Cùng với sự phát triển của xã hội, sự phát triển không ngừng của mạng Internet, công cụ tin sinh học cũng được kết hợp với sinh học phân tử được các nhà nghiên cứu áp dụng để góp phần đị
TỔNG QUAN
Đặc điểm
Hình 1 1 Nấm Cordyceps sinensis ( đông trùng hạ thảo trong tự nhiên)
Chi nấm này có sự phân bố rộng khắp thế giới và phần lớn trong số khoảng 400 loài [37] sinh sống chủ yếu tại châu Á (đáng chú ý là Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Việt Nam và Thái Lan).Theo Kobayasi 1941, 1982 đã chia Cordyceps S.L thành 3 chi phụ (subgenera) và 7 nhóm nhỏ (subsection) dựa vào đặc điểm hình thái giải phẫu [27],[28]
Cordyceps là một chi nấm ký sinh côn trùng [28],[34] Những giá trị về mặt y dược của chi nấm này ngày càng được các nhà khoa học nghiên cứu và khẳng định Đại diện chi Cordyceps phải kể đến Cordyceps sinensis, hay còn gọi là đông trùng hạ thảo Là một loại dược liệu được tìm thấy vào mùa hè ở vùng núi cao trên 4.000-5.000m ở cao nguyên Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc, Vân Nam [1] Những lợi ích bất ngờ của đông trùng hạ thảo ở Trung Quốc đã được biết đến ít nhất 1000 năm, đây là nơi nấm được công nhận là một loại thuốc quý hiếm, một kho báu của quốc gia [18]
5 Đông trùng hạ thảo là một loại đông dược quý là dạng ký sinh của nấm Cordyceps sinensis, là kết quả của sự kết hợp giữa động vật và thực vật Chu trình sống của đông trùng hạ thảo gồm 2 giai đoạn: mùa đông, nấm ký sinh vào côn trùng, phát triển thành hệ sợi nấm ( giai đoạn vô tính), sử dụng nguồn dinh dưỡng từ côn trùng và giết chết côn trùng; mùa hạ, sợi nấm vô tính chuyển sang giai đoạn hữu tính, hình thành cây nấm là cơ quan chứa bào tử vô tính và nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu Đó cũng là ý nghĩa của cái tên “ đông trùng hạ thảo”.
Phân loại khoa học
Các hoạt chất trong Cordyceps và ứng dụng
Cùng với sự phát triển của xã hội, nhu cầu chăm sóc sức khỏe của con người ngày càng cao thì giá trị của những cây thuốc tự nhiên ngày càng được quan tâm, để tìm ra những vị thuốc giúp chăm sóc sức khỏe, giá thành phải chăng nhưng vẫn đảm bảo chất lượng cho người sử dụng, áp lực để tìm ra một loại thuốc mới có lẽ khó khăn hơn nhiều so với việc khai thác, kế thừa tối đa những giá trị của những loài thuốc đã được lưu truyền thời xa xưa Có thể nói ở thời đại hiện tại, chi Cordyceps cũng trở thành đối tượng cho những nghiên cứu và ứng dụng vì những hoạt chất cực kỳ có lợi của nó Đa số những loài trong chi Cordyceps luôn có những dược tính có lợi cho sức khỏe con người Một vài loài trong chi Cordyceps là các nguồn hóa chất sinh học với các tính chất sinh học
6 và dược học thú vị [21] , như cordycepin; dạng sinh sản vô tính của Cordyceps subsessilis
(Tolypocladium inflatum) là nguồn của cyclosporin — một loại dược chất hữu ích trong cấy ghép các bộ phận của cơ thể người, do nó kìm hãm hệ miễn dịch (thuốc ngăn chặn miễn dịch) [20]
