i M CL C Trang M C L C i L IM U .1 PH N 1: T NG QUAN .3 1.1 T NG QUAN V CHITIN 1.1.1 C u trúc tính ch t c a chitin .3 1.1.2 ng d ng c a chitin – chitosan .4 1.2 T NG QUAN V PH LI U TÔM 1.2.1 T l thu h i ph li u tôm 1.2.2 C u t o thành ph n sinh hóa c a v tôm .7 1.2.3.Thành ph n sinh hố c a v tơm .8 1.3 CÔNG NGH S N XU T CHITIN 1.3.1 Gi i thi u công ngh s n xu t chitin .9 1.3.2 Tình hình nghiên c u s n xu t chitin th gi i Vi t Nam .11 1.3.2.1 S n xu t chitin, chitosan theo phương pháp hóa h c 12 1.3.2.2 S n xu t chitin, chitosan theo phương pháp hóa h c c i ti n 15 1.3.2.3 S n xu t chitin, chitosan theo phương pháp s d ng enzyme 21 1.4 T ng quan v enzyme protease 23 1.4.1 Phân lo i protease 23 1.4.2 Ngu n thu nh n enzyme protease 24 1.4.3 M t s lo i protese thư ng dùng 25 PH N 2: NGUYÊN V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U .26 2.1 NGUYÊN V T LI U NGHIÊN C U 26 2.1.1 Nguyên li u v tôm .26 2.1.2 Enzyme Protease .26 2.1.3 Hóa ch t 26 2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 26 2.2.1.Phương pháp thu nh n m u 26 ii 2.2.2 B trí thí nghi m .26 2.2.2.1 Sơ b trí thí nghi m t ng quát 26 2.2.2.2 B trí thí nghi m ánh giá nh hư ng c a x lý nhi t nguyên li u trư c th y phân 28 2.2.2.3 Thí nghi m xác nh ch kh protein t i ưu b ng enzyme Alcalase 28 2.2.2.4 Thí nghi m xác nh ch kh protein t i ưu b ng enzyme Pepsin 29 2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HĨA H C 32 2.3.1 Xác nh hàm lư ng m b ng phương pháp s y nhi t 105oC theo TCVN 3700-1990 32 2.3.2 Xác nh hàm lư ng khoáng b ng phương pháp nung 600oC .32 2.3.3 Xác nh hàm lư ng protein theo phương pháp c a Hein c ng s năm 2004 32 2.3.4 Xác nh hi u qu kh protein 33 2.3.5 Phương pháp x lý s li u: 33 PH N 3: k T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 34 3.1 K t qu nghiên c u nh hư ng c a x lý nhi t nguyên li u trư c th y phân 34 3.2.K t qu nghiên c u công o n kh protein b ng enzyme Alcalase 35 3.3 K t qu nghiên c u nh hư ng c a nhân t n công o n kh protein b ng enzyme Pepsin 40 3.4.K t qu nghiên c u t i ưu công o n kh protein b ng enzyme Pepsin HCl 44 K T LU N VÀ M ts XU T Ý KI n 51 xu t c n ti p t c nghiên c u: 51 TÀI LI U THAM KH O .52 PH L C 54 iii DANH M C HÌNH Hình 1.1 C u t o c a Chitin Hình 1.2 Quy trình c a Stevens (2002) H c Vi n Công Ngh Châu Á 12 Hình 1.3 Quy trình s n xu t chitosan t v tôm hùm c a Hackman…………… Hình 1.4 Quy trình nhi t c a Yamashaki Nakamichi (Nh t B n) 14 Hình 1.5 Quy trình s n xu t c a Pháp .15 Hình 1.6 Quy trình c a Minh Ph ng, trư ng Hình 1.7 Quy trình s n xu t Chitosan i h c Th y S n .16 Trung tâm cao phân t thu c Vi n khoa h c Vi t Nam 17 Hình 1.8 Quy trình s n xu t Chitosan t v tơm Sú b ng phương pháp hóa h c v i m t công o n x lý ki m .18 Hình 1.9 Quy trình c a Trung tâm Ch bi n i h c Th y s n 20 Hình 1.10 Quy trình s n xu t chitin c a Holanda Netto (2006) 21 Hình 1.11 Quy trình s d ng Enzyme papain s n xu t chitosan .22 Hình 2.1 Sơ b trí thí nghi m t ng quát 27 Hình 2.2 Sơ b trí thí nghi m ánh giá nh hư ng c a nhi t lên nguyên li u trư c th y phân 