M ụ c tiêu nghiên c ứ u
M ụ c tiêu t ổ ng quát
Tạo được chủng giống nấm C militaris bằng phương pháp lai bào tử đơn.
M ụ c tiêu c ụ th ể
- Xây dựng được kỹ thuật phân lập bào tử đơn từ quả thể nấm C militaris
- Xác định được phương pháp chọn lọc bào tử có khả năng tương hợp mang gen MAT 1-1 và MAT 1-2
- Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng lai của bào tử in vitro và khả năng tạo hình thành stroma
- Đánh giá đặc điểm sinh trưởng, hình thái và hàm lượng cordycepin của các tổ hợp lai C militaris từ phương pháp lai bào tử
Nghiên cứu mới cung cấp dữ liệu khoa học logic và hệ thống về kỹ thuật tạo giống nấm C militaris thông qua phương pháp lai BT đơn dòng.
Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học cho nghiên cứu về tạo giống hữu tính trên đối tượng nấm C militaris và các giống nấm khác
Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho việc phát triển kỹ thuật tạo giống nấm bằng phương pháp lai BT đơn dòng, nhằm tạo ra nguồn giống có hiệu suất cao ở quy mô công nghiệp thông qua kỹ thuật mới.
Tạo nguồn giống có chất lượng cao là nguồn nguyên liệu phục vụ cho quá trình nuôi trồng nấm C militaris
1.1 Giới thiệu chung về nấm Cordyceps militaris
1.1.1 Phân loại nấm Cordyceps militaris
Nấm Cordyceps militaris, hay còn gọi là nấm Đông trùng hạ thảo, được phát hiện lần đầu bởi các nhà khoa học vào năm 1878 Loại nấm này ký sinh trên ấu trùng của côn trùng thuộc chi Thitarodes và hiện đang được sử dụng phổ biến trong nhiều lĩnh vực.
Nấm C militaris thường phân bố ở các vùng núi có độ cao từ 2000m đến 3000m và được phân bố khắp nơi trên thế giới,C militaris thuộc [40]:
Lớp: Ascomycotes Bộ: Hypocreales Họ: Clavicipitaceae Chi: Cordyceps Loài: Cordyceps militaris
Hình 1.1 C militaris được thu nhận ngoài tự nhiên (www.jscr.jp)
Nấm Cordyceps militaris là loài được nghiên cứu nhiều nhất trong chi Cordyceps, nhờ vào sự đa dạng hình thái và khả năng thích nghi với nhiều sinh cảnh khác nhau Điều này giúp loài nấm này tồn tại ở nhiều vùng địa lý và sinh thái trên toàn cầu C militaris có phổ vật chủ đa dạng, chủ yếu là ấu trùng của các loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng (Coleoptera), bộ cánh màng (Hymenoptera) và bộ hai cánh (Diptera), như Ips sexdentatus, Lachnosterna quercina, Tenebrio molitor, Cimbex similis và Tipula paludosa, cùng với nhộng của các loài bướm.
Bào tử nấm C militaris thuộc nhóm BT nang, có kích thước từ 300-510 µm chiều dài và 4 µm chiều rộng, với hình dạng sợi không màu và phân đoạn kích thước 3,5-6 µm Khi quan sát dưới kính hiển vi, bào tử có hình oval với đường kính 3 µm Nấm có dạng hình chùy, thân màu vàng sẫm hoặc cam tươi, chủ yếu xuất hiện vào mùa hè Chu kỳ sống của nấm bắt đầu khi bào tử được giải phóng và xâm nhập vào vật chủ qua gió, nước và động vật Sau khi tiếp xúc, bào tử nảy mầm thành sợi nấm, tiết ra enzyme như lipase, chitinase, và protease để phá vỡ lớp vỏ vật chủ, từ đó hút dinh dưỡng và sinh trưởng cho đến khi chiếm toàn bộ cơ thể vật chủ, gây chết chúng Khi điều kiện môi trường thuận lợi vào cuối mùa hè hoặc mùa thu, quả thể phát triển ra ngoài vật chủ và phát tán bào tử, bắt đầu một chu kỳ mới.
1.1.3 Giá trị dược liệu của Cordyceps militaris
C militaris chứa từ 17 đến 19 loại acid amin, bao gồm D-mannitol và lipid, cùng với nhiều nguyên tố vi lượng, trong đó hàm lượng P cao nhất Các chất có hoạt tính sinh học cao như cordiceptic acid, cordycepin, adenosine, hydroxyethyl adenosine và nhóm hoạt chất HEAA đảm bảo dược tính cao của loài nấm này Những dược chất này có tác dụng ức chế miễn dịch, kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, hạ lipid và đường huyết, chống lão hóa, bảo vệ hệ thần kinh và có khả năng kháng ung thư, chống di căn.
C militaris chứa nhiều loại vitamin, như A, B2, B12, C, E, K và khoảng
25 - 30 % protein, 8% chất béo, đường mannitol Ngoài ra trong quả thể nấm
C militaris còn chứa nhiều acid béo không no, chiếm đến 70% acid béo tổng số, trong đó lượng acid linoleic trong quả thể chiếm 61,3% và 21,5% trong sinh khối nấm Lượng acid béo no, acid palmitic, chiếm 24,5% trong quả thể và 33,0% trong sinh khối [20] Adenosine và cordycepin là hai hợp chất có dược tính cao của nấm C militaris Adenosine chiếm 0,06% sinh khối nấm Đối với hợp chất cordycepin, trong quả thể có hàm lượng cao gấp 3 lần so với hệ sợi (0,97% so với 0,36%) [20] Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 đường monosaccharide, mannose và galactose [46]
Bảng 1.1 Các chất có hoạt tính sinh học trong nấm C militaris 3]
Hợp chất có hoạt tính sinh học Tài liệu tham khảo
Cordycepic acid Chatterjee et al (1957)
Ergosterol and ergosteryl esters Yuan et al (2007)
Acid deoxyribonuclease Ye et al (2004)
Polysaccharide exopolysaccharide Yu et al (2007, 2009), Xiao et al (2010), Yan et al (2010)
Macrolides (C10H14O4) Rukachaisirikul et al (2004) Cicadapeptins and myriocin Krasnoff et al (2005)
Superoxide dismutase Wanga et al (2005)
Dipicolinic acid Watanabe et al (2006)
Fibrynolytical enzyme Kim et al (2006)
Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra khả năng ứng dụng của cordycepin trong việc chống lại virus SARS-CoV-2 Cụ thể, một nghiên cứu năm 2020 của Verma A.K và cộng sự đã phát hiện mức độ tương tác phân tử giữa cordycepin và protein đích của virus, điều này cho thấy cordycepin có khả năng ức chế đột biến của virus cũng như các protease chính, khẳng định tiềm năng của nó trong điều trị và phòng ngừa bệnh.
Hợp chất cordycepin (3’-deoxyadenosine) là một đồng đẳng nucleoside nổi bật với hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng ung thư Nó không chỉ ngăn chặn sự di căn của tế bào ung thư mà còn điều hòa hệ miễn dịch Cordycepin có khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư và làm giảm hoạt tính của NF-Kappa B.
Hoạt chất protein (CMP) có nguồn gốc từ nấm C militaris, với kích thước 12 kDa và pI 5,1, đã cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của nấm Fusarium oxysporum và có độc tính đối với tế bào ung thư bàng quang Các hợp chất từ nấm này hứa hẹn sẽ được ứng dụng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột Cordycepin có khả năng ngăn chặn sự biểu hiện của gen T2D, điều hòa bệnh tiểu đường bằng cách ức chế các phản ứng viêm phụ thuộc NF-κB, từ đó có tiềm năng được sử dụng như một chất điều hòa miễn dịch trong điều trị các bệnh liên quan đến hệ miễn dịch.