Cụ thể, Cordyceps sinensis- một loài nấm có giá trị dinh dưỡng cao ở Trung Quốc được sử dụng như một loại thực phẩm bổ dưỡng, một loại cây dược liệu [46] Cordyceps sinensis đã được thị trường hóa dưới dạng chất bổ sung dinh dưỡng dưới sự kiểm soát của FDA, do vậy nhu cầu thị trường đối với đông trùng hạ thảo ngày càng tăng cao ở nhiều quốc gia [14] C.sinenis có thể chống ung thư, chống lão hóa, có khả năng bồi bổ và tăng cường sức khỏe, cải thiện đời sống tình dục, tăng cường khả năng miễn dịch, cũng có tác dụng tốt đối với trẻ em chậm lớn
C.militaris có nhiều lợi ích y trong y học như: hỗ trợ tình dục, kháng viêm, chống oxy hóa, chống lão hóa, kháng khối u, chống ung thư, điều hòa hệ miễn dịch, chống vi khuẩn, vi-rút, chống xơ hóa, hạ đường huyết, chống tiểu đường, chống sốt rét, trị mệt mỏi, bảo vệ thần kinh, bảo vệ gan, … [13] Tại Việt Nam, các chủng được nuôi cấy nhiều nhất thuộc loài Cordyceps militaris, cấy trên cơ chất hoặc vào nhộng tằm Quả thể khô của loài này cho hàm lượng cordycepin và adenosine cao (thậm chí hơn loài C.sinensis) Các nhóm hợp chất quan trọng cô lập bao gồm; nucleoside, sterol flavonoid, peptit mạch vòng, phenolic, bioxanthracenes, polyketide và alkaloid Các peptit mạch vòng chiếm một tỷ lệ lớn trong các hợp chất được phân lập từ chi Cordyceps [33]
1.3.1 Nucleoside và bazo của nó
Nucleoside là một trong hai nhóm thành phần hiện diện chính trong chi
Cordyceps [10] Sự hiện diện của các nucleoside đã đem đến cho các loài chi Cordyceps những hoạt tính sinh học có giá trị cao Nucleoside quan trọng và phong phú được tìm thấy trong chi Cordyceps chính là Cordycepin, nó cũng thể hiện phạm vi hoạt tính sinh học rộng [12] Ngoài ra, một số nucleoside khác cũng được thu nhận từ Cordyceps như: adenine, adenosin, uracil, uridine, guanidine, guanosine, hypoxanthine, inosine, thymine, thymidine and deoxyuridine [30] Chúng thể hiện khả năng chống ung thư, chống
7 vi-rút, bảo vệ thần kinh, kháng viêm, kháng u và chống oxi-hóa [31] Thường thì nucleoside được báo cáo là phân lập từ các loài thuộc chi Cordyceps như: C sinensis, C.militaris và C.cicadae Nucleosise là một thành phần quan trọng, nhưng không phải là duy nhất để quyết dịnh hoạt tính sinh học của chi nấm này,, mà còn bị ảnh hưởng bới rất nhiều thành phần khác trong Cordyceps
Cùng với nucleoside, peptide vòng cũng là thành phần chính hiện diện trong chi
Cordyceps Lượng polypeptide từ một số loài chi Cordyceps như C sinensis [24] ,
C.cicadae [40] , C.heteropoda [29] và C.indigotica [45],[6] Phần lớn các polypeptit được phân lập này thể hiện khả năng gây độc tế bào và kháng tế bào ung thư
Các loài chi Cordyceps là một nguồn giàu các dạng sterol có hoạt tính sinh học, đặc biệt là hoạt tính kháng khối u Có nhiều dạng sterols hiện diện trong chi Cordyceps này như: 3-sitosterol, campeasterol, daucosterol and 5α,8αepidioxy-24(R)-methyl- cholesta-6,22-dien-3β-D-glucopyranoside [7],[45] Nhưng ergosterol và ergosterol peroxide là hai sterol quan trọng nhất Những loại sterol này thể hiện nhiều đặc tính có ý nghĩa trong y học như: gây độc tế bào, kháng vi-rút, điều hòa tim, ức chế các tế bào trung bì người đã được hoạt hóa [30], [43]