28 Hình 3.1: K t qu nghiên c u nh hư ng c a x lý nhi t nguyên li u trư c th y phân 34 Hình 3.2.a Mơ hình bi u di n phân ph i chu n .48 Hình 3.2.b Mơ hình bi u di n phân ph i chu n……… 49 Hình 3.3 th 3D bi u di n nh hư ng c a nhi t th i gian t i hi u qu kh protein .55 Hình 3.4: th bi u di n m c nh hư ng c a y u t 42 Hình 3.5: th bi u di n s tương tác gi a nhi t n ng nh hư ng n hi u qu kh protein 43 Hình 3.6: Mơ hình bi u di n phân ph i chu n 48 Hình 3.7: th 3D bi u di n nh hư ng c a nhi t n ng t i hi u qu kh protein 50 iv DANH M C B NG B ng 1.1 M t s ch tiêu ch t lư ng c a chitosan t v tôm sú theo phương pháp x lý ki m m t giai o n 19 B ng 2.1: Ma tr n thí nghi m t i ưu trình kh protein l n v i Alcalase 29 B ng 2.2 Ma tr n thí nghi m nghiên c u nhân t nh hư ng n trình th y phân Pepsin .30 B ng 2.3: Ma tr n thí nghi m d ki n 32 B ng 3.1 K t qu hàm lư ng protein l i ch kh protein b ng enzyme Alcalase .35 B ng 3.2 L a ch n hàm cho mơ hình 36 B ng 3.3 K t qu phân tích ANOVA 36 B ng 3.4 K t qu phân tích ch s th ng kê 37 B ng 3.5: K t qu nghiên c u nh hư ng c a nhân t n công o n kh protein b ng enzyme Pepsin 41 B ng 3.6: K t qu ánh giá m c nh hư ng c a y u t 42 B ng 3.7: K t qu hàm lư ng protein l i ch kh protein b ng enzyme Pepsin - HCl 44 B ng 3.8 L a ch n hàm cho mơ hình 45 B ng 3.9: K t qu phân tích Anova 45 B ng 3.10: K t qu phân tích ch s th ng kê mơ hình 2FI .46 L IM Tính c p thi t c a U tài Giáp xác ngu n nguyên li u th y s n d i chi m 1/3 t ng s n lư ng nguyên li u th y s n Vi t Nam Trong công nghi p ch bi n th y s n xu t kh u, t l c u m t hàng ông l nh t giáp xác chi m t 70 – 80% công su t ch bi n Hàng năm nhà máy ch bi n ã th i b m t lư ng ph li u giáp xác l n kho ng 70.000 t n/năm [1] Ngu n ph li u nguyên li u quan tr ng cho công nghi p s n xu t chitin, chitosan, glucosamine s n ph m khác Do v y vi c nghiên c u phát tri n s n xu t s n ph m t v tôm r t c n thi t nh m nâng cao giá tr s d ng ph li u làm s ch môi trư ng Theo i u tra ban u cơng ngh s n xu t chitin – chitosan nư c hi n ch y u theo phương pháp hóa h c v i vi c s d ng hóa ch t có n ng cao, th i gian x lý dài, không nh ng nh hư ng n ch t lư ng s n ph m, mà cịn gây nhi m mơi trư ng, khó khăn cho q trình x lý nư c th i, ng th i t n chi phí cao Vì v y, xu th m i hi n ng d ng công ngh sinh h c s n xu t chitin, thay th hóa ch t b ng enzyme gi m t i a lư ng hố ch t s d ng, gi m nhi m môi trư ng nâng cao ch t lư ng s n ph m Vi t Nam nh ng năm qua ã có r t nhi u tài nghiên c u s d ng enzyme protease vào cơng o n kh protein c a quy trình s n xu t chitin-chitosan Tuy nhiên, k t qu nghiên c u cho th y s d ng ơn l m t lo i enzyme protease hi u qu kh protein không cao, lư ng enzyme s d ng nhi u v n ph i dùng k t h p v i hóa ch t N u k t h p hai enzyme protease kh protein có th s mang l i tác d ng tích c c Xu t phát t th c t trên, c s Khoa Ch bi n -Trư ng Th Hồi Dương, ng ý c a B mơn Cơng ngh Ch bi n- i h c Nha Trang, dư i s hư ng d n c a cô Th c sĩ Ngơ tài: “Nghiên c u t i ưu hóa q trình s n xu t Chitin t v tơm th chân tr ng v i