Chiết xuất từ C militaris, cả tự nhiên lẫn nuôi cấy, đều cho thấy tác dụng chống oxy hóa mạnh mẽ, ức chế quá trình oxy hóa acid linoleic và làm giảm hoạt tính của các gốc tự do như 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH), hydrogen peroxide, hydroxyl, và anion superoxide Nghiên cứu chỉ ra rằng hợp chất CM-hs-CPS2 trong dịch chiết nấm C militaris có khả năng kháng DPPH với hoạt tính khử và tạo phức đạt 89% và 85% ở nồng độ 8 mg/ml.
Enzyme tiêu sợi huyết chiết xuất từ nấm C militaris có khả năng gắn fibrin và thúc đẩy quá trình phân hủy fibrin, tương tự như các enzym fibrinolytic mạnh như nattokinase và enzyme từ giun đất Khi được sản xuất quy mô lớn, enzyme này sẽ trở thành một giải pháp hiệu quả và tiết kiệm cho các enzym fibrinolytic đắt tiền hiện nay, đặc biệt trong điều trị bệnh tim ở người cao tuổi.
Nghiên cứu về tính kháng viêm của nấm C militaris (CMWE) cho thấy dịch chiết từ quả thể nấm này có khả năng kiểm soát lipopolysaccharide (LPS), từ đó giảm sản xuất nitric oxide, yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α) và interleukin-6 (IL-6) ở tế bào RAW264.7 Các đại thực bào được xử lý với dịch chiết CMWE cho thấy sự giảm đáng kể theo nồng độ, chứng minh rằng CMWE có tác dụng ức chế mạnh mẽ sản xuất các chất trung gian gây viêm.
1.2 Đặc điểm sinh sản nấm Cordyceps militaris
C militaris là loài có 7 nhiễm sắc thể, kích thước nhiễm sắc thể dao động trong khoảng 2,0 đến 5,7 Mb C militaris có kích thước bộ gen khoảng 32,2 mb với 9684 gen mã hóa protein, trong đó có 13,7% chứa các gen đặc hiệu của loài [51] Về di truyền học, các tế bào soma C militaris phân chia tương tự như các tế bào sinh dưỡng khác [28] Các loại nấm Cordyceps sinh sản theo nhiều hình thức khác nhau gồm sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính Ngoài ra, nấm C militaris có hình thức sinh sản dạng đồng tản (homothallism) và dị tản (heterothallism) [25]
Quá trình sinh sản vô tính ở nấm C militaris diễn ra chủ yếu thông qua các sợi nấm đơn bội với nhiều hình thức như phân hạch, BT và phân mảnh Phân mảnh là quá trình tách rời từ mảnh sợi nấm, phát triển độc lập và hình thành sợi nấm mới từ một tế bào lớn hơn Sinh sản BT vô tính được thực hiện qua sợi nấm chuyên biệt gọi là conidiophore, có thể xuất hiện đơn lẻ hoặc theo nhóm, và thường xảy ra trong môi trường thuận lợi cho sự phát tán của nấm.
Hình 1.3 Các dạng BT của nấm C militaris (1) – BT tròn tạo ra trên môi trường nuôi cấy rắn, (2) chồi BT tạo ra trên môi trường nuôi cấy lỏng,
(3) – quả thể nấm, (4) – thể quả hình chai, (5) – thể nang, (6) – các mảnh
BT, (7) – chu kỳ BT được hình thành [51]
Sinh sản hữu tính C militaris:
Ý nghĩa khoa họ c và th ự c ti ễ n
Ý nghĩa khoa họ c
Nghiên cứu mới cung cấp dữ liệu khoa học có hệ thống và logic về kỹ thuật tạo giống nấm C militaris thông qua phương pháp lai BT đơn dòng.
Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học cho nghiên cứu về tạo giống hữu tính trên đối tượng nấm C militaris và các giống nấm khác.
Ý nghĩa thự c ti ễ n
Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho việc phát triển kỹ thuật tạo giống nấm thông qua phương pháp lai BT đơn dòng, nhằm tạo ra nguồn giống có năng suất cao phục vụ cho quy mô công nghiệp bằng công nghệ tiên tiến.
Tạo nguồn giống có chất lượng cao là nguồn nguyên liệu phục vụ cho quá trình nuôi trồng nấm C militaris
1.1 Giới thiệu chung về nấm Cordyceps militaris
1.1.1 Phân loại nấm Cordyceps militaris
Nấm Cordyceps militaris, còn được biết đến với tên gọi nấm Đông trùng hạ thảo hay Nhộng trùng thảo, là một loại nấm ký sinh trên ấu trùng của côn trùng thuộc chi Thitarodes Loại nấm này đã được các nhà khoa học phát hiện vào năm 1878 và hiện nay rất được ưa chuộng trong y học và dinh dưỡng.
Nấm C militaris thường phân bố ở các vùng núi có độ cao từ 2000m đến 3000m và được phân bố khắp nơi trên thế giới,C militaris thuộc [40]:
Lớp: Ascomycotes Bộ: Hypocreales Họ: Clavicipitaceae Chi: Cordyceps Loài: Cordyceps militaris
Hình 1.1 C militaris được thu nhận ngoài tự nhiên (www.jscr.jp)
Nấm Cordyceps militaris là loài được nghiên cứu nhiều nhất trong chi Cordyceps, nhờ vào sự đa dạng về hình thái và khả năng thích nghi ở nhiều sinh cảnh khác nhau Loài nấm này xuất hiện ở nhiều vùng địa lý và sinh thái trên toàn cầu, với phổ vật chủ rất đa dạng Trong tự nhiên, nấm C militaris thường ký sinh trên ấu trùng của các loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng (Coleoptera), bộ cánh màng (Hymenoptera), và bộ hai cánh (Diptera), như Ips sexdentatus, Lachnosterna quercina, Tenebrio molitor, Cimbex similis, và Tipula paludosa, cùng với nhộng của các loài bướm.
Bào tử nấm C militaris thuộc nhóm BT nang, có kích thước từ 300-510 µm và chiều rộng 4 µm Các bào tử này hình sợi, không màu và phân đoạn, với kích thước 3,5-6 µm và đường kính 1-1,5 µm Khi quan sát dưới kính hiển vi, bào tử có hình oval với đường kính 3 µm Nấm C militaris có hình chùy, thân màu vàng sẫm hoặc cam tươi, thường xuất hiện nhiều vào mùa hè Chu kỳ sống của nấm bắt đầu khi bào tử được giải phóng và xâm nhập vào vật chủ nhờ gió, nước và động vật Khi tiếp xúc, bào tử nảy mầm thành sợi nấm, tiết ra enzyme như lipase, chitinase, protease để phá vỡ lớp vỏ ngoài của vật chủ Hệ sợi nấm hút dinh dưỡng và sinh trưởng mạnh, chiếm toàn bộ cơ thể vật chủ, dẫn đến cái chết của nó Khi gặp điều kiện thuận lợi vào cuối mùa hè hoặc mùa thu, quả thể phát triển ra ngoài vật chủ và phát tán bào tử, bắt đầu chu kỳ mới.
1.1.3 Giá trị dược liệu của Cordyceps militaris
C militaris chứa từ 17 đến 19 loại acid amin khác nhau, bao gồm D-mannitol và lipid, cùng với nhiều nguyên tố vi lượng, trong đó hàm lượng phospho cao nhất Các hợp chất có hoạt tính sinh học cao, như cordiceptic acid, cordycepin, adenosine, hydroxyethyl adenosine và nhóm HEAA, góp phần tạo nên dược tính cao của loài nấm này Những dược chất này có tác dụng ức chế miễn dịch, kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, hạ lipid trong máu, hạ đường huyết, chống lão hóa, bảo vệ hệ thần kinh và kháng ung thư, đặc biệt là kháng đột biến anti-metastatic.
