phân tích

2.4.4 Giới hạn phát hiện của cảm biến

Giới hạn phát hiện của cảm biến được xác định theo quy tắc 3 (3 lần độ lệch chuẩn của mức nhiễu trung bình) và được tính toán theo công thức:

- LOD là giới hạn phát hiện của cảm biến.

- Slope là độ dốc của đường chuẩn

STDEV là giá trị độ lệch chuẩn của mẫu trắng, được tính theo công thức trong đó n là số mẫu trắng khảo sát, yi là giá trị đo của mẫu trắng ở lần đo thứ i và y là giá trị trung bình của n mẫu trắng.

2.4.5 Độ chọn lọc của cảm biến Độ chọn lọc của cảm biến được khảo sát bằng cách đo tín hiệu khi cho cảm biến tiếp xúc với môi trường chứa phân tử chất có cấu trúc hóa học và kích thước gần giống với chất phân tích hoặc trong môi trường chứa đồng thời cả chất phân tích và chất có cấu trúc hóa học tương tự.

Các phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp phân tích phổ Raman

Phương pháp phổ tán xạ Raman là công cụ hiệu quả trong việc nghiên cứu và xác định thành phần, tính chất vật lý và cấu trúc hóa học của vật liệu Phương pháp này dựa trên hiệu ứng Raman, liên quan đến sự tán xạ không đàn hồi của photon khi tương tác với các phân tử, dẫn đến sự thay đổi mức năng lượng của chúng Khi photon có năng lượng thấp không đủ để kích thích điện tử lên mức cao hơn, nó sẽ bị tán xạ thành hai loại: tán xạ đàn hồi (Rayleigh) và tán xạ không đàn hồi, trong đó tán xạ không đàn hồi tạo ra hiệu ứng Raman Cụ thể, phân tử ở trạng thái dao động cơ bản có thể hấp thụ năng lượng, chuyển lên trạng thái giả kích thích và phát xạ photon, gọi là tán xạ Stokes Ngược lại, các phân tử ở trạng thái kích thích do năng lượng nhiệt có thể chuyển về trạng thái cơ bản và phát xạ photon trong quá trình tán xạ anti-Stokes.

Hình 2.10 Mô hình tán xạ Rayleigh, Stoke và anti-Stoke.

Phổ kế Raman có chức năng chính là loại bỏ tán xạ đàn hồi Rayleigh và phát hiện các thành phần tán xạ không đàn hồi Raman với cường độ thấp Để đạt được điều này, nguồn bức xạ cần phải là đơn sắc và phổ kế phải có độ nhạy cao nhằm thu nhận tín hiệu tán xạ không đàn hồi Ngoài các hệ đo Raman thông thường, các công nghệ như cộng hưởng Raman, hiển vi Raman và FT-Raman đã được phát triển để tăng cường cường độ tín hiệu và giảm thiểu ảnh hưởng của huỳnh quang Theo phân bố Maxwell-Boltzmann, tại nhiệt độ phòng, hầu hết các dao động phân tử ở trạng thái cơ bản, dẫn đến tán xạ anti-Stokes có cường độ yếu hơn nhiều so với tán xạ Stokes, khiến cường độ vạch phổ Stokes lớn hơn đáng kể so với vạch phổ anti-Stokes Do đó, trong các hệ đo thực tế, phổ Raman thường chỉ ghi nhận các vạch phổ ứng với tán xạ Stokes.

2.5.2 Phương pháp phân tích phổ UV-vis

Phân tích quang phổ là phương pháp phổ biến để xác định thành phần hóa học và các tính chất vật lý, hóa học của chất Với sự tiến bộ của khoa học và công nghệ, các phương pháp phân tích quang ngày càng chính xác và đa dạng, mang lại nhiều lựa chọn cho nghiên cứu Một trong những phương pháp được ưa chuộng là phân tích phổ hấp thụ UV-vis, nổi bật với khả năng phân tích định tính và định lượng chính xác với chi phí hợp lý Cơ sở lý thuyết của phương pháp này dựa trên hiện tượng hấp thụ bức xạ điện từ của các nguyên tử, thể hiện qua sự giảm cường độ sáng của chùm sáng khi đi qua môi trường vật chất.

Hình 2.11 Cường độ sáng của chùm sáng giảm khi đi qua môi trường vật chất.