s k t h p c a Alkalase – Pepsin HCl” ã c th c hi n 2 M c ích c a tài xu t quy trình s n xu t chitin t v tôm th chân tr ng (Penaeus vannamei) v i s k t h p c a enzyme Alkalnase, enzyme Pepsin HCl Tính khoa h c th c ti n c a Thành cơng c a ích t n d ng tri t tài s tài c áp d ng t i c s s n xu t chitin v i m c ngu n protein t ph li u tôm, h n ch s d ng hóa ch t nh m gi m ô nhi m môi trư ng, t o s n ph m có ch t lư ng cao ng d ng r ng rãi… tài ngu n tài li u h u ích ph c v cho công tác nghiên c u chuyên sâu v lĩnh v c N i dung c a tài - T ng quan v công ngh s n xu t chitin – chitosan - Nghiên c u nh hư ng c a vi c x lý nhi t sơ b nguyên li u n kh kh protein c a Enzyme Alcalase - Nghiên c u quy trình s n xu t s n xu t chitin v i s k t h p c a Alcalase – Pepsin HCl - xu t quy trình - Sơ b ánh giá ch t lư ng s n ph m thu c PH N 1: T NG QUAN 1.1 T NG QUAN V CHITIN 1.1.1 C u trúc tính ch t c a chitin a S t n t i c a Chitin t nhiên Chitin m t polysacharit t n t i t nhiên v i s n lư ng r t l n ( th hai sau xellulose) Trong t nhiên chitin t n t i c Trong s ng ng v t th c v t ng v t, chitin m t thành ph n c u trúc quan tr ng c a v m t ng v t không xương s ng như: côn trùng, nhuy n th , giáp xác giun tròn Trong ng v t b c cao monome c a chitin m t thành ph n ch y u mơ da giúp cho s tái t o g n li n v t thương da Trong th c v t chitin có thành t bào n m h zygenmyctes, sinh kh i n m m c, m t s lo i t o [2] Chitin polysacharit có m khơng c, có kh i lư ng phân t l n C u trúc c a chitin t p h p monosacharit (N-acetyl- β-D-glucosamine) liên k t v i b i c u n i glucozit hình thành m t m ng lư i s i có t ch c Hơn n a chitin t n t i r t hi m tr ng thái t h u luôn n i b i c u n i d ng tr (coralente) v i protein, CaCO3 h p ch t h u khác.[3] Trong loài th y s n chi m cao dao c bi t v tôm, cua, gh , hàm lư ng chitin ng t 14 – 35% so v i tr ng lư ng khơ Vì v y, tơm, cua, gh ngu n nguyên li u s n xu t chitin – chitosan.[3] b C u trúc c a chitin Chitin m t polysaccharide m ch th ng, có c u trúc n tính g m ơn v N-acetyl-glucosamine n i v i nh c u β-1,4glucoside Công th c phân t : (C8H13O5N)n Phân t lư ng : M = (203,19)n Trong ó n ph thu c vào ngu n g c nguyên li u: i v i tơm hùm : n = 700÷800 i v i cua : n = 500÷600 i v i tơm th : n = 400÷500 Cơng th c c u t o c a chitin c trình bày hình 1.1 Hình 1.1 C u t o c a Chitin c Tính ch t c a chitin Chitin có màu tr ng, khơng tan nư c, ki m, acid lỗng dung mơi h u khác ete, rư u Chitin hòa tan c dung d ch m c, nóng c a mu i thyoxyanat liti (LiSCN) mu i thyoxyanat canxi (Ca(SCN)2) t o thành dung d ch keo, tan c h dimetylacetamid - LiCl 8%[4], tan hexafluoro –isopropul alcohol (CF3CHOHCF3) hexafluoracetone sesquihydrate (CF3COCF3.H2O)[15] Chitin n nh v i ch t oxy hóa KMnO4, nư c javen, NaClO,…ngư i ta l i d ng tính ch t kh màu cho chitin [3] Chitin có kh h p th tia h ng ngo i bư c sóng 884÷890 m Chitin m t polysaccharide ngu n g c t nhiên, có ho t tính sinh h c cao, có tính hịa h p sinh h c t phân h y da Chitin b enzyme lysozyme, m t lo i enzyme ch có th ngư i, phân