C militaris chứa nhiều loại vitamin, như A, B2, B12, C, E, K và khoảng
25 - 30 % protein, 8% chất béo, đường mannitol Ngoài ra trong quả thể nấm
C militaris còn chứa nhiều acid béo không no, chiếm đến 70% acid béo tổng số, trong đó lượng acid linoleic trong quả thể chiếm 61,3% và 21,5% trong sinh khối nấm Lượng acid béo no, acid palmitic, chiếm 24,5% trong quả thể và 33,0% trong sinh khối [20] Adenosine và cordycepin là hai hợp chất có dược tính cao của nấm C militaris Adenosine chiếm 0,06% sinh khối nấm Đối với hợp chất cordycepin, trong quả thể có hàm lượng cao gấp 3 lần so với hệ sợi (0,97% so với 0,36%) [20] Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 đường monosaccharide, mannose và galactose [46]
Bảng 1.1 Các chất có hoạt tính sinh học trong nấm C militaris 3]
Hợp chất có hoạt tính sinh học Tài liệu tham khảo
Cordycepic acid Chatterjee et al (1957)
Ergosterol and ergosteryl esters Yuan et al (2007)
Acid deoxyribonuclease Ye et al (2004)
Polysaccharide exopolysaccharide Yu et al (2007, 2009), Xiao et al (2010), Yan et al (2010)
Macrolides (C10H14O4) Rukachaisirikul et al (2004) Cicadapeptins and myriocin Krasnoff et al (2005)
Superoxide dismutase Wanga et al (2005)
Dipicolinic acid Watanabe et al (2006)
Fibrynolytical enzyme Kim et al (2006)
Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng cordycepin có khả năng chống lại virus SARS-CoV-2 Một nghiên cứu của Verma A.K và cộng sự vào năm 2020 đã phát hiện mức độ tương tác phân tử giữa cordycepin và protein đích của virus, giúp tăng cường khả năng ức chế đột biến và các protease chính của SARS-CoV-2 Điều này khẳng định tiềm năng của cordycepin trong việc điều trị và phòng ngừa bệnh.
Hợp chất cordycepin (3’-deoxyadenosine) là một đồng đẳng nucleoside nổi bật với hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thư và khả năng ngăn chặn sự di căn của tế bào ung thư Nó cũng đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa miễn dịch và ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư, đồng thời làm giảm hoạt tính của NF-Kappa B.
Hoạt chất protein (CMP) có nguồn gốc từ nấm C militaris, với kích thước 12 kDa và pI 5,1, cho thấy hoạt tính sinh học cao, ức chế sự phát triển của nấm Fusarium oxysporum và gây độc tế bào đối với ung thư bàng quang Các hợp chất từ nấm này được kỳ vọng sẽ ứng dụng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột Cordycepin có khả năng ngăn chặn sự biểu hiện của gen T2D, điều hòa bệnh tiểu đường bằng cách ức chế phản ứng viêm phụ thuộc NF-κB, mở ra hy vọng cho việc sử dụng như một chất điều hòa miễn dịch trong điều trị các bệnh lý liên quan đến miễn dịch.
Dịch chiết từ nấm C militaris, cả tự nhiên và nuôi cấy, đều thể hiện khả năng chống oxy hóa đáng kể Chúng có khả năng ức chế quá trình oxy hóa acid linoleic và làm giảm hoạt tính của các chất như 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH), hydrogen peroxide, gốc tự do hydroxyl và anion superoxide Nghiên cứu chỉ ra rằng hợp chất CM-hs-CPS2 trong dịch chiết nấm C militaris có khả năng kháng DPPH với hoạt tính khử và tạo phức đạt 89% và 85% ở nồng độ 8 mg/ml.
Enzyme tiêu sợi huyết chiết xuất từ nấm C militaris có khả năng gắn kết fibrin, giúp thúc đẩy quá trình phân hủy fibrin Enzyme này có thể được áp dụng trong điều trị tan huyết khối, tương tự như các enzym fibrinolytic mạnh khác như nattokinase và enzyme từ giun đất Khi enzyme này được sản xuất ở quy mô lớn, nó sẽ trở thành một giải pháp hiệu quả thay thế cho các enzym fibrinolytic có giá thành cao hiện đang được sử dụng trong điều trị bệnh tim lão hóa.
Nấm C militaris (CMWE) đã cho thấy khả năng kháng viêm mạnh mẽ thông qua việc ức chế sản xuất nitric oxide, yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α) và interleukin-6 (IL-6) trong tế bào đại thực bào RAW264,7 Các thí nghiệm cho thấy dịch chiết CMWE làm giảm nồng độ các chất trung gian gây viêm, khẳng định tác dụng kiểm soát của nó đối với lipopolysaccharide (LPS).
1.2 Đặc điểm sinh sản nấm Cordyceps militaris
C militaris là loài có 7 nhiễm sắc thể, kích thước nhiễm sắc thể dao động trong khoảng 2,0 đến 5,7 Mb C militaris có kích thước bộ gen khoảng 32,2 mb với 9684 gen mã hóa protein, trong đó có 13,7% chứa các gen đặc hiệu của loài [51] Về di truyền học, các tế bào soma C militaris phân chia tương tự như các tế bào sinh dưỡng khác [28] Các loại nấm Cordyceps sinh sản theo nhiều hình thức khác nhau gồm sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính Ngoài ra, nấm C militaris có hình thức sinh sản dạng đồng tản (homothallism) và dị tản (heterothallism) [25]
Quá trình sinh sản vô tính ở nấm C militaris diễn ra chủ yếu thông qua các sợi nấm đơn bội với nhiều hình thức như phân hạch, BT và phân mảnh Phân mảnh là quá trình tách rời các mảnh sợi nấm để phát triển độc lập, hình thành từ việc làm dày vách ngăn của một tế bào lớn hơn, sau đó được giải phóng để tạo ra sợi nấm mới Sinh sản BT vô tính diễn ra từ các sợi nấm chuyên biệt gọi là conidiophore, có thể xuất hiện đơn lẻ hoặc tập hợp thành nhiều hình thức khác nhau, thường hình thành trong môi trường thuận lợi cho sự phát tán của nấm.
Hình 1.3 Các dạng BT của nấm C militaris (1) – BT tròn tạo ra trên môi trường nuôi cấy rắn, (2) chồi BT tạo ra trên môi trường nuôi cấy lỏng,
(3) – quả thể nấm, (4) – thể quả hình chai, (5) – thể nang, (6) – các mảnh
BT, (7) – chu kỳ BT được hình thành [51]
Sinh sản hữu tính C militaris:
Trong giai đoạn sinh sản, hệ sợi nấm hình Dikaryon chứa hai nhân di truyền khác biệt, bao gồm ascogonium (-) và antheridium (+) Hai cấu trúc này hợp nhất qua quá trình plasmogamy, tạo ra hợp tử lưỡng bội với hai bộ nhiễm sắc thể (một từ mẹ và một từ bố) Các tế bào sinh dưỡng lưỡng bội tiếp tục phân chia bằng nguyên phân, tạo ra các tế bào lưỡng bội giống hệt nhau về mặt di truyền, và thông qua giảm phân, hình thành 8 bào tử có tính di truyền.