Hiện tượng hấp thụ bức xạ điện từ trong môi trường vật chất xảy ra do sự tương tác giữa điện trường của sóng điện từ và các điện tử trong nguyên tử, khiến chúng dao động với tần số tương ứng Khi đó, các điện tử trở thành nguồn photon thứ cấp, dẫn đến hiện tượng giao thoa giữa sóng tới và sóng thứ cấp, làm giảm cường độ sóng truyền qua môi trường do một phần bị hấp thụ và phần còn lại phát ra bức xạ thứ cấp Nguyên lý của phương pháp phân tích phổ hấp thụ UV-vis dựa trên khả năng hấp thụ khác nhau của các vật chất đối với từng bước sóng, cho phép xác định tính chất của vật liệu thông qua việc đo lượng bức xạ bị hấp thụ.

Định luật Lambert mô tả mối quan hệ giữa cường độ bức xạ tới và cường độ bức xạ thoát ra, chịu ảnh hưởng bởi độ dày của lớp vật chất hấp thụ Định luật này giúp đơn giản hóa việc phân tích định lượng trong phương pháp phân tích phổ hấp thụ UV-vis, cung cấp cái nhìn rõ ràng hơn về nguyên lý và phương pháp thực hiện.

Hệ số k, được gọi là hệ số hấp thụ, phụ thuộc vào bản chất của môi trường và bước sóng ánh sáng truyền qua Mối quan hệ giữa các đại lượng có thể được xác định thông qua biểu thức di = -k.i.dx.

Biến đổi toán học ta thu được biểu thức của định luật Lambert:

I I e  Cùng với định luật Lambert, định luật Beer được đưa ra đã giải thích cho sự phụ thuộc của nồng độ chất phân tích C vào độ hấp thụ A:

Định luật cho thấy mối quan hệ tuyến tính giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch, là cơ sở cho phương pháp phân tích định lượng trắc quang phân tử Hình 2.13 minh họa đường chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thụ A vào nồng độ C, đồng thời hướng dẫn cách xác định nồng độ Cx từ giá trị Ax của mẫu cần phân tích.

Hình 2.13 Đường chuẩn sự phụ thuộc của độ hấp thụ A vào nồng độ C và cách xác định nồng độ C x từ A x của mẫu cần phân tích.

2.5.3 Phương pháp phân tích HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích được phát triển từ những năm 1967-1968, cải tiến từ sắc ký cổ điển, với khả năng tách chiết, nhận biết và định lượng các chất phân tích nhờ độ nhạy cao và khả năng phân tích định lượng tốt Thiết bị HPLC gồm cổng lấy mẫu, bơm và đầu dò, trong đó cổng lấy mẫu đưa hỗn hợp mẫu vào pha động để đi qua cột, bơm đảm bảo tốc độ dòng và ổn định thành phần pha động, còn đầu dò tạo tín hiệu tương ứng với lượng mẫu ra khỏi cột, cho phép phân tích định lượng Hệ thống điều khiển bằng vi xử lý và phần mềm cung cấp dữ liệu phân tích, trong khi một số bơm cơ học có khả năng trộn nhiều dung môi theo tỉ lệ thay đổi, tạo ra gradient nồng độ trong pha động.

Hình 2.14 Sơ đồ cấu tạo của một hệ sắc kí lỏng hiệu năng cao.

HPLC được chia thành 4 loại dựa trên cơ chế tách chiết: sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký ion và sắc ký rây phân tử Pha tĩnh đóng vai trò quan trọng trong quá trình sắc ký, với mỗi loại sắc ký sử dụng một loại pha tĩnh riêng, như chất hấp phụ cho sắc ký hấp phụ, chất trao đổi ion cho sắc ký ion, và các chất lỏng cho sắc ký phân bố Để tách chất phân tích, cần có pha động để vận chuyển các cơ chất đến pha tĩnh Hiệu quả của quá trình tách chiết phụ thuộc vào các tương tác giữa chất phân tích với pha động, pha tĩnh và giữa pha động với pha tĩnh.

Hình 2.15 Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải.

Tổng hợp của ba lực tương tác F1, F2 và F3 quyết định thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột, với F1 là lực giữ chất phân tích lại trên cột và F2 là lực kéo của pha động Trong đó, F1 và F2 đóng vai trò quyết định, trong khi F3 có ảnh hưởng không đáng kể Sự khác biệt về F1 và F2 giữa các chất dẫn đến tốc độ di chuyển khác nhau trong cột, từ đó tạo ra sự tách biệt giữa các chất khi ra khỏi cột.

Hình 2.16 Quá trình rửa giải và tách píc của chất A và chất B.