gi i thành mono N-acetyl-D-glucosamine Khi un nóng chitin dung d ch NaOH c (40-50%), nhi t cao chitin s b m t g c acetyl t o thành chitosan Khi un nóng chitin acid HCl c chitin s b th y phân t o thành Glucosamine acid acetic 1.1.2 ng d ng c a chitin – chitosan a Trong y h c, m ph m[3][6] Dùng làm ph gia k ngh bào ch dư c ph m: Tá dư c sinh h c n, tá dư c chính, viên nang m m, nang c ng…làm ch t mang g n thu c, t o thu c polymer tác d ng kéo dài, làm ho t ch t ch a b nh như: Thu c i u tr li n v t thương, v t ph ng, v t m vô trùng, thu c b dư ng th : H lipid cholesterol máu, thu c ch a b nh au d dày, ti u ng, xưng kh p, viêm kh p, ch ng ông t máu, kháng n m, kháng khu n, i u tr suy gi m mi n d ch, có kh h n ch s phát tri n c a t bào u, t bào ung thư ch ng HIV Dùng làm v t li u y sinh: Da nhân t o, màng sinh h c, ch t n n cho da nhân t o, ch khâu ph u thu t, mô c y ghép… Trong m ph m chitosan c b sung vào kem ch ng khô da, kem l t m t tăng bám dính, tăng hịa h p sinh h c v i da, ch ng tia c c tím… b Trong cơng nghi p th c ph m[7] Chitosan c xem m t ph gia t o axit c a trái c ng, t o keo, phân l p kh u ng, tăng cư ng mùi v t nhiên ho c t o màng bao gói th c ph m, hoa qu , rau tươi c Trong nông nghi p[5], [3] Dùng b o qu n h t gi ng, tăng cư ng kh n y m m c a h t, tác nhân ch ng n m, ch ng vi khu n gây b nh cho mơi trư ng xung quanh Ngồi ra, chitosan cịn dùng làm ch t kích thích sinh trư ng tr ng, thu c ch ng b nh d o ôn, khô v n cho lúa ng d ng sinh h c Làm giá th ho t hóa cho công ngh c nh enzyme t bào vi sinh v t, làm ch t mang s d ng s c ký ch n l c, màng l c sinh h c, t ng h p polymer sinh h c e ng d ng ngành công nghi p khác • Trong cơng nghi p d t Chitosan c dùng h v i: c nh hình in hoa, ưu i m có th thay th c h tinh b t b ng chitosan làm cho v i hoa, ti, s i b n ch u c c xát, b m t p, b n ki m Làm v i ch u nư c, khơng b t l a: Hịa tan chitosan dung d ch acid acetic loãng v i axetat nhôm axit stearic thu c h n h p H n h p em sơn lên v i, khô t o thành màng m ng, ch c, b n, ch u nư c không b t l a V i c s d ng s n xu t b o h lao ng Làm s i Chitin: Ngâm chitosan dung d ch Na2SO4 bão hòa r i em kéo s i, r a nư c nhi t cao thu c gi ng s i gai em s i tr n v i s i cellulose t l 30% thu c s i Chitin-cellulose Kh b t màu thu c nhu m tăng ta tăng h s i chitin • Trong cơng nghi p gi y Chitosan có tác d ng làm tăng b n c a gi y, ch c n thêm tr ng lư ng b ng 1% tr ng lư ng c a gi y s làm tăng g p tăng b n c a gi y m t, nét in Các lo i gi y dùng làm gi y v sinh, gi y in, túi gi y • Trong ngành phim nh Phim chitosan có nh t r t cao, không tan nư c, acid c ng c c i thi n b ng cách t ng h p úc chitosan, r i x lý phim b ng dung d ch acid • ng d ng m ph m Chitosan chitosan c c s d ng s n xu t kem ch ng khô da, b n ch t nh d dàng bi u bì da b i nh ng nhóm NH4+ thư ng c nhà khoa h c g n v i nh ng ch t gi nư c ho c nh ng ch t l c tia c c tím Vì v y chitosan g ch n i gi a ho t ch t c a kem da 1.2 T NG QUAN V PH LI U TÔM 1.2.1 T l thu h i ph li u tôm Vi t Nam ngu n nguyên li u tôm r t d i dào, c