T Ổ NG QUAN T À I LI U
Đặc điể m sinh s ả n n m Cordyceps militaris
C militaris là loài có 7 nhiễm sắc thể, k�ch thước nhiễm sắc thểdao động trong khoảng 2,0 đ n 5,7 Mb C militaris có k�ch thước bộ gen khoảng 32,2 mb với 9684 gen mã hóa protein, trong đó có 13,7% chứa các gen đặc hiệu c a loài [51] V di truy n học, các t bào soma C militaris phân chia tương tựnhư các t b�o sinh dưỡng khác [28] Các loại n m Cordyceps sinh sản theo nhi u hình thức khác nhau gồm sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính Ngoài ra, n m
C militaris có hình thức sinh sản dạng đồng tản (homothallism) và dị tản (heterothallism) [25]
Quá trình sinh sản vô tính của nấm C militaris diễn ra qua các sợi nấm đơn bội với nhiều hình thức như phân hạch, phân mảnh và sinh sản bào tử (BT) Phân mảnh là quá trình tách các mảnh sợi nấm và phát triển độc lập, hình thành từ việc dày lên của vách ngăn từ một tế bào lớn hơn Sinh sản bào tử vô tính diễn ra từ các sợi nấm chuyên biệt gọi là conidiophore, có thể xuất hiện đơn lẻ hoặc nhóm lại theo nhiều hình thức khác nhau Các bào tử này có khả năng phát tán trong môi trường thạch hoặc lỏng, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm.
Hình 1.3 Các dạng BT của nấm C militaris (1) – BT tròn tạo ra trên môi trường nuôi cấy rắn, (2) chồi BT tạo ra trên môi trường nuôi cấy lỏng,
(3) – quả thể nấm, (4) – thể quả hình chai, (5) – thể nang, (6) – các mảnh BT,
(7) – chu kỳ BT được hình thành [51]
Sinh sản hữu tính C militaris:
Trong giai đoạn sinh sản, hệ sợi n m hình Dikaryon là tế bào chứa hai nhân khác biệt, với hai cấu trúc di truyền là ascogonium (-) và antheridium (+) Sự kết hợp của hai cấu trúc này tạo ra plasmogamy, hình thành hợp tử lưỡng bội với hai bộ nhiễm sắc thể (một từ mẹ và một từ bố) Các tế bào sinh dưỡng lưỡng bội sẽ tiến hành phân chia bằng nguyên phân để tạo ra các tế bào lưỡng bội giống hệt nhau về mặt di truyền, đồng thời thực hiện giảm phân để tạo thành 8 bào tử có mặt di truyền.
C militaris có đặc điểm gen sinh sản hữu tính thông qua hình thức lai kiểu locus t giữa hai BT giới tính khác nhau, bao gồm locus MAT-alpha với hai chuỗi gen MAT1-1-1 và MAT1-1-2, cùng với locus MAT-HMG chứa chuỗi gen MAT1-2-1 Trong quá trình sinh sản hữu tính, sợi n m đa nhân có mối quan hệ di truyền tương đồng Hai tế bào liên kết mà không thông qua hạt nhân, dẫn đến sự hình thành cặp tương thích và bắt đầu chu kỳ hai nhân của quá trình lai Cuối cùng, hai nhân đơn bội hợp nhất và trải qua giảm phân, hoàn thành chu kỳ sinh sản của sợi n m.
Nấm C militaris có đặc điểm di truyền sinh sản dị hợp tử với các locus MAT 1-1 và MAT 1-2, trong đó MAT 1-1 hỗ trợ hình thành bào tử trong sợi nấm, còn MAT 1-2 điều chỉnh quá trình hình thành stroma Sự kết hợp giữa các alen của hai locus này là cần thiết cho chu kỳ sinh sản hoàn chỉnh Đặc biệt, MAT 1-2 chứa protein HMG liên kết với DNA, đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các gen liên quan đến sự phát triển và trao đổi chất.
MAT1-1 (bao gồm MAT1-1-1 và MAT1-1-2) cùng với MAT1-2 (MAT1-2-1) đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh sản của nấm, với mỗi gen mã hóa cho một yếu tố phiên mã riêng Gen MAT1-1 chứa gen mã hóa alpha, giúp biểu hiện sự tương tác giữa pheromone và thụ thể pheromone Trong khi đó, gen MAT1-2 chứa HMG-box, là các protein liên kết DNA, có vai trò thiết yếu trong việc kiểm soát các gen liên quan đến con đường trao đổi chất, đặc biệt là trong sinh sản hữu tính và phát triển cơ thể nấm Sự giao thoa của thụ thể pheromone 1 cũng đóng góp vào quá trình này.
(CPR1) và 2 (CPR2) trong MAT1-1-2 và MAT 1-2 gi�p t�ch lũy một h�m lượng cordycepin cao hơn đáng kể so với ch ng bố mẹ [26].
Ch ọ n gi ố ng n m b ằng phương pháp lai b�o tử đơn
1.3.1 Quy trình chọn giống n�m bằng phương pháp lai bào tử đơn
Quy trình chọn giống n m bằng phương pháp BT có 04 bước chính bao gồm:
Bước đầu tiên trong quy trình là thu nhận các bào tử đơn lẻ với kiểu gen lai khác nhau nhằm xác định đặc điểm di truyền Để thực hiện điều này, người ta thường sử dụng phương pháp PCR để xác định kiểu gen giới tính của bào tử, bao gồm bào tử mang gen MAT1-1.
Bước 2: Nuôi và nhân nhanh các BT đơn lẻtrên môi trư ng rắn hoặc môi trư ng lỏng nhằm tạo nguồn sinh khối lớn
Bước 3: Sau khi xác định kiểu gen và nhân nhanh số lượng, các BT có kiểu gen khác nhau sẽ được lai với nhau trong môi trường phù hợp Quá trình này giúp dung hợp gen, hình thành quả thể và tạo ra loài mới với kiểu gen từ hai BT khác nhau.
Bước 4 là giai đoạn quan trọng trong quá trình chọn giống thông qua phương pháp lai BT đơn Sau khi lai, quả thể và giống n m được kiểm tra kiểu gen và đánh giá các đặc điểm di truyền cùng với các đặc điểm hình thái Mục tiêu là tuyển chọn giống lai mới hiệu quả, phù hợp với mục đích lai tạo theo con đường hữu tính.
1.3.2 Các yếu tốảnh hưởng đến hiệu quả chọn giống
Trong quá trình lai tạo giống bằng phương pháp BT đơn, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tạo giống, bao gồm phương pháp bắt BT, môi trường nhân giống, môi trường nuôi cấy và yếu tố di truyền của các bố mẹ.
Phương pháp phân lập BT quyết định khả năng thu nhận số lượng và chất lượng BT, đồng thời ảnh hưởng đến quá trình chọn lựa đặc điểm di truyền giới tính của BT Hiện nay, có nhiều phương pháp phân lập BT khác nhau, mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm tùy thuộc vào từng loài.
Bảng 1.2 C�c phương ph�p phân lập BT Đặc điểm Phương pháp của SD/S[49] Phương pháp của Teik-khiang Goh [49]
Mẫu vật (quả thể n m), băng dính
Mẫu n m, kim th y tinh, cồn 95%
Mẫu n m, kim th y tinh, cồn 95%, kính hiển vi Các bước xử lý mẫu
Không xử lý Xử lý mẫu sơ bộ bằng cồn
Không BT được giữ trên lam kính
BT tách chứa trong ống ly tâm đã được khử trùng
Quả thể tự giải phóng BT theo cơ ch sinh sản
BT được c y đ u trên đĩa thạch
BT được c y chuyển bằng micropipette đã khử trùng trên t ng ô vuông 1,5x1,5cm
Quá trình nuôi Mẫu kiểm tra (3-
Mẫu kiểm tra theo định k
Mẫu kiểm tra theo định k
BT nảy mầm được bắt ra bằng cách di chuyển
Tìm BT nảy mầm dưới kính hiển vi rồi bắt
Tìm BT nảy mầm dưới kính hiển vi rồi bắt
Tình hình nghiên c ứ u c a n m Cordyceps militaris
Chuyển đổi giống BT lên môi trường mong muốn không chỉ phụ thuộc vào các phương pháp phân lập mà còn chịu ảnh hưởng từ yếu tố di truyền Các giống BT có đặc điểm di truyền tương đồng thường có khả năng lai tạo cao hơn so với những giống có di truyền khác nhau Tuy nhiên, yếu tố này có thể làm giảm chất lượng giống do nguồn giống được tạo ra từ nguồn gen làm giảm đa dạng sinh học và dẫn đến thoái hóa nguồn giống.