2.5.4 Phương pháp đo phổ tổng trở điện hóa

Phương pháp phân tích phổ tổng trở điện hóa (EIS) là công cụ mạnh mẽ trong nghiên cứu các hiện tượng hóa lý ở bề mặt rắn-lỏng và ngày càng trở nên phổ biến trong các ứng dụng như pin điện hóa, pin nhiên liệu, lớp phủ hữu cơ, vật liệu gốm sứ, bán dẫn, sensor và polyme dẫn điện EIS xác định sự phụ thuộc của tổng trở theo tần số, thường được khảo sát trong vùng tần số từ vài trăm mHz đến hàng chục MHz, thậm chí GHz, tùy thuộc vào đối tượng và mục đích nghiên cứu Đối với các vật liệu dẫn ion và quá trình điện hóa, phép đo EIS chỉ phù hợp với dải tần số thấp, cho phép các ion có độ linh động thấp đáp ứng kịp thời với biến đổi điện trường.

Phương pháp phân tích EIS là một kỹ thuật nghiên cứu dựa trên việc so sánh các đặc tính điện xoay chiều của hệ thống với các mạch tương đương Để xác định các tham số như độ dẫn điện, quá trình dịch chuyển điện tích và hệ số khuếch tán của ion trong vật liệu, cần dựa vào mối liên hệ giữa chúng với các thành phần điện trở và tụ điện trong sơ đồ mạch tương đương Các thành phần này bao gồm điện trở dung dịch, điện dung lớp kép, trở kháng Warburg và điện trở truyền điện tích.

Hình 2.17 Sơ đồ mạch điện tương đương Randles của hệ điện hóa

Bất kỳ hệ điện hóa nào cũng có thể được mô tả bằng sơ đồ mạch điện tương đương gồm các điện trở và tụ điện, trong đó mạch tương đương Randles là phổ biến cho hệ điện hóa 3 điện cực Các đại lượng RS và ZW phản ánh tính chất của dung dịch điện phân và sự khuếch tán của cặp chất dò, trong khi Cdl và RCT liên quan đến tính chất cách điện và dẫn điện tại bề mặt tiếp xúc giữa điện cực và chất điện phân Giá trị của Cdl và RCT thay đổi theo sự biến đổi trên bề mặt điện cực, do đó chúng thường được sử dụng làm tín hiệu phát hiện trong cảm biến Phổ EIS bao gồm một bán cung ở tần số cao thể hiện quá trình truyền điện tích trên bề mặt điện cực và phần tuyến tính ở tần số thấp liên quan đến quá trình khuếch tán của chất điện ly Giao điểm của bán cung với trục Zre cho giá trị RS, trong khi đường kính của bán cung biểu thị điện trở RCT trong mạch Randles Hình 2.18 minh họa đường cong Nyquist của phổ EIS cho cảm biến faradaic sử dụng cặp chất dò ferro/ferrit.

Hình 2.18 Đường cong Nyquist của đặc trưng phổ EIS của cảm biến faradaic.

Trong chương này, tác giả trình bày quy trình công nghệ chế tạo cảm biến MIP/EIS và quy trình phân tích dư lượng kháng sinh trong mẫu thực Tác giả đã chọn nghiên cứu các phân tử nhỏ như protein, kháng nguyên và kháng sinh nhằm nâng cao độ nhạy, độ chọn lọc và giới hạn phát hiện của cảm biến Các kỹ thuật kết hợp được sử dụng để tối ưu hóa hiệu suất cảm biến MIP/EIS đã được phân tích chi tiết Bên cạnh đó, các phương pháp nghiên cứu như phân tích phổ Raman, UV-vis, HPLC và đo phổ tổng trở EIS cũng được giới thiệu ngắn gọn trong chương.

CẢM BIẾN MIP/EIS PHÁT HIỆN PROTEIN PHÂN TỬ NHỎ

Cảm biến Sarcosine-MIP/EIS

3.1.1 Ảnh hưởng của vật liệu đế lên sự hình thành màng polyme MIP Để nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu làm điện cực lên chất lượng cũng như độ nhạy của của cảm biến, hai loại điện cực mực in các bon được biến tính hạt vàng (AuNPs-SPCE) và mực in vàng (SPAuE) đã được sử dụng trong nghiên cứu Khác biệt lớn nhất giữa hai loại cảm biến là hình thái bề mặt của màng polyme MIP được hình thành trên điện cực.

Hình 3.1 trình bày các ảnh SEM của điện cực SPAuE và SPCE sau khi biến tính màng MIP, cho thấy sự khác biệt trong cấu trúc bề mặt Đồng thời, đặc trưng dòng-thế của quá trình polyme hóa trên điện cực SPAuE và SPCE cũng được thể hiện, minh họa sự thay đổi trong tính chất điện hóa của các điện cực sau khi xử lý.