Cordyformamide, tiền chất sinh học di truyền của xanthocillin Y2, được phân lập từ môi trường nuôi cấy của nấm kí sinh côn trùng Cordyceps brunnearubra BCC
1395 [22] Theo Yang đã tách được alkaloid β-carboline trong C sinensis cũng góp phần tạo nên tính kháng viêm của loài nấm này [44]
Polysaccharides cũng là một nhóm hợp chất cũng ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính sinh học của nấm Nhiều loại polysaccharid tổng hợp từ nấm có tác dụng điều hòa hệ miễn dịch, kháng tế bào ung thư, kháng oxy-hóa, hạ đường huyết, chống xơ hóa, chống mệt mỏi, bảo vệ thận và các hoạt động bảo vệ bức xạ [38], [42]
Ngoài những hợp chất đã nêu ở trên ( nucleoside và bazo của nó; peptide vòng; sterol; alkaloid; polysaccharide) thì một số hợp chất khác cũng được tổng hợp từ các loài nấm của chi này Các hợp chất này là các hợp chất là dẫn xuất naphthoquinone [26] , chất chuyển hóa depsidone [39] , chất tương tự cytochalasin [12] , dihydrobenzofurans [5] , bioxanthracenes [23] và isocyanides [22] Chúng có những dược tính nổi trội như: chống lại kí sinh trùng sốt rét (Plasmodium falciparum), vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis), gây độc tế bào cũng như kháng tế bào ung thư
Cordyceps còn có thể sản xuất ra những chất chuyển hóa thứ cấp mang những giá trị ứng dụng trong y học Cụ thể như cyclosporin là một sản phẩm chuyển hóa của Cordycepin được phân lập từ nấm Tolypocladium inflatum(Wenger.et.al., 1984) Nấm này được biết là dạng sinh sản vô tính của nấm Elaphocordyceps subsessilis( Cordyceps subsessilis) (Hodge.et.al.,1996; Sung.et.al.,2007) Cyclosporin A là thuốc ngăn chặn miễn dịch với thành phần dược chất là cyclosporin, có tác dụng ức chế miễn dịch, dùng để điều trị các bệnh như viêm khớp dạng thấp, bệnh vẩy nến, hội chứng thận hư… và đặc biệt dùng trong cấy ghép nội tạng để ngăn chặn thải loại mảnh ghép.
Kỹ thuật PCR và giải trình tự
PCR là viết tắt của Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase) dùng để chỉ một kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại phân tử DNA hay đoạn phân tử DNA ngoài cơ thể sống, làm tăng số lượng DNA ban đầu lên đến số lượng mong muốn (Campbell và cs, năm 2010) PCR do Kary Mullis phát minh ra vào năm 1983, đến nay đã được cải tiến qua nhiều lần nghiên cứu và ngày càng được hoàn thiện PCR là phương pháp có thể xem là phương pháp tối ưu nhất trong thời kỳ mới, tạo ra vô số những bản sao theo cấp số nhân chỉ với lượng DNA ban đầu rất nhỏ
Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt với rất nhiều thành phần: DNA mẫu, mồi, enzyme polymerase, dNTP, dung dịch đệm và MgCl2
PCR là phản ứng chuỗi bao gồm nhiều chu trình nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: biến tính- kéo dài- bắt cặp
PCR đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực của cuộc sống như: phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng tội phạm, nghiên cứu bệnh nhiễm trùng [4] , và đặc biệt là xét nghiệm Covid 19 cũng như giúp sản xuất vacxin chống đại dịch này