Khi lai giống C militaris với các BT có đặc điểm di truyền khác nhau, mặc dù tỉ lệ lai tạo thấp, nhưng vẫn có khả năng tìm được nguồn giống có khả năng phát triển tốt Những giống này không chỉ cho năng suất cao mà còn có khả năng tích lũy hợp chất thứ cấp vượt trội.
V môi trường nuôi cấy, phương pháp cấy giống đóng vai trò quan trọng trong quá trình lai tạo Môi trường lai cung cấp nguồn dinh dưỡng cần thiết, giúp hệ sợi nấm có thời gian và điều kiện để sinh trưởng, phát triển Điều này tạo thuận lợi cho quá trình trao đổi di truyền, làm đa dạng di truyền và hình thành nguồn giống mới thông qua lai hữu tính.
1.4 Tình hình nghiên cứu của n�m Cordyceps militaris
1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Vào năm 2013, K Zhang và cộng sự đã nghiên cứu một giao thức tối ưu hóa phân lập BT đơn cho nấm Trong nghiên cứu này, mẫu khử trùng bề mặt nấm được thực hiện bằng dung dịch đệm chứa 75% ethanol, sau đó nấm được cắt thành mảnh nhỏ bằng cách sử dụng kẹp và chuyển vào nước khử trùng trong ống ly tâm Ống ly tâm được đậy nắp nhanh chóng và khuấy để thu được huyền phù BT đồng nhất Huyền phù này sau đó được chuyển vào đĩa vật liệu bằng micropipette và được ủ ở nhiệt độ phòng (khoảng 25°C) Thời gian ủ phụ thuộc vào tính năng nảy mầm của các loại nấm khác nhau.
Trong nghiên cứu của Goh (1999), BT nấm được phân lập bằng ống mao dẫn tự tạo từ hai ống thủy tinh rỗng Hai đầu của hai ống thủy tinh chạm vào nhau và được đốt nóng trên ngọn lửa đèn cồn Khi chúng nóng chảy, hai ống được kéo ra xa nhau để tạo thành một đoạn ống dài và cực nhỏ, với chiều dài lý tưởng là 2cm, không bị cong và tịt đầu Quy trình sử dụng ống mao dẫn tự chế trong thao tác phân lập BT nấm được trình bày chi tiết trong nghiên cứu này, cùng với các ví dụ phân lập BT nấm thành công bằng phương pháp này đã được đưa ra và thảo luận.
Nghiên cứu của Naru Kang và cộng sự (2017) đã tiến hành phân lập và tuyển chọn trên 20 chủng bố mẹ, trong đó xác định trình tự rDNA và thu nhận 7 bào tử MAT 1-1 cùng 5 bào tử MAT 1-2 từ 12 chủng bố mẹ Tiếp theo, nghiên cứu đã thực hiện thí nghiệm với 35 tổ hợp trong môi trường gạo lứt, kết quả cho thấy 8 tổ hợp hình thành quả thể, khẳng định các chủng giao phối đã thành công Phương pháp HPCL đã được áp dụng trong quá trình này.
Nghiên cứu đã xác định được 8 chủng được tuyển chọn từ tổ hợp di truyền bằng phương pháp sinh sản hữu tính, trong đó chủng KSP8 có khả năng tích lũy cordycepin cao hơn so với các chủng bố mẹ.
Nghiên cứu của Bhushan Shrestha và cộng sự (2004) về hệ thống giao phối của C militaris trong môi trường in vitro cho thấy sự khác biệt về kiểu hình giữa các tổ hợp lai Các tổ hợp lai có khả năng hình thành quả thể, trong khi những tổ hợp không hình thành stroma hoặc có kiểu stroma bất thường so với tổ tiên Đặc điểm hình thái chỉ ra rằng nấm C militaris có đặc điểm di truyền của loài nấm lưỡng cực, cần sự kết hợp của hai chồng di truyền tương đồng trong quá trình giao phối để tạo ra giống có khả năng ứng dụng trong nuôi trồng và phát triển sinh khối C militaris.
Nghiên cứu của Guozhen và ZhangYue Liang (2013) đã chỉ ra rằng khả năng hình thành quả thể của C militaris có thể được cải thiện thông qua việc chọn lọc các bào tử đơn từ các quần thể nấm tự nhiên và nấm nuôi trồng Bằng cách xác định đặc điểm của các bào tử thông qua sự tồn tại của gen MAT1-1 α-BOX và MAT1-2 HMG-BOX bằng phương pháp PCR, kết quả cho thấy tỷ lệ giao phối giữa MAT1-1 và MAT1-2 là 1:1 trong nấm tự nhiên (66:70) và trong nấm nuôi trồng (71:60) Các cá thể được giao phối có khả năng hình thành stroma gấp năm lần so với các cá thể có cùng đặc điểm di truyền và các tổ hợp tự lai Nghiên cứu này cung cấp tài liệu khoa học quý giá cho việc nuôi trồng và tuyển chọn các loại nấm ăn, nấm dược liệu, góp phần vào việc thuần hóa và bảo quản tốt các giống nấm chất lượng phục vụ sản xuất.
1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Hiện tại, nghiên cứu về giống C militaris tại Việt Nam vẫn còn hạn chế và chưa phát triển mạnh mẽ Các báo cáo khoa học chủ yếu tập trung vào quy trình sản xuất, điều kiện ảnh hưởng đến việc nuôi trồng, cũng như nghiên cứu các hoạt chất có trong nấm.
Trần Thu H� (2015) đã nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống và nuôi trồng n m đông tr�ng hạ thảo (C militaris) mới nhập nội ở Việt Nam
Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng công nghệ nhân giống dạng dịch thể trong sản xuất giống mang lại nhiều ưu điểm, bao gồm tiềm năng năng suất cao hơn trong thời gian ngắn và tỷ lệ nhiễm bệnh thấp hơn.
Nguyễn Thị Liên Thương và cộng sự (2016) đã tiến hành khảo sát về đặc điểm sinh học, giá trị dược liệu và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trồng nấm Đông trùng hạ thảo (C militaris) Nghiên cứu này tập trung vào việc cải tiến môi trường nuôi trồng nấm bằng cách kiểm soát các yếu tố như giống, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng và dinh dưỡng để đạt được sự ổn định trong quá trình phát triển.
Trong quá trình nuôi trồng nấm, sự thoái hóa của hệ sợi nấm ảnh hưởng lớn đến chất lượng quả thể Để khắc phục nhược điểm của phương pháp phân lập bằng mô tế bào, nhiều nghiên cứu gần đây đã ứng dụng biotechnologie (BT) nấm thay thế mô tế bào Phương pháp này có ưu điểm tạo ra nấm đơn có hệ gen thuần nhất, giúp tăng khả năng chống thoái hóa giống Ngược lại, giống phân lập bằng mô tế bào thường gặp hiện tượng thoái hóa ở hệ thứ.
Việc nghiên cứu và nuôi trồng C militaris thông qua phương pháp nhân giống BT đơn là rất cần thiết để bảo tồn nguồn gen ban đầu và cung cấp nguyên liệu cho các quá trình nghiên cứu sau này Hiện tượng thoái hóa chỉ xuất hiện rõ ở thế hệ thứ 8, trong khi thế hệ thứ 5 mới bắt đầu giai đoạn thoái hóa, cho thấy tầm quan trọng của việc duy trì chất lượng giống.
ĐỐI TƯỢ NG, PH Ạ M VI, N ỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C Ứ U
Đối tượ ng nghiên c ứ u
Nghiên cứu đã tiến hành với 08 giống C militaris có nguồn gốc khác nhau (Bảng 2.1) Các chủng nấm được nuôi cấy và bảo quản trong môi trường thạch khoai tây PDA ở nhiệt độ 25°C.