Sự khác biệt giữa hai loại màng polyme MIP trên các điện cực SPAuE và AuNPs-SPCE được thể hiện rõ qua hình ảnh SEM, với bề mặt của điện cực SPAuE thô ráp và có các cụm hạt polyme micromet, trong khi màng trên điện cực AuNPs-SPCE lại mỏng và đồng đều Kết quả cho thấy tốc độ polymer hóa trên điện cực SPAuE nhanh hơn nhiều so với AuNPs-SPCE, điều này được xác nhận qua đồ thị tín hiệu điện I/V Sự khác biệt này rõ ràng ở vòng quét CV thứ hai, khi đỉnh oxi hóa trên điện cực SPAuE giảm mạnh và phẳng dần, cho thấy một lớp màng dày đã hình thành, làm giảm tính dẫn điện Ngược lại, trên điện cực AuNPs-SPCE, cường độ dòng tại đỉnh oxi hóa giảm chậm và vẫn quan sát được đến vòng quét thứ 15, cho thấy quá trình polymer hóa diễn ra từ từ và tạo ra màng mỏng đồng đều Các nghiên cứu trước đây về quá trình tổng hợp màng polyme aniline trong môi trường axit đã chỉ ra rằng quá trình oxi hóa monome không đơn giản, bắt đầu với tốc độ chậm và sau đó chuyển sang giai đoạn phát triển nhanh của chuỗi polyme, với bậc phản ứng của chất oxi hóa trong giai đoạn đầu là bậc một.

−d[An]/dt=k 1 [An][Ox]+k 2 σ[An]S

[An] là nồng độ mol phân tử của aniline;

[Ox] là nồng độ mol phân tử của chất oxi hóa;

Diện tích bề mặt môi trường phản ứng, ký hiệu là S, đóng vai trò quan trọng trong quá trình polymer hóa Hệ số bề mặt σ ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng, trong khi k1 là hằng số tốc độ cho bước khởi đầu của quá trình polymer hóa (bước induction) Bên cạnh đó, k2 là hằng số tốc độ cho bước phát triển mạch polymer, quyết định tốc độ hình thành sản phẩm cuối cùng.

Các nhóm chức đầu cuối đã kích hoạt của chuỗi p-ATP được tạo ra bởi các chất oxi hóa, với proton trong môi trường pH 6,8 Trong giai đoạn đầu, các nhóm chức amino của monomer p-ATP bị oxi hóa, nhưng các nhóm chức amino đầu cuối của các oligomer dễ bị oxi hóa hơn do điện áp oxi hóa thấp hơn Hằng số tốc độ k2 của quá trình phát triển mạch polyme lớn gấp nghìn lần so với hằng số tốc độ k1 của quá trình polyme hóa ban đầu, cho thấy sự tăng tốc đáng kể trong quá trình hình thành chuỗi oligomeric Chuỗi p-ATP hình thành nhanh chóng trên nền SPAuE nhờ vào lượng lớn monomer ATP được kích hoạt trên diện tích bề mặt điện tử lớn Khi các chuỗi oligomer hình thành, quá trình phát triển mạch được tăng tốc nhanh chóng, làm thay đổi độ dày lớp polyme trên bề mặt điện cực vàng Trên nền điện cực AuNPs-SPCE, quá trình phát triển mạch diễn ra nhẹ nhàng hơn do hệ số bề mặt S là tập hợp các giá trị rời rạc trên bề mặt hạt vàng, và cường độ dòng kích thích giảm do độ dẫn điện thấp của lớp carbon, dẫn đến sự phát triển chậm của màng p-ATP, bao phủ toàn bộ bề mặt các hạt vàng.

Hình thái bề mặt của các màng polyme tổng hợp có ảnh hưởng đáng kể đến độ nhạy của cảm biến, vì nó quyết định số lượng hốc nhận dạng được hình thành trên bề mặt tương tác sau quá trình tách loại mẫu.

Hiệu suất tách loại phụ thuộc vào độ dày và độ đồng đều của màng polyme Nếu quá trình tổng hợp màng polyme không được kiểm soát, các khối cầu polyme thô ráp trên điện cực SPAuE có thể tạo ra rào cản, cản trở việc tách loại mẫu và vận chuyển các phân tử Sarcosine Ngược lại, quá trình tách loại-tái liên kết trên điện cực MIP/AuNPs-SPCE diễn ra dễ dàng hơn Việc phân tán đồng đều hạt vàng trên điện cực carbon tăng diện tích hiệu dụng của màng MIP, từ đó nâng cao số vị trí in phân tử và hiệu quả hoạt động của cảm biến Giả thiết này được xác nhận qua việc so sánh kết quả hoạt động của cảm biến SPAuE và AuNPs/SPCE thông qua phép đo EIS.