Giải trình tự DNA được xem là quá trình xác định trình tự nucleotide cấu tạo nên phân tử DNA Phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học (Alan Maxam và Walter Gilbert) và phương pháp giải trình tự gen bằng enzyme (Sanger) là hai phương pháp đã đánh dấu bước ngoặt lớn trong lịch sử phát triển của bộ môn sinh học hiện đại Ngày nay, rất nhiều máy giải trình tự gen tự động đều dựa trên nguyên tắc chính là phương pháp giải trình tự gen của Sanger
Nguyên tắc của phương pháp Sanger là sử dụng các dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP) để dừng phản ứng kéo dài mạch của DNA polymerase vì ddNTP không chứa nhóm 3’-OH dùng để tạo liên kết với nucleotide kế tiếp [2]
Nghiên cứu phát sinh loài
1.5.1 Định danh phân tử Định danh phân tử là phương pháp so sánh sự khác biệt trình tự nucleotide và axit amin trong di truyền phân tử ( DNA, RNA, protein) để phân loại, xác định mối quan hệ của sinh vật ở mức độ phân tử Vì vậy, việc lựa chọn vùng trình tự của phân tử DNA, RNA, protein thật sự quan trọng, các trình tự này phải vừa đảm bảo tính bảo tồn cao trong cùng một loài nhưng vẫn thể hiện được sự biến động lớn giữa các loài khác nhau Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu đã tập trung vào các gen giữ nhà (house-
10 keeping gene) để định danh một số loài Định danh phân tử sẽ cho kết quả là một cây phả hệ phân tử, dựa vào nó, người ta có thể phân tích được: giá trị bootstap, sự phân nhóm của các loài để phân tích được mối quan hệ giữa các loài Định danh phân tử kết hợp với định danh hình thái, giải phẫu học sẽ giúp định danh chính xác đối tượng Định danh phân tử sẽ bổ sung, giải quyết những khó khăn của phương pháp định danh hình thái với tốc độ nhanh chóng và chính xác Với những loài gây khó khăn cho định danh hình thái thì định danh phân tử sẽ là một lựa chọn khá tối ưu
1.5.2 Nhóm gen giữ nhà ( house keeping gene) trong định danh phân tử các loài nấm
House keeping gene là gen được biểu hiện thường xuyên ở mức tương đối ổn định, trong điều kiện sinh lý bình thường, mã hóa cho những protein mang chức năng cơ bản của tế bào, cần thiết cho quá trình nuôi dưỡng và duy trì sự sống tế bào Nhờ những vùng gen mang trình tự bảo tồn cao này đã giúp cho quá trình định danh phân tử dựa vào house keeping gene đã được sử dụng nhiều hơn Đối với chi nấm Cordyceps nói riêng, gen nrSSU, nrLSU đã được sử dụng để nghiên cứu phát sinh loài (Smit et al., 1999; Borneman & Hartin, 2000; Schabereiter-Gurtner.et.al.,2001)
1.5.2.1 Vùng gen nrLSU (nuclear ribosomal large subunit)
Hình 1 2 Vị trí của cặp mồi LR0R/LR5 trên vùng gen nrLSU
Gen nrLSU là gen mã hóa cho RNA 25S-28S của ribosome ( 25S-28S chính là tiểu phần lớn của ribosome) chứa nhiều thông tin di truyền mang tính bảo tồn cao, được sử dụng phổ biến do có khả năng thiết kế các cặp mồi phổ quát giúp khuếch đại và giải trình tự vùng gen nrLSU của nhiều loài nấm Các trình tự mã hóa cho rRNA có tính bảo tồn cao nên thích hợp cho các nghiên cứu ở cấp họ hay xa hơn Cặp mồi LR0R/LR5 được sử dụng trong nghiên cứu này để khuếch đại vùng gen nrLSU, cặp mồi này khuếch đại đoạn DNA khoảng 800-1300 bp (Sonnenberg và cộng sự, 2007)