Bảng 2.1 Danh s�ch c�c đơn vị cung cấp nguồn giống C militaris
STT Tên đơn vị Số lượng Ký hiệu
1 Viện Di truy n Nông nghiệp Việt Nam 02 Cm1, Cm2
2 Khoa Sinh-Môi trư ng, Trư ng ĐHSP – ĐHĐN 01 Cm3
3 Công ty dược thảo Kim Cương V�ng 01 Cm4
4 Đại học Th Dầu Một 01 Cm5
5 Trung tâm ứng dụng ti n bộ khoa học v� thông tin tỉnh Quảng Trị 01 Cm6
6 Trư ng Đại học Quốc gia Seoul H�n Quốc 01 Cm7
7 Công ty TNHH VINSEED BIOTECH 01 Cm8
Ph ạ m vi nghiên c ứ u
- Đ tài ti n hành nghiên cứu trong th i gian t tháng 10/2019 - 3/2021
- Nghiên cứu được thực hiện tại các phòng th� nghiệm thuộc khoa Sinh –Môi trư ng, Trư ng đại học Sư phạm –ĐHĐN.
N ộ i dung nghiên c ứ u
- Cải ti n phương pháp phân lập b�o tửđơn t n m C militaris
- Chọn lọc BT đơn bằng chỉ thị phân tử gen MAT1-1 và MAT1-2
- Đánh giá ảnh hưởng c a môi trư ng nuôi đ n khảnăng lai BT đơn
- Đánh giáđặc điểm sinh trưởng, h�nh thái v� h�m lượng cordycepin c a các tổ hợp lai.
Phương pháp nghiên cứ u
2.4.1 Phương pháp phân lập bào tửđơn bội a Phương pháp phân lập bào tử spore drop/shooting
Quả thể n m C militaris được gắn vào mặt trong của đĩa petri chứa môi trường 2% agar và nước bằng keo dán, sau đó được nuôi ở điều kiện 25°C trong 2-5 ngày dưới chu kỳ 12 giờ sáng Sau 02 ngày, tiến hành quan sát dưới kính soi nổi để theo dõi sự nảy mầm của bào tử, và sau đó bào tử được thu thập và nuôi trên môi trường PDA.
Sử dụng ống thủy tinh có kích thước đầu kim 0,2mm để bắt các bào tử ở giai đoạn nảy mầm hoặc chưa nảy mầm Tiến hành quan sát dịch bào tử được cấy trên lam kính hoặc đĩa petri Dùng kim thủy tinh đã khử trùng để hút các bào tử đơn bào vào ống kim, sau đó tiến hành đưa vào dung dịch khử trùng tương ứng với bào tử hoặc nhóm bào tử, và cuối cùng cấy lên môi trường mong muốn.
Phương pháp phân lập bào tử nấm của Zhang và cộng sự đã được cải tiến từ phương pháp của Choi và cộng sự vào năm 1999 Quả thể nấm hoặc vật chứa bào tử được xử lý nhẹ bằng cồn 75% Sau đó, tiến hành nghiền trong ống Eppendorf, bổ sung nước vô trùng và khuấy nhanh bằng máy vortex để tạo dịch huyền phù Sử dụng kính hiển vi để kiểm tra chất lượng bào tử Dịch huyền phù được cấy 200 µl lên từng ô vuông có diện tích 1,5 cm², tạo hình giọt nước trên mỗi ô, và tiến hành ủ ở điều kiện 25°C trong thời gian tùy thuộc vào thời gian nảy mầm của mỗi loài nấm.
Các dụng cụ và thiết bị bắt vi sinh vật được đặt trong tủ cấy an toàn sinh học để ngăn ngừa sự tạp nhiễm Dung dịch huyền phù được cấy vào môi trường thạch và quan sát bằng kính hiển vi soi nổi để phát hiện các vi sinh vật đang nảy mầm Quá trình bắt vi sinh vật được thực hiện bằng kim thủy tinh đã được khử trùng, sau đó cấy lên đĩa môi trường Cuối cùng, tiến hành quan sát sự phát triển của vi sinh vật và tách chúng ra thành các đĩa khác nhau.
2.4.2 Phương pháp đánh giá kiểu gen MAT của bào tử a Phương pháp tách DNA
Tách chi t được ti n h�nh theo phương pháp CTAB theo quy tr�nh như sau:
+ Đối với mẫu quả thểtươi: Dùng dao cắt phần ngọn quả thểtươi t 1 đ n 2mm, cho vào ống eppendorf 1,5ml
+ Đối với sợi n m trên nuôi trư ng rắn: Dùng que c y gạt nhẹ trên b mặt môi trư ng thu 1 tơ n m cho vào ống effendorf 1,5ml
+ Đối với sợi n m trong mụi trư ng dịch thể: D�ng lưới lọc 20àm lọc thu hệ sợi n m, chuyển 1g hệ sợi cho vào ống effendorf 1,5ml
- Bổ sung 700àl đệm CTAB rồi nghi n và ở 60 o C khoảng 60 phỳt
- Bổ sung 700àl hỗn hợp CI (chloroform/isoamyl alcohol- 24:1), lắc nhẹ trong 10 phút, rồi ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút
- Chuyển 600àl phần dịch nổi trong sang ống effendorf mới
- Bổ sung 600àl isopropanol, sau đú ly tõm 13.000 vũng/ph�t trong 10 phút, thu k t t a
- Rửa k t t a bằng ethanol 70% hai lần, ly tâm 13.000 vòng/phút, trong 5 phút, loại bỏ dịch nỗi, s y khô
- K t t a được hũa loóng trong 50àl nước c t vụ trựng v� được bảo quản trong đi u kiện -20 o C cho đ n khi sử dụng b Phương pháp PCR
Phản ứng PCR được ti n hành trên máy Aeris Thermal Cycler ESCO, Singapore)
Thành phần phản ứng PCR với thể tớch 20àl/1 gồm:
- 1X Master Mix (Công ty TNHH MTV Sinh Hóa Phù Sa)
- 10 pmol Primer mồi xuôi và 10 pmol mồi ngược và 50mg/l DNA (Bảng 2.2)
Chu trình nhiệt bao gồm 4 bước sau: (1) – 95 o C trong 1 phút; (2) 95 o C trong 30 giây; (3) 58 o C trong 30 giây; (4) 72 o C trong 30 giây, lặp lại 35 chu k t bước 2 đ n bước 4 và nhiệt độ 72 o C trong 5 phút
Bảng 2.2 Tr�nh tự các đoạn mồi được sử dụng trong nghiên cứu Đoạn mồi Trình tự nucleotide (5' - 3')
MAT1-1-2-R GACGGGACCATGTCTCAGAT c Phương pháp điện di trên gel agarose
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm 1X TAE, ở hiệu điện th 100V, 400mA, trong 30 ph�t
Sản phẩm PCR được nhuộm bằng dung dịch Redsafe
2.4.3 Phương pháp nhân nhanh bào tử
Bào tử được phân lập trên môi trường rắn và nhân nhanh bằng cách nuôi cấy trong môi trường PD với thể tích 50ml trong bình tam giác 250ml, kèm theo 10g hạt thí nghiệm Quá trình nuôi cấy diễn ra ở nhiệt độ 25°C trong 7 ngày, với chu kỳ chiếu sáng 12 giờ sáng và 12 giờ tối.