Quá trình chế tạo màng NIP trên điện cực SPCE và SPAuE tương tự như quy trình tạo màng MIP, với sự bổ sung các chất phân tích vào quá trình tạo màng polyme Hai đồ thị điện áp cho thấy chỉ một đỉnh khử duy nhất tại điện áp +200 mV so với điện cực Ag/AgCl, cho thấy quá trình polyme hóa các phân tử p-ATP Kết quả này chứng minh rằng sarcosine không tham gia vào quá trình polyme hóa và cấu trúc của nó vẫn được bảo toàn.

3.1.2 Phân tích đặc tính điện hóa của cảm biến qua các bước trong quy trình công nghệ

Hình 3.2 Phổ EIS của cảm biến MIP/AuNPs-SPCE sau các bước biến tính.

Phương pháp EIS được áp dụng để khảo sát đặc tính điện hóa của điện cực thông qua dung dịch Fe(CN6) 3− /Fe(CN6) 4−, đóng vai trò như cặp đầu dò oxi hóa khử Đây là công cụ hiệu quả để quan trắc các đặc tính bề mặt điện cực sau biến tính Phổ tổng trở bao gồm hai phần: phần bán cung ở tần số cao liên quan đến động học của hạt mang điện trên bề mặt điện cực và phần tuyến tính ở tần số thấp liên quan đến quá trình khuếch tán Đường kính của bán cung phản ánh điện trở truyền điện, chịu ảnh hưởng bởi tính chất dẫn điện của dung dịch và bề mặt điện cực Nghiên cứu này sử dụng mặt phẳng tọa độ Nyquist để đánh giá sự thay đổi điện trở trao đổi tại bề mặt cảm biến sau quá trình chế tạo, đồng thời khảo sát sự thay đổi điện trở trao đổi điện tích sau khi các phân tử sarcosine tái liên kết với các hốc nhận diện ở nồng độ sarcosine khác nhau.

Biểu đồ Nyquist của phổ EIS cho thấy sự thay đổi đáng kể trong giá trị RCT của điện cực carbon trong quá trình chế tạo cảm biến MIP Ban đầu, RCT của điện cực carbon là hơn 6 kΩ, cho thấy tính dẫn điện thấp Sau khi phủ hạt vàng, giá trị RCT giảm mạnh xuống còn 200 Ω, nhờ vào lớp hạt vàng đồng đều đã tăng cường diện tích trao đổi điện tích và hoạt tính xúc tác Hạt vàng hoạt động như hồ chứa điện tử, gia tăng mật độ hạt mang điện và cải thiện khả năng trao đổi điện tích Sản phẩm từ quá trình điện phân cũng kích hoạt oxi hóa các hạt vàng, làm giảm tổng trở bề mặt Tuy nhiên, khi màng poly-amino thiophenol hình thành, RCT tăng lên gần 1 kΩ, nhưng vẫn thấp hơn nhiều so với điện cực ban đầu nhờ vào tính dẫn điện của màng p-ATP Màng polyme MIP mỏng giúp loại bỏ dễ dàng các phân tử sarcosine, chứng minh rằng các hốc nhận diện đã được hình thành, tạo điều kiện thuận lợi cho việc truyền điện tích và khuếch tán.

Bảng 3.1 Giá trị các thành phần trong mạch tương đương Randles của cảm biến MIP/ AuNPs/SPCE sau mỗi bước biến tính.

Các thành phần trong mạch tương đương Randles

Điện trở truyền điện tích của điện cực đã được biến tính bằng màng polyme MIP vẫn nhỏ hơn so với điện trở trao đổi của điện cực ban đầu nhờ tính dẫn điện của màng p-ATP Khi sarcosine được loại bỏ, đường kính bán cung giảm xuống và số điểm trên đường tuyến tính tăng lên, cho thấy sự hình thành nhiều hốc nhận dạng sarcosine trong màng polyme Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình trao đổi điện tích và khuếch tán cặp oxi hóa khử Khi điện cực biến tính tiếp xúc với dung dịch chứa sarcosine, sarcosine sẽ liên kết với các vị trí trong hốc, nhờ lực liên kết hydro, làm cản trở quá trình trao đổi điện tích và vận chuyển khối của cặp ferro/ferrit, dẫn đến tăng điện trở trao đổi khi nồng độ sarcosine tăng lên.

