BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : LƯ NHẬT HUY MSSV:207111018 Lớp: 08CSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2011 i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan: - Tự thực hiện khóa luận tốt nghiệp. - Không sao chép khóa luận tốt nghiệp dưới bất cứ hình thức nào. - Các số trích dẫn trong khóa luận tốt nghiệp là trung thực. Tôi chịu trách nhiệm hoàn toàn về lời cam ñoan này. ii MỤC LỤC i. Danh mục các từ viết tắt 1 ii. Danh mục các hình 2 iii. Danh mục các bảng, biểu ñồ, sơ ñồ 3 CHƯƠNG MỞ ðẦU 4 1. Tính cấp thiết của ñề tài 5 2. Mục ñích nghiên cứu 5 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 5 4. Phương pháp nghiên cứu 5 5. Các kết quả ñạt ñược của ñề tài 6 Chương 1: TỒNG QUAN BỆNH LAO 7 1.1. Bệnh lao 8 1.1.1. Lịch sử bệnh lao 8 1.1.2. Khái niệm về bệnh lao 8 1.2. Tình hình dịch tễ bệnh lao 8 1.2.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới 8 1.2.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam 9 1.3. Phân loại và ñặc ñiểm vi khuẩn lao 10 1.3.1. Phân loại 10 1.3.2. ðặc ñiểm 11 1.3.3. Bộ gen của vi khuẩn lao 12 1.4. Nguồn lây, ñường xâm nhiễm và diễn biến bệnh 13 1.4.1. Nguồn lây 13 1.4.2. ðường xâm nhiễm 13 1.4.3. Diễn biến nhiễm bệnh 13 Chương 2 : BỆNH LAO KHÁNG THUỐC 15 2.1. Lịch sử bệnh lao kháng thuốc 16 2.2. Tình hình bệnh lao kháng thuốc 16 2.2.1. Trên thế giới 16 iii 2.2.2. Ở Việt Nam 18 2.3. Tình hình nghiên cứu bệnh lao kháng thuốc 19 2.4. Vi khuẩn lao kháng thuốc 20 2.4.1 ðặc ñiểm giúp vi khuẩn lao có khả năng kháng thuốc 20 2.4.1 Vi khuẩn lao ñột biến gen kháng thuốc 21 Chương 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BỆNH LAO 25 3.1. Các phương pháp chuẩn ñoán bệnh lao cổ ñiển 26 3.1.1. Chuẩn ñoán lâm sàng 26 3.1.2. Phương pháp nhuộm soi ñàm 26 3.1.3. Phương pháp nuôi cấy tìm vi khuẩn lao 26 3.1.4. Phương pháp X-quang phổi 26 3.1.5. Phương pháp thử phản ứng Tuberculin 27 3.2. Các phương pháp chuẩn ñoán bệnh lao hiện ñại 27 3.2.1 Phương pháp ELISA 27 3.2.2. Phương pháp PCR 29 3.2.3. Phương pháp Real-time PCR 32 Chương 4: QUY TRÌNH PHÁT HIỆN LAO KHÁNG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR 35 4.1. Giới thiệu quy trình 36 4.2. Vật liệu, thiết bị và hóa chất 36 4.2.1. Vật liệu sinh học 36 4.2.2. Mồi và mẫu dò 36 4.2.3. Thiết bị, dụng cụ 38 4.2.4. Hóa chất 39 4.3. Quy trình phát hiện lao kháng thuốc bằng phương pháp real-time PCR 4.3.1. Mẫu 41 4.3.1.1. Thu mẫu 41 4.3.1.2. Xử lý mẫu 41 4.3.2. Tách chiết DNA 41 iv 4.3.3. Thực hiện Real-time PCR 42 4.3.4. ðọc kết quả 46 4.3.5. Nhận xét quy trình 46 Chương 5: KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Khoá luận tốt nghiệp SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 1 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AFB : Acid-fast Bacillus Bp : Base Pair Ct : Threshod Cycle dATP : Deoxyadenosine Triphosphate DNA : Deoxyribonucleic Acid dNTP : Deoxyribonucleotide Triphosphate dTTP : Deoxyguanine Triphosphate ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EMB : Ethambutol HIV : Human Immunodeficiency Virus HRSE : Isoniazid, rifampicin, streptomycin, ethambutol. INH : Isoniazid Kb : Kilo base KN : Kháng nguyên KT : Kháng thể LAM : Lipoarabinomannan MDR : Multidrugs Resistant MTB : Mycobacterium Tuberculosis NALC : N-acetyl-L-cystein PCR : Polymerase Chain Reaction PCR : Polymerase Chain Reaction RIF : Rifampicin RNA : Ribonucleic Acid RMP : Rifampicin Taq-DNA polymerase: Thermus Aquaticus DNA Polymerase TB : Tuberculosis XDR : Extensively Drug-resistant Khoá luận tốt nghiệp SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 2 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 : Hình ảnh vi khuẩn lao chụp dưới kính hiển vi 11 Hình 1.2 : Hình ảnh Mycobacterium