1.5.2.2 Vùng gen nrSSU (nuclear ribosomal small subunit)
Hình 1 3 Vị trí của cặp mồi NS1/NS4 trên vùng gen nrSSU Gen nrSSU là gen mã hóa cho RNA 18S của ribosome (18S là tiểu phần nhỏ của ribosome), đây là vùng gen có tính bảo tồn cao, nhưng tiến hóa tương đối chậm, thường được ứng dụng để nghiên cứu các sinh vật có ít quan hệ về mặt di truyền Vùng này có thể được khuếch đại bằng một cặp mồi phổ quát (universal primer) Cặp mồi được sử dụng là NS1/NS4 mang tính phổ quát khuếch đại vùng gen nrSSU ở nhiều mẫu nấm ký sinh côn trùng
1.5.2.3 Vùng gen RPB1 (largest subunit of RNA polymerase II)
RPB1 (largest subunit of RNA polymerase II – tiểu đơn vị lớn nhất của RNA polymerase II) là vùng gen mã hóa cho tiểu phần lớn nhất của protein RNA polymerase
II Đây là enzyme xúc tác quá trình sao mã RNA từ DNA ở Eukaryote RPB1 có C-
12 terminal domain (CTD) bao gồm khoảng 25 lần lặp lại chuỗi trình tự hetapeptide Tyr1- Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7 [35] , có chức năng quan trọng trong sự hoạt động của enzyme RNA polymerase Năm trong các amino acid có thể bị phosphory hóa, và có hai proline có thể tồn tại ở dạng cis hoặc trans [11],[15] Trong đó Ser ở vị trí thứ 5 phosphoryl hóa bởi hoạt động kinase của TFII, kích hoạt enzyme RNA polymerase II chuyển dịch qua promotor và phiên mã Trong quá trình phiên mã, sự phosphoryl hóa CTD động đóng vai trò là dấu hiệu đánh dấu quá trình của RNA Pol II dọc theo gen, với sự phosphoryl hóa cụ thể tạo ra các vị trí liên kết tại giai đoạn đặc hiệu của phiên mã [8],[9]
Hình 1 4 Cấu trúc vùng gen RPB1 [47]
Hình 1 5 Mô tả chức năng của vùng CTD của gen RPB1(Theo Heidi-2009)
Hình 1 6 Vị trí mồi trên vùng gen RPB1 [47]
RPB1 đã được sử dụng để phân tích phả hệ của các loài động-thực vật, nấm, tảo…Một số công trình nghiên cứu vùng gen này:
Mối quan hệ giữa các loài nấm Leishmania được nghiên cứu dựa trên vùng gen
RPB1 bởi Croan và cs, đã so sánh trình tự gen giữa DNA và RNA polymerase Hirt.et al.,(1999) đã dùng trình tự gen RPB1 để chứng minh Microsporidia (sinh vật hoại sinh hoặc ký sinh) có quan hệ với giới nấm Thêm nữa, Matheny P B (2002, 2004) sử dụng trình tự gen RPB1 kết hợp với RPB2 so sánh trình tự gen nrLSU để cải thiện và mở rộng cây phát sinh loài ở nấm rơm Vào năm 2005, RPB1 được chứng minh hỗ trợ việc phân tích phả hệ chi Cortinarius [16]
Nghiên cứu phát sinh loài [17]
1.6.1 Phả hệ phân tử trong nghiên cứu phát sinh loài Đối với một nhà nghiên cứu sinh học phân tử, cây phả hệ phân tử là đại diện cho mối quan hệ của trình tự gen hoặc trình tự protein với trình tự bậc trên ( tổ tiên của chúng), cây phả hệ phân tử bao gồm những giao điểm kết nối bởi các nhánh Kết quả của quá trình phân tích phân tử được thể hiện qua một cây phả hệ Xây dựng một cây phả hệ phân tử gồm 5 bước cơ bản như sau: xác định được những trình tự tương đồng với trình tự đích quyết định bộ dữ liệu gồm những trình tự đem phân tích tải xuống những trình tự đã được chọn sắp gióng cột trình tự sử dụng kết quả sắp gióng cột để xây dựng một cây phả hệ phân tử