Quan sát sự thay đổi của giá trị Cdl sau các bước biến đổi cho thấy quy luật thay đổi này phù hợp với lý thuyết về lớp điện tích kép Giá trị ZC tỉ lệ nghịch với giá trị tụ điện C và phụ thuộc vào điện tích trên bề mặt điện cực Với điện cực ban đầu, do lớp carbon dẫn điện kém, giá trị Cdl khá nhỏ do mật độ hạt trên bề mặt điện tích thấp Tuy nhiên, sau khi phủ hạt vàng, giá trị Cdl tăng lên đáng kể nhờ các hạt vàng hoạt động như hồ chứa điện tử Ở các bước biến tính tiếp theo, quy luật tăng giảm của Cdl ngược lại so với RCT Kết quả tương tự cũng được ghi nhận khi khảo sát hoạt động của cảm biến MIP/AuNPs/SPCE, trong khi cảm biến MIP/SPAuE không cho thấy hiện tượng này, có thể do đặc tính hình thái học bề mặt của màng MIP trên SPAuE không đồng đều như trên SPCE Cuối cùng, bằng cách tính toán sự thay đổi của RCT tương ứng với các nồng độ sarcosine khác nhau, chúng ta có thể xác định nồng độ sarcosine thông qua đường cong chuẩn hóa của RCT.

Bảng 3.2 Giá trị các thành phần trong mạch tương đương Randles của cảm biến sarcosine-MIP/SPAuE và NIP/SPAuE

Các thành phần trong mạch tương đương Randles sarcosine-MIP (15 CVs)/SPAuE NIP (15 CVs)/SPAuE

RCT (k) Cdl (àF) RCT (k) Cdl (àF)

3.1.3 Khảo sát hoạt động của cảm biến sarcosine-MIP/SPAuE

Để khảo sát đặc tính của cảm biến sarcosine-MIP sử dụng điện cực SPAuE, màng polyme MIP được hình thành trên bề mặt điện cực với các vòng quét polyme khác nhau là 5, 7 và 15 vòng Cảm biến được thử nghiệm với các nồng độ sarcosine từ 1 ng/mL đến 2,6 àg/mL nhằm xác định điều kiện hoạt động tối ưu Đồ thị Nyquist của các phổ tổng trở tương ứng với các nồng độ khác nhau được trình bày trong hình 3.3, cùng với giá trị các thành phần trong phổ trở kháng được mô tả trong bảng 3.3.

Hình 3.3 trình bày phổ EIS của cảm biến sarcosine-MIP (15 CVs)/SPAuE tại các nồng độ khác nhau sau khi biến tính Bên cạnh đó, đường đặc trưng chuẩn của cảm biến sarcosine-MIP/SPAuE và NIP/SPAuE cũng được thể hiện rõ ràng.

Bảng 3.1 Giá trị các thành phần trong mạch tương đương Randles của cảm biến sarcosine-MIP (7 CVs)/SPAuE và sarcosine-MIP (5 CVs)/SPAuE.

Các thành phần trong mạch tương đương Randles sarcosine-MIP (7 CVs)/SPAuE sarcosine-MIP (5 CVs)/SPAuE

RCT (k) Cdl (àF) RCT (k) Cdl (àF)

Đường cong chuẩn hóa của cảm biến sarcosine-MIP (15 CVs) được hiển thị trong Hình 3.3b, thể hiện mối liên hệ giữa giá trị RCT và logarith của nồng độ sarcosine sau quá trình tái liên kết trên bề mặt màng MIP Phần bán cung cho thấy đặc tính cản trở trao đổi điện tích của bề mặt điện cực với các đầu dò oxi hóa khử.

Cảm biến 17-estradiol (E2)

3.2.1 Khảo sát hình thái màng E2-MIP bằng phương pháp chụp ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) Để nghiên cứu ảnh hưởng của đế đối với sự phát triển của màng polyme MIP và độ nhạy của cảm biến E2- MIP, hai loại điện cực là SPAuE và SPCE biến tính AuNPs đã được sử dụng Màng NIP được tạo thành trên điện cực AuNPs-SPCE. Sau 20 vòng quét mạ điện và loại bỏ phân tử chất in, có thể dễ dàng nhìn thấy sự khác biệt lớn về hình thái của E2-MIP/ SPAuE và E2-MIP/AuNPs-SPCE trong ảnh SEM (hình 3.12).