tuberculosis hiển vi ñiện tử quét 11 Hình 1.3 : Bộ gen của Mycobacterium tuberculosis 12 Hình 2.1 : Tình hình bệnh lao kháng thuốc trên thế giới 17 Hình 2.2 : Tình hình bệnh lao ở Việt Nam 18 Hình 2.3 : Hình ảnh vách tế bào vi khuẩn lao 20 Hình 2.4 : ðột biến trong vùng 81 bp codon 507-533 gen rpoB 21 Hình 2.5 : Vùng khả năng bị ñột biến 22 Hình 2.6 : ðột biến trong codon Ser95 22 Hình 3.1 : Hình ảnh lao chụp x-quang 26 Hình 3.2 : Phương pháp ELISA gián tiếp 27 Hình 3.3 : Các bước trong phương pháp Sandwich ELISA 29 Hình 4.1 : Các thiết bị và dụng cụ trong quy trình 38 Hình 4.2 : Primer thiết kế hướng dẫn của CDS 44 Hình 4.3 : Chu trình nhiệt Phát hiện Mycobacterium tuberculosis (MTB) kháng thuốc bằng kỹ thuật real-time PCR 45 Hình 4.4 : ðường biểu diễn khuyếch ñại mẫu thử nghiệm 46 Khoá luận tốt nghiệp SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 3 DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỀU ðỒ, SƠ ðỒ Trang Bảng 1.1 : Thống kê tình hình bệnh lao trên thế giới năm 2009 9 Bảng 4.1 : Các mồi và mẫu dò ñược sử dụng 37 Biểu ñồ 2.1 : Tỷ lệ kháng thuốc trong các ca ñã trải qua ñiều trị và nhiễm mới 18 Biểu ñồ 3.1 : Biểu ñồ ñường biểu diễn khuếch ñại 34 Khoá luận tốt nghiệp SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 4 CHƯƠNG MỞ ðẦU Khoá luận tốt nghiệp SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 5 1. Tính cấp thiết của ñề tài Bệnh lao ñã xuất hiện hàng nghìn năm nay và là căn bệnh khó chữa trị. Hiện nay có khoảng 1/3 dân số trên thế giới ñã nhiễm lao, mỗi năm có khoảng 3 triệu người chết vì lao. Nguyên nhân gây bệnh lao là vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis. ðây là vi khuẩn hình que, dài từ 3-5µm, rộng từ 0,3 - 0,5µm, không có tiêm mao, hai ñầu tròn, tế bào có hạt. Trong những năm 70-80 công tác phòng chống và ñiều trị lao ñã trở nên không hữu hiệu do có sự xuất hiện của các chủng lao kháng thuốc khó chữa trị và có nguy cơ lây lan nhanh và ñã làm cho số người mắc bệnh, tử vong tăng cao. Những người mắc chủng vi khuẩn lao mới này phải ñiều trị trên 2 năm so với ñiều trị 6- 8 tháng như trước kia và chi phí tăng lên gấp 100 lần. Tổ chức Y tế thế giới ước tính, ñến nay ñã có 2700 ca bệnh lao kháng thuốc ở 41 quốc gia. Việc ñiều trị cho bệnh nhân lao kháng thuốc hết sức nghiêm ngặt và cần phải theo dõi liên tục. Vi khuẩn lao có thời gian sinh sản và tăng trưởng chậm nên các phương pháp như: nuôi cấy truyền thống, nhuộm soi ñàm mất nhiều thời gian, chậm trễ trong phát hiện và ñiều trị bệnh lao. Chính vì vậy một phương pháp phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc nhanh chóng và chính xác là ñiều cần thiết nhất. ðề tài thực hiện nhằm tìm hiểu về quy trình phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc bằng một số kỹ thuật sinh học phân tử nhằm cung cấp thêm một số thông tin về vấn ñề này. 2. Mục ñích nghiên cứu Tìm hiểu về quy trình chẩn ñoán bệnh lao kháng thuốc phương pháp sinh học phân tử, giúp phát hiện bệnh nhanh chóng và chính xác ñể ñiều trị kịp thời. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu  Tìm hiểu về quy trình phát hiện lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử.  ðánh giá ñược ñộ nhạy và chính xác của quy trình. 4. Phương pháp nghiên cứu  Thu thập tài liệu.  Tìm hiểu các quy trình phát hiện khuẩn lao.  Xác ñịnh quy trình về mặt lý thuyết.  Dự ñoán ñánh giá quy trình ñề xuất. [...]