2.4.4 Phương pháp lai bào tử đơn dòng tạo dòng hữu tính và cảm ứng hình thành stroma
Giống BT đơn được nhân sinh khối trong môi trư ng dịch thể PD, ởđi u kiện lắc 120 vòng/phút, 25 o C trong 7 ngày
Môi trường phát sinh stroma:
+ PDA: 200g khoai tây 20g sucrose, 8g agar, 20g peptone,1g MgSO4.7H2O; 0,5g KH2PO4 v� nước c t 1l
+ Môi trư ng bán tổng hợp: 40g gạo lứt, 64ml dịch (20g sucrose, 20g peptone, 1g MgSO4ã7H2O, 0,5g KH2PO4 v� nước c t 1l)
+ Môi trư ng nhộng: 20g gạo lứt, 4g nhộng tằm, 64ml dịch (20g sucrose, 20g peptone, 1g MgSO4ã7H2O; 0,5g KH2PO4 và nước c t 1l)
Các giống BT được nuôi để tăng sinh khối trong 7 ngày, với hai giống có nguồn gốc từ bố mẹ khác nhau được cấy vào môi trường phát sinh stroma với thể tích 15ml giống dịch lỏng Sau 7 ngày nuôi trong tối ở 25°C, quá trình sinh trưởng của hệ sợi được thúc đẩy Tất cả mẫu được nuôi ở 20°C trong 50 ngày trong buồng tăng trưởng với chu kỳ 12 giờ sáng/tối và độ ẩm 90% để đánh giá hiệu quả của quá trình lai hữu tính.
2.4.5 Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh trưởng và hình thái các tổ hợp lai
Hệ sợi nấm phát triển trong môi trường PDA thông qua quá trình lai hữu tính được đánh giá bằng phương pháp quan sát Tốc độ phát triển của hệ sợi nấm được so sánh với mẫu đối chiếu là chủng nấm bố mẹ.
Tốc độ phát triển hệ sợi được đo 1 ngày 1 lần bằng thước có độ chia 1mm
Sự phát triển của stroma trong môi trường bán tổng hợp và gạo lứt sau 50 ngày nuôi cấy đã được đánh giá qua các chỉ tiêu về màu sắc, số lượng, chiều dài và đặc điểm trên bề mặt stroma Bên cạnh đó, các đặc điểm hình thái và kích thước hạt giống nuôi cấy lỏng của các chủng giống lai cũng đã được khảo sát.
2.4.6 Phương pháp xác định hàm lượng Cordycepin
Sau 50 ngày nuôi, ở các môi trư ng gạo lứt ti n hành thu hoạch stroma
Mẫu stroma và hệ sợi được l�m đông lạnh và nghi n thành bột mịn ti n hành cách th y ở nhiệt độ 60 o C trong 1 gi
Các mẫu đã được lọc qua lưới lọc đường kính 0,22 μm Hàm lượng cordycepin được định lượng bằng máy HPLC với dung môi nước và aceton theo tỷ lệ 91:9 (v/v), tốc độ chảy 500 μl/phút ở nhiệt độ 30°C Thể tích tiêm là 10μl với bước sóng 260nm Đường chuẩn hàm lượng cordycepin được xác định với các nồng độ 0, 10, 20, 30, 40 và 50μg/ml để hiệu chuẩn.
So sánh h�m lượng cordycepin các ch ng giống lai hữu tính thành công và với h�m lượng cordycepin c a ch ng bố mẹ
Chất chuẩn cordycepin (C10H13N5O3) được chiết xuất từ nấm Cordyceps militaris và có thể được mua tại SigmaAldrich Phân tích cordycepin được thực hiện bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên hệ thống HPLC Alliance, sử dụng cột symmetry C18 với kích thước 4,6 x 250mm và kích thước hạt 5µm.
2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu
Các k t quảphân t�ch được tính toán và xử lí bằng toán thống kê sinh học trên chương tr�nh MS- Excel-2013 và R với độ tin cậy 95%.
KẾ T QU Ả NGHIÊN C Ứ U VÀ TH Ả O LU Ậ N
Đánh giá đặc điể m hình thái, sinh trưở ng và kh ả năng t�ch lũy cordycepin
3.4.1 Đặc điểm sinh trưởng hệ sợi các tổ hợp lai trên môi trường rắn
Các tổ hợp lai hệ sợi nấm có tốc độ và khả năng thích nghi khác nhau, nhưng nhìn chung, tốc độ sinh trưởng của chúng tương đương với các giống bố mẹ (Hình 3.12, Hình 3.13) Trong số đó, tổ hợp lai thành công như SCm2×SCm1 và SCm4×SCm6 cho thấy tốc độ sinh trưởng tốt hơn so với các tổ hợp lai khác và tổ hợp lai không thành công Mặc dù không có tốc độ sinh trưởng vượt trội so với các giống bố mẹ, nhưng chúng vẫn duy trì tốc độ sinh trưởng ổn định cao hơn.
Hình 3.10 Tốc độ sinh trư ng của hệ sợi các tổ hợp lai và chủng bố mẹ trên môi trường rắn
Hình 3.11 Hệ sợi các tổ hợp lai nuôi cấy trên môi trường PDA
3.4.2 Đặc điểm sinh trưởng hệ sợi các tổ hợp lai trên môi trường lỏng
Kết quả nghiên cứu cho thấy trong môi trường dịch thể, các tổ hợp lai có sự khác biệt về kích thước khuẩn lạc và sinh khối sợi nấm Tổ hợp lai (SCm3×SCm8) nổi bật với đường kính khuẩn lạc nhỏ nhất là 1,1±0,01mm, tuy nhiên khối lượng sinh khối thu được chỉ đạt 0,383g/100ml Ngược lại, tổ hợp lai (SCm2×SCm1) lại có kích thước khác biệt đáng chú ý.
Tổ hợp lai (SCm3×SCm8) có kích thước khuẩn lạc nhỏ, nhưng sinh khối khô cao vượt trội so với tổ hợp lai khác Kích thước nhỏ giúp các hệ sợi dễ dàng trao đổi sinh chất và lấn sâu vào môi trường nuôi cấy Sinh khối lớn của tổ hợp này không chỉ giảm thiểu thể tích nuôi cấy mà còn tăng khả năng tích lũy cordycepin trong môi trường dịch thể, làm cho nó trở thành giống thương phẩm lý tưởng trong sản xuất C militaris.
Bảng 3.7 Đường kính khuẩn lạc và khối lượng sinh khối khô của các tổ hợp lai trong môi trường dịch thể
Tổ hợp lai BT Đường kính khuẩn lạc
(mm) Khối lượng sinh khối khô (g/100ml)
Các số trong cùng một cột có chữ cái theo sau giống nhau không mang ý nghĩa thống kê, trong khi các chữ cái khác nhau cho thấy sự khác biệt thống kê với độ tin cậy α=0,05.
H�nh 3.12 Hình thái của các tổ hợp lai trong môi PD 3.4.3 Đánh giá đặc điểm hình thái quả thể của các tổ hợp lai
Kết quả quan sát hình thái cho thấy các tổ hợp lai thành công có đặc trưng riêng về màu sắc và hình dạng của stroma Đặc biệt, tổ hợp SCm3×SCm5 có chiều dài stroma đạt 69±1,5cm và số lượng 85 stroma/50cm², là tốt nhất trong 5 tổ hợp lai Tổ hợp SCm2×SCm1 cũng có số lượng stroma tương đối cao (72 stroma/50cm²), nhưng chiều dài chỉ đạt 48±2cm, thấp nhất so với các tổ hợp lai và giống bố mẹ Bốn tổ hợp lai còn lại có chiều dài stroma tương đương với giống bố mẹ.
Các tổ hợp lai SCm2×SCm1, SCm3×SCm6 và SCm4×SCm6 của nấm C militaris có màu cam đặc trưng và khả năng tích lũy hàm lượng cordycepin cao Trong khi đó, tổ hợp lai SCm3×SCm5 có quả thể màu cam trắng, không thể hiện đặc điểm ưu việt so với nấm C militaris và khác biệt với hai dòng bố mẹ Cm3 và Cm5 có màu cam tươi.