1.6.2 Những bước cơ bản trong nghiên cứu phát sinh loài
1.6.2.1 Xác định những trình tự tương đồng với trình tự đích
Trình tự đích có thể là protein hoặc acid nucleic cụ thể (DNA, RNA), cần xác định những trình tự khác có độ tương đồng cao với trình tự đích, những trình tự này có chung một nguồn gốc Chương trình cho phép tìm kiếm và tải xuống là BLAST của NCBI
1.6.2.2 Quyết định bộ dữ liệu đem đi dựng cây phả hệ
Căn cứ vào kết quả BLAST của NCBI, tiến hành xem xét kết quả của những thông số hiển thị để xem xét đưa một trình tự nào đó vào bộ dữ liệu dựng cây, chẳng hạn như:
“Max score” và “Total score” càng cao thì độ tương đồng giữa trình tự đó với trình tự mục tiêu càng cao; hoặc là khi “Max score” khác biệt với “Total score” thì có nghĩa là một phần trình tự đó có ý nghĩa với trình tự đích
1.6.2.3 Tải xuống bộ dữ liệu gồm những trình tự được chọn
Những trình tự được chọn sẽ được tải xuống từ ngân hàng genbank để tiến hành sắp gióng cột
1.6.2.4 Sắp gióng cột trình tự
Sắp gióng cột là quá trình được thiết kế để đưa các khoảng trống vào trình tự để dịch chuyển bazo trở lại vị trí tương đồng tương ứng của chúng, đồng thời giúp cho dữ liệu đồng hóa về mặt độ dài và trình tự
1.6.2.5 Dựng cây phả hệ phân tử
Có 2 cách tiếp cận chính để dựng cây: theo thuật toán và tìm kiếm cây Phương pháp thuật toán sử dụng một thuật toán để ước tính một cây từ dữ liệu Phương pháp tìm kiếm cây ước tính nhiều cây, sau đó sử dụng một số tiêu chí để quyết định cây tốt nhất hoặc bộ cây tốt nhất ( Tree- Searching Methods, pp 72-73) Phương pháp thuật toán có
2 lợi ích: nhanh và đưa ra một cây bất kỳ.
Tình hình nghiên cứu trong nước
Cordyceps là một đối tượng nghiên cứu cũng gọi là khá mới tại Việt Nam, nhưng trong tương lai hứa hẹn sẽ khai thác được nhiều tiềm năng của chi nấm này Vì là một chi nấm có nguồn gốc từ Trung Quốc, thế nên việc nghiên cứu chi nấm này tại Việt Nam chỉ là mang tính chất điều tra, thu thập dữ liệu cũng như những đặc điểm cụ thể về chi nấm này để tiến hành nhân bản và ứng dụng nó cho phù hợp với điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng tại Việt Nam
Năm 2005, Phạm Thị Vượng (Viện Bảo vệ Thực vật) và Lương Văn Hà (Vườn quốc gia Cúc Phương) cùng với các nhà nghiên cứu nấm thuộc trường đại học Quốc gia Kangwon, Hàn Quốc tiến hành có những nghiên cứu nhóm nấm ký sinh côn trùng tại vườn quốc gia Cúc Phương-Việt Nam Họ sử dụng phương pháp so sánh hình thái giải phẫu để xác định và phân loại loài Kết quả thu nhận được gồm các loài như sau:
Cordyceps sp., C nutans, C pruinosa, C specocephala và Beauveria bassiana, Beauveria sp., Gibellalus sp., Paecilomyces sp [19]
Cũng là nhóm nấm này, nhưng ở vườn quốc gia Cát Tiên, vào năm 2006, các nhà nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng của BIOTEC- Thái Lan, họ thu về 259 mẫu nấm Kết quả sơ bộ bằng định danh hình thái dựa trên hệ thống phân loại mới nhận thấy có tổng