Hình 3.12 Ảnh SEM của E2-MIPs tạo thành trên SPAuE và AuNPs-SPCE, cũng như màng

NIP tạo thành AuNPs-SPCE

Các hạt p-ATP có kích thước micromet được hình thành trên đế SPAuE, trong khi polyme tạo lớp mỏng trên đế AuNPs-SPCE Hình ảnh SEM cho thấy các điểm sáng xuất hiện trên cả hai điện cực E2-(MIP-Au)composite/AuNPs-SPCE và (NIP-Au)composite/AuNPs-SPCE với kích thước hàng chục nanomet Phân tích EDS cho thấy các điểm sáng đó là hạt Au, chứng tỏ Au đã bị khử trong quá trình trùng hợp và được nhúng vào polyme Sự khác biệt giữa màng MIP và NIP cũng được ghi nhận: màng NIP mịn và sắp xếp chặt chẽ hơn, trong khi MIP mềm hơn và có xu hướng mở rộng Phát hiện này cho thấy các phân tử E2 đã được in lên màng polyme và sau khi loại bỏ, bề mặt còn lại các lỗ trống cho phép cư trú của các phân tử phân tích.

3.2.2 Khảo sát hoạt động của cảm biến E2-MIP/EIS

Cảm biến E2-MIP được đánh giá thông qua các phép đo trở kháng faradaic tương tự như cảm biến sarcosine-MIP Các loại cảm biến bao gồm E2-MIP/AuNPs-SPCE và E2-(MIP-Au)composite/AuNPs-SPCE.

(NIP-Au)composite/AuNPs-SPCE được tiếp xúc với nồng độ E2 khác nhau, từ

Biểu đồ Nyquist cho các phép đo trở kháng faradaic liên quan đến E2 ở các nồng độ khác nhau từ 1 fM đến 100 nM được trình bày cho bốn loại cảm biến: a) E2-MIP/AuNPs-SPCE, b) E2-(MIP-Au)composite/AuNPs-SPCE, c) Đường cong đáp ứng của (NIP-Au)composite/AuNPs-SPCE và d) biểu đồ ΔR CT theo hàm logarit của nồng độ E2 cho cảm biến sinh học dựa trên E2-MIP được chế tạo.

Đồ thị Nyquist của phổ trở kháng của các cảm biến MIP và NIP trước và sau khi liên kết E2 cho thấy rằng đường kính hình bán nguyệt Nyquist, tương ứng với điện trở truyền điện tử RCT, tăng hệ thống khi nồng độ E2 tăng ở cảm biến E2-MIP/AuNPs-SPCE và E2-(MIP-Au)composite/AuNPs-SPCE Sự gia tăng này là do liên kết của các phân tử E2 với các hốc nhận biết, dẫn đến việc hình thành lớp phân tử E2 cản trở sự truyền điện tử và làm tăng điện trở truyền điện tử Ngược lại, ở cảm biến NIP, sự gia tăng này là không đáng kể do không có đầu thu MIP của E2 trên bề mặt cảm biến, vì vậy không xảy ra liên kết lại của các phân tử E2 Kết quả này nhấn mạnh rằng sự khác biệt trở kháng của cảm biến MIP không liên quan đến sự hấp thụ vật lý của các phân tử E2 vào màng MIP.

Các đường chuẩn của cảm biến được biểu diễn qua sự gia tăng của RCT theo lôgarit nồng độ E2, cho thấy phạm vi tuyến tính kéo dài từ 10 fM đến 100 nM Cảm biến E2-(MIP-Au)composite/AuNPs-SPCE có sự thay đổi RCT lớn hơn 3 lần so với E2-MIP/AuNPs-SPCE, chứng tỏ rằng việc pha tạp hạt nano Au vào mạng polyme cải thiện độ nhạy của cảm biến Đường chuẩn của cảm biến này được mô tả bằng công thức ΔRCT (k) = 34 + 2,2 * C (mol/L) với hệ số R² = 0,993, cho thấy tính tuyến tính cao Giới hạn phát hiện (LoD) của cảm biến đối với E2 trong chất lỏng là 2 fM với diện tích điện cực nhạy là 2,64 mm² Sự thay đổi RCT nhỏ ở NIP khẳng định rằng sự thay đổi này là do liên kết E2 với MIP, không phải do hấp thụ vật lý.