Trong năm tổ hợp lai thành công gồm SCm2×SCm1, SCm3×SCm6 và SCm4×SCm6, các giống này thể hiện tính nổi trội vượt bậc về số lượng quả thể, màu sắc và các đặc điểm stroma Điều này chứng minh rằng các giống này có những đặc điểm tốt, phù hợp cho việc ứng dụng vào sản xuất thử nghiệm.
Bảng 3.8 Đặc điểm hình thái quả thể của c�c tổ hợp lai nấm C militaris
Màu sắc, đặc điểm quả thể
Chiều dài stroma Độ dày stroma
M�u cam đậm, đầu tròn ph�nh ra ở đỉnh, thân stroma thẳng
(ch y u trắng v�ng) stroma có xu
69 a ±1,5 11,9 a ±0,8 3,1 a ±0,11 85 a ±00 hướng cong h�nh vòng cung, phần đầu ph�nh đ u
M�u cam sáng, stroma cóxu hướng uốn cong không đ u, phần đầu nhọn
M�u cam sáng, giá thể m�u trắng, phần stroma bị uốn cong t giữa stroma trở lên, đầu nhọn
M�u cam đậm, đầu tròn ph�nh ra ở đỉnh, thân stroma có xu hướng uốn cong phần đầu
Các số trong cùng một cột có chữ cái theo sau giống nhau không có ý nghĩa thống kê, trong khi các chữ cái khác nhau cho thấy sự khác biệt thống kê với độ tin cậy α=0,05.
3.4.4 Hàm lượng cordycepin các tổ hợp lai
Kết quả đánh giá hàm lượng cordycepin của các tổ hợp lai cho thấy sự khác biệt rõ rệt so với các dòng bố mẹ Tổ hợp lai (SCm2×SCm1) và (SCm3×SCm8) đạt hàm lượng cordycepin cao gấp đôi so với bố mẹ, với mức 2,15mg/g và 2,46mg/g tương ứng Mặc dù ba tổ hợp lai (SCm3×SCm5, SCm3×SCm6, SCm4×SCm6) có khả năng tích lũy cordycepin thấp hơn bố mẹ từ 10-20%, nhưng tổ hợp (SCm3×SCm6) vẫn cao hơn bố mẹ (Cm3) tới 97%, mặc dù chỉ cao hơn bố (Cm6) 10% So với hàm lượng trung bình, tổ hợp (SCm3×SCm6) vượt mức trung bình của bố mẹ đến 21,6% Nghiên cứu của Naru Kang và cộng sự cũng chỉ ra rằng các dòng mới được tạo ra qua phương pháp lai hữu tính có hàm lượng cordycepin cao hơn bố mẹ trên 30% Tuy nhiên, các dòng có khả năng tích lũy cordycepin cao lại có hình thái quả thể biến dị và số lượng quả thể thấp hơn so với bố mẹ.
H�nh 3.13 H�m lượng cordycepin các tổ hợp lai so với chủng bố mẹ
Do đặc thù của gen giới tính và khả năng tương tác của nấm C militaris, chúng có thể sinh sản vô tính để hình thành stroma mà không cần sự hiện diện của các gen giới tính Mỗi tổ hợp lai thành công sẽ có những đặc điểm khác nhau, đặc biệt là đối với các tổ hợp có hàm lượng cordycepin cao Gen MAT1-1-2 và gen MAT1-2-1 (MAT1-2) thể hiện vượt trội hơn so với gen MAT1-1-1, ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tích lũy cordycepin trong quả thể nấm Đồng thời, các chủng có kiểu hình vượt trội thì gen MAT1-1-1 (MAT1-1) đóng vai trò điều hòa chính cho quá trình lai và phát triển sau lai, khi kết hợp với MAT1-2-1 (MAT1-2) giúp cải thiện số lượng và hình thái stroma so với các chủng khác.
Dựa vào kết quả so sánh hàm lượng cordycepin của các tổ hợp lai với bố mẹ, hai tổ hợp SCm2×SCm1 và SCm3×SCm8 cho thấy hàm lượng cao gấp đôi so với các tổ hợp khác Điều này cho thấy tiềm năng của hai tổ hợp này trong việc nghiên cứu và sản xuất giống cordycepin.
3.4.5 Đặc điểm của tổ hợp lai tiềm năng được tuyển chọn
Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng chủng nấm C militaris được phát triển thông qua hình thức lai hữu tính, kết hợp ngẫu nhiên để tạo ra các chủng mới dựa trên đặc điểm di truyền, hình thái và khả năng tích lũy cordycepin Nghiên cứu đã tuyển chọn hai tổ hợp lai nổi trội, (SCm2×SCm1) và (SCm3×SCm8), dựa vào đặc điểm hình thái, khả năng sinh trưởng và khả năng tích lũy cordycepin của quả thể.
Tổ hợp lai (SCm2×SCm1) có tốc độ sinh trưởng 0,84 cm/ngày và phát triển nhanh trong môi trường phát sinh stroma, với kích thước khuẩn lạc luôn nhỏ hơn 1,5 mm Mặc dù hàm lượng cordycepin của tổ hợp này thấp hơn so với (SCm3×SCm8), nhưng về đặc điểm hình thái, (SCm2×SCm1) lại có màu sắc và dạng đặc trưng của C militaris, cùng với số lượng stroma gấp đôi tổ hợp (SCm3×SCm8) Hàm lượng cordycepin thu được từ hũ nuôi (50 cm2) của tổ hợp (SCm2×SCm1) đạt 8,67 mg/hũ, trong khi tổ hợp (SCm3×SCm8) chỉ đạt 3,11 mg/hũ.
Bảng 3.9 Đặc điểm lựa chọn tổ hợp lai Đặc điểm Tổ hợp lai
Tốc độ sinh trưởng hệ sợi 0,84cm/ngày 0,74cm/ngày Đặc điểm khuẩn lạc Đư ng kính
Khối lượng khô 0,471(g/100ml) Đư ng kính
Màu sắc, đặc điểm quả thể
M�u cam đậm, đầu tròn phình ra ở đỉnh, thân stroma thẳng
M�u cam sáng, giá thể m�u trắng, Phần stroma bị uốn cong t giữa stroma trở lên, đầu nhọn H�m lượng cordycepin 2,15mg/g 2,46mg/g
H�m lượng cordycepin thu được trên/50cm 2 (h nuôi) 8,67mg/hũ 3,11mg/hũ
Nghiên cứu tìm hiểu tổ hợp lai (SCm2×SCm1) cho thấy tổ hợp này có đặc điểm sinh trưởng vượt trội và khả năng tích lũy cordycepin đạt 2,14mg/g, cao hơn 2,04 lần so với giống mẹ và 1,9 lần so với giống bố Hàm lượng cordycepin trên mỗi đơn vị nuôi là 8,67mg/hũ, cao gấp 2,7 lần so với tổ hợp lai (SCm3×SCm8).
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Phương pháp bào tử SSE sử dụng dung dịch HCl 0,3N trong 15 phút đã hiệu quả trong việc loại bỏ vi sinh vật và sợi nấm, tạo ra dịch huyền phù bào tử đồng nhất với mật độ cao 2,4x10^3 ±0,9BT Số lượng bào tử thu được đạt 79,92BT/đĩa petri, và sự nảy mầm bào tử trên môi trường PDA cho kết quả tốt hơn so với môi trường WA.
- Sử dụng chỉ thị phân tửxác định được 3 bào tử mang gen MAT1-2, 5 bào tử mang gen MAT1-1
- Môi trư ng tối ưu để ti n hành lai bào tửđơn ở n m C militaris có chứa 20g gạo lứt, 4g nhộng tằm và 64ml dịch (20g sucrose, 20g peptone, 1g MgSO4.7H2O; 0,5g KH2PO4pha trong 1l nước c t)