... a đ tài Tìm hi u thành cơng v quy trình phát hi n lao kháng thu c b ng k thu t sinh h c phân t , đi u quan tr ng đây là vi c tách chi t và tinh s ch DNA c a vi khu n lao đ tránh trư ng h p dương tính gi có th x y ra ðánh giá đư c đ nh y và chính xác c a quy trình SVTH: LƯ NH T HUY Trang 6 Khố lu n t t nghi p CHƯƠNG 1 T NG QUAN V B NH LAO SVTH: LƯ NH T HUY Trang 7 Khố lu n t t nghi p 1.1 B nh lao 1.1.1... c đi m phân t c a vi khu n lao kháng đa thu c Vi t Nam nên khơng có cơ s đ s d ng Hơn n a, các b kít do nư c ngồi s n xu t hi n giá thành khá cao Do đó, vi c nghiên c u và phát tri n kít ch n đốn lao kháng thu c b ng k thu t sinh h c phân t là nhu c u c p thi t T i Vi t Nam tr i qua m t th i gian dài nghiên c u, vào tháng 5 năm 2011, PGS-TS Nguy n Thái Sơn, ch nhi m B mơn Vi sinh Y h c B nh vi n 103... sinh đ c tính c a vi khu n Bên c nh hai y u t này, còn có thành ph n lipoarabinomannan cũng tham gia vào kh năng sinh b nh c a vi khu n lao Nh ng kh năng đ c bi t c a thành t bào vi khu n lao là ch ng m t nư c, kháng acid và ki m Kh năng kháng acid và ki m này r t h u ích trong vi c cơ l p các vi khu n lao t các m u đàm X lý m u đàm b ng acid sulfuric ho c sodium hydroxide s cho phép vi khu n lao phát. .. cũng chính vì v y vi khu n lao ph i là chi m t l l n nh t Vi khu n lao sinh s n ch m, trong đi u ki n bình thư ng, trung bình 20-24 gi sinh s n m t l n và có khi hàng tháng chúng m i sinh s n, th m chí có th n m vùng t n thương r t lâu mà khơng sinh s n hay ho t đ ng khi g p đi u ki n thu n l i thì chúng phát tri n tr l i 1.3.3 B gen c a vi khu n lao B gen c a vi khu n lao đã đư c gi i trình t vào năm... kháng th ♦ Các bư c thư ng đư c th c hi n trong Sandwich ELISA: (1) Ph đĩa b ng kháng th (2) Thêm m u c n xác đ nh kháng ngun, kháng ngun (n u có) s g n v i kháng th (3) Kháng th dùng đ phát hi n đư c thêm vào và k t h p v i kháng ngun (4) Thêm kháng th th c p liên k t v i enzyme Kháng th th c p s g n v i kháng th đ phát hi n (5) Thêm cơ ch t Enzym s làm bi n đ i cơ ch t và phát tín hi u có th phát. .. li u b nh nhân lao đăng ký đi u tr lao t i TP HCM năm 2008, v i t l kháng đa thu c (kháng ít nh t v i Rifampicin và Isoniazid) vào kho ng 3.8% trong s b nh nhân m i và trên 22% b nh nhân lao tái đi u tr 2.3 Tình hình nghiên c u b nh lao kháng thu c ► Nghiên c u thành cơng b kit đa m i phát hi n lao kháng thu c: [28] Trên th gi i đã có m t s kít thương ph m ch n đốn nhanh vi khu n lao kháng thu c do... phenic 5% Vi khu n phát tri n t t nh t (5,5) ho c pH t 6,2-7,2 và có th phát tri n t t nh t pH acid pH ki m (8,0) Trong phòng thí nghi m, có th b o qu n vi khu n lao trong nhi u năm Trong đàm c a b nh nhân lao đ t trong phòng t i, m sau 3 tháng vi khu n lao v n t n t i và gi đư c đ c l c SVTH: LƯ NH T HUY Trang 11 Khố lu n t t nghi p Vi khu n lao là lo i vi khu n hi u khí, khi phát tri n vi khu n c... i và các v t, vi khu n lao bao g m: - Vi khu n lao ngư i - Mycobacterium tuberculosis homonis - Vi khu n lao bò - Mycobacterium bovis - Vi khu n lao chim - Mycobacterium avium - Vi khu n lao chu t - Mycobacterium microti Phân lo i d a trên đo n gen IS6110 chi u dài 1361 bp n m trong c u trúc DNA c a vi khu n thì ch có 4 lồi Mycobacteria là M.tuberculosis, M.bovis, M microti, M.africanum (g i chung... nghi p Chương 2 B NH LAO KHÁNG THU C SVTH: LƯ NH T HUY Trang 15 Khố lu n t t nghi p 2.1 L ch s b nh lao kháng thu c B nh lao kháng thu c l n đ u tiên đư c xác đ nh trong năm 2006 B nh đư c phát hi n 57 qu c qia và gây khó khăn đi u tr B nh lao kháng thu c ph bi n Liên Xơ cũ, Trung Qu c và n ð và đang tăng lên ðơng Âu, châu Phi MDR-TB là vi t t t c a nhi u b nh lao kháng thu c, nó kháng v i hai trong... i có các u lao Khi đã xâm nh p thành cơng vào dòng máu, chúng lan t a kh p cơ th , t o vơ s v i bi u hi n là c lao màu tr ng nhi m, mơ Khi vi khu n lao xâm nh p vào cơ th , chúng có th s ng ti m n, khi s c đ kháng c a cơ th suy y u thì chúng m i phát tri n và t n cơng gây b nh Vi c chuy n t nhi m lao sang b nh lao ph thu c vào ba y u t chính: s lư ng và đ c tính c a vi khu n lao, s c đ kháng c a cơ