3.2.3 Khảo sát đặc tính chọn lọc của cảm biến E2-MIP

Các phép đo tham chiếu đã được thực hiện với estriol, testosterone, stigmasterol và cholesterol nhằm đánh giá tính chọn lọc của cảm biến E2-MIP Những phân tử này được lựa chọn vì cấu trúc và trọng lượng phân tử tương tự E2, phù hợp cho thử nghiệm chọn lọc chéo Kết quả cho thấy cảm biến E2-(MIP-Au)composite/AuNPs-SPCE có tín hiệu cao hơn khi tiếp xúc với E2 so với các phân tử khác, chứng tỏ độ chọn lọc cao của cảm biến.

Hình 3.14 Tính chọn lọc của cảm biến sinh học dựa trên MIP được chế tạo cho các chất phân tích khác nhau.

Hai loại cảm biến sarcosine-MIP/EIS và E2-MIP/EIS đã được phát triển thành công, đạt độ nhạy và độ chọn lọc cần thiết cho việc chẩn đoán bệnh sớm và đảm bảo an toàn thực phẩm Các nghiên cứu đã chỉ ra hiệu quả của chúng trong các ứng dụng này.

Hạt vàng được phân tán trên bề mặt điện cực SPCE thông qua phương pháp CV, tạo ra lớp truyền dẫn mỏng nhạy bén cho cảm biến MIP Quá trình này được thực hiện bằng cách điện hóa kết tủa trong khoảng điện áp từ -600 mV đến +500 mV so với Ag/AgCl, giúp hình thành hạt vàng với mật độ, kích thước và hình dạng đồng đều trên bề mặt SPCE.

Sự khác biệt về tính chất dẫn điện giữa điện cực dẫn đến quá trình tổng hợp màng polyme MIP trên SPAuE và AuNPs-SPCE diễn ra với tốc độ khác nhau Cường độ dòng điện thấp qua AuNPs-SPCE khiến màng polyme phát triển chậm rãi, từ giai đoạn polyme hóa ban đầu đến khi bao phủ lớp mỏng trên bề mặt hạt nano vàng Ngược lại, độ dẫn điện cao hơn nhiều lần của SPAuE làm tăng tốc độ phát triển polyme, dẫn đến hình thành màng polyme dày và không đồng đều Do đó, tính đồng nhất của màng polyme MIP tổng hợp trên AuNPs-SPCE tốt hơn so với trên điện cực SPAuE.

Mật độ hạt nano vàng trên điện cực SPCE ảnh hưởng đáng kể đến độ nhạy của cảm biến Nghiên cứu cho thấy cảm biến sarcosine-MIP/AuNPs-SPCE đạt độ nhạy tối ưu khi lớp hạt vàng được hình thành qua 20 vòng quét, với % ∆RCT vượt quá 90%, cao hơn so với 51,9% và 66,1% ở 15 và 10 vòng quét.

Bề dày của màng polyme MIP ở điều kiện 15 vòng quét trên điện cực AuNPs

Trong nghiên cứu, điện cực SPCE với 20 CVs đạt tín hiệu cao nhất, với %RCT là 93,3%, vượt trội so với 89,4% và 89,5% của 7 và 20 vòng quét tổng hợp màng polyme MIP Kết quả cho thấy, điều kiện tối ưu để tạo lớp hạt nano vàng trên điện cực SPCE là 20 vòng quét, trong khi 15 vòng quét là đủ để tạo màng polyme MIP trên điện cực AuNPs-SPCE, mang lại độ nhạy tối ưu cho cảm biến.

Cảm biến sarcosine-MIP/AuNPs-SPCE thể hiện hiệu suất vượt trội với dải tuyến tính rộng từ 1 ng/mL đến 1,6 àg/mL và độ dốc trung bình 0,359 Trong khi đó, cảm biến sarcosine-MIP/SPAuE có độ dốc cao hơn nhưng chỉ hoạt động hiệu quả trong dải tuyến tính hẹp từ 1 ng/mL đến 600 ng/mL, và bị bão hòa ở nồng độ trên 600 ng/mL Kết quả cho thấy cảm biến sarcosine-MIP/AuNPs-SPCE hoạt động tốt hơn trong các nồng độ thấp.

Khảo sát cảm biến E2-MIP/EIS cho thấy giới hạn phát hiện (LoD) đạt 2 fM với diện tích điện cực 2,64 mm², trong khi dải làm việc tuyến tính của cảm biến nằm trong khoảng từ 10 fM đến 100 nM Những thông số này chứng tỏ cảm biến hoàn toàn phù hợp cho việc sử dụng trong các mẫu thực.

CẢM BIẾN MIP/EIS PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN ENROFLOXACIN

CẢM BIẾN MIP/EIS PHÁT HIỆN KHÁNG SINH TRONG NƯỚC HỒ NUÔI THUỶ SẢN, DƯỢC PHẨM