41 loài thuộc 17 chi (Cordyceps, Gibellula, Hirsutella, Hymenostilbe, Hypocrella,
Isaria, Metarhizium, Moelleriella, Nomuraea, Ophiocordyceps, Paecilomyces, Torrubiella và Verticillium, Akanthomyces, Aschersonia, Beauveria, Conoideocrell)
Nhưng chỉ ghi nhận được 1 loài thuộc chi Cordyceps và 2 loài thuộc chi Ophiocordyceps [3]
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
2.1.1 Bộ mẫu nấm ký sinh côn trùng
Các mẫu nấm ký sinh côn trùng được thu nhận từ vùng núi Langbian- Lâm Đồng, đồng thời cũng được định danh hình thái bởi thầy Trương Bình Nguyên- thuộc trường Đại học Đà Lạt
2.1.2 Dụng cụ-thiết bị-hóa chất
Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử Các dụng cụ chính được sử dụng như: đèn cồn, kẹp lấy mẫu, eppendorf, pipetteman, đầu tip, ống đong, erlen, kéo, khay đựng ống nghiệm, khay đựng eppendorf…
Cân phân tích 4 số Sartorius- Đức
Bể điều nhiệt Bioer, N3-8 Trung Quốc
Máy ly tâm điện tử- Hettich- Đức
Máy PCR 96 giếng, Benchmark, TC 9639- Mỹ
Bàn soi UV (Major Scientific, MUV 21-254/365- Đài Loan)
Hệ thống điện di (Mupid@- One- Nhật)
Tủ lạnh ẩm độ Sanyo
Máy vortex ( Vortex ZX3, Velp Ý)
2.1.3 Danh mục các phần mềm và trang web trực tuyến
Bảng 2 1 Các phần mềm và trang web được sử dụng
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
Ngân hàng cơ sở dữ liệu để khai thác và thu thập thông tin
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.c gi)
Công cụ trực tuyến trên NCBI giúp tìm kiếm các trình tự tương đồng với trình tự mục tiêu
Chromas 2.6.6 Phần mềm giúp thể hiện tín hiệu huỳnh quang sau khi giải trình tự, giúp hiệu chỉnh trình tự
BioEdit Phần mềm cho phép sắp gióng cột trình tự
Clustalw2 Phần mềm miễn phí (giao diện window) dùng cho việc so sánh sự tương đồng của hai hay nhiều trình tự sinh học
Integrated DNA technologies ( IDT) Phần mềm cho phép khảo sát những thông số của mồi
MEGA: phiên bản 6.0 (Kumar, 1993) Phần mềm miễn phí dùng để xây dựng cây phát sinh loài theo các phương pháp Maximum Likelihood bootstrap (ML-BP), neighbor-joining (NJ), maximum parsimony (MP)
Phương pháp nghiên cứu
Tách chiết DNA nấm theo phương pháp Phenol/Chloroform
Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng gen nrLSU, nrSSU, RPB1 với cặp mồi tương ứng
Giải trình tự sản phẩm PCR và hiệu chỉnh trình tự
Kiểm tra độ tương đồng của mẫu đã hiệu chỉnh bằng BLAST
Xây dựng bộ dữ liệu đơn và đa gen
Dò tìm mô hình tiến hóa tối thích
Xây dựng cây phát sinh loài (NJ, ML, MP)
Phân tích cây phát sinh loài và so sánh với nghiên cứu trước đó (Sung et al., 2007)
Kết luận tên loài cho mẫu nấm đã thực hiện
2.2.1 Khảo sát mồi khuếch đại gen nrSSU, nrLSU, RPB1
Mồi sử dụng cho phản ứng PCR phải đạt được những nguyên tắc sau: đảm bảo tính đặc hiệu ( đảm bảo vị trí bắt cặp duy nhất trên trình tự); chiều dài dao động từ 17-28 nucleotide; tổng (G+C) có thể dao động khoảng 40-60%, tránh trình tự A+T dài; nhiệt độ nóng chảy (Tm) giới hạn từ 50 o C đến 65 o C, Tm chênh lệch giữa hai mồi ( ▲Tm)