thu t ngu n ánh b t t nhiên nuôi tr ng c bi t, nuôi tôm ã phát tri n m nh nh ng năm g n ây tr thành ngành kinh t mũi nh n Di n tích ni tơm ã tăng t 250.000 năm 2000 lên n 478.000 năm 2001 540.000 năm 2003, năm 2012 di n tích ni tơm c a nư c ta x p x kho ng 640.000 Năm 2002, giá tr xu t kh u thu s n t t USD, ó xu t kh u tơm ông l nh x p x 0.95 t USD, chi m 47% t ng kim ng ch Năm 2004, xu t 48 Res iduals vs Block Desig n-Expert® Software pro In rn llyS d n e R s u ls te a tu e tiz d e id a 3.00 Color points by value of pro: 24.2174 46.9281 69.6388 1.50 0.00 -1.50 -3.00 Bloc k Hình 3.6c Hình 3.6 Mơ hình bi u di n phân ph i chu n th bi u di n hình 3.7 cho phép kh ng nh gi nh s li u thu c tuân theo phân ph i chu n ó k t qu thu c v hàm h i qui tin c y L a ch n giá tr t i ưu: K t qu phân tích DX 8.01 phiên b n dùng th cho phép l a ch n ch t i ưu t hi u qu cao nh t ng v i t ng i u ki n V i i u ki n 1: Hi u qu kh protein cao nh t (maximize), y u t nhi t , th i gian, n ng enzyme nh nh t (minimize) ch x lý t i ưu c g i ý là: STT Th i gian 6.22 6.235 6.198 6.182 N ng Nhi t 0.116 0.116 0.117 0.116 28 28 28 28 Hi u qu kh protein 33.922 33.953 33.958 33.853 M c c 0.607 0.607 0.607 0.607 t 49 V i i u ki n 2: Hi u qu kh protein cao nh t, y u t nhi t gian, n ng STT enzyme l n nh t ch Th i gian 10 10 9.994 N ng Nhi t 0.25 0.249 0.25 40 40 39.95 x lý t i ưu c g i ý sau: Hi u qu kh protein 65.96 65.855 65.891 M c c 0.979 0.978 0.977 i u ki n 3: Hi u qu kh protein cao nh t, y u t nhi t th i gian th y phân n ng , th i t th y phân, enzyme n m m t kho ng ch x lý t i ưu c g i ý là: STT Th i gian 10 9.968 10 9.972 N ng Nhi t 0.25 0.25 0.25 0.25 40 40 39.924 39.938 Hi u qu kh protein tri t phân tích ch n ch n ng enzyme 0.25 M c c 0.919 0.917 0.917 0.916 x lý t i ưu phù h p nhi t 40, th i gian 10, này, m c t 97.9% t i ưu th y phân protein l n v tôm th chân tr ng b ng enzyme Pepsin là: Nhi t 40 0C t nh t m c ích c a q trình th y phân T t hi u qu kh protein 65.960% t i ch tho mãn i u ki n t i ưu K t lu n, ch Hi u qu kh protein 65.96 65.879 65.877 65.823 Th i gian 10h N ng 0.25% 50 Design-Expert® Software pro X1 = A: thoi gian X2 = B: nong Actual Factor C: nhiet = 40.00 69.6388 59.5927 pro 49.5466 39.5005 29.4543 0.25 0.2 10 0.15 B: nong 0.05 Hình 3.7 0.1 A: thoi gian th 3D bi u di n nh hư ng c a nhi t n ng t i hi u qu kh protein Chitin s n xu t theo quy trình s c có màu tr ng, xu t có m t s ch tiêu ch t lư ng như: màu m l i kho ng 10%, Hàm lư ng protein l i: 8%, Hàm lư ng khống cịn l i: < 1% 51 K T LU N VÀ XU T Ý KI n K t lu n ã nghiên c u c qui trính s n xu t chitin có s k t h p c a Alcalase, Pepsin HCl v i thông s sau: - i u ki n kh protein b ng enzyme Alcalase: N ng enzyme 0,3%, nhi t 57.473oC,th i gian 9.264 gi ,t l nguyên li u/nư c 1:4 - i u ki n kh protein b ng enzyme Pepsin: N ng NaOH 0,25%, nhi t 40oC,th i gian 10 gi - Chitin s n xu t theo qui trình xu t có s ch tiêu ch t lư ng: Màu s c: màu tr ng Tr ng thái: m m m i m: 10% Hi u su t kh protein: 90-92% Th i gian th c hi n: 12h Hàm lư ng